淡紫灰链霉菌S3-5田间防效初探及生防制剂助剂的筛选

尾孢菌(Cercospora zeae-maydis)是引起玉米灰斑病的病原真菌,淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)S3-5为课题组前期研究筛选出的尾孢菌拮抗菌株。为探究S3-5在田间对玉米灰斑病的防治效果,并研制有效防控玉米灰斑病的生防制剂,该研究进行田间试验,并对S3-5稳定剂及紫外保护剂进行筛选。结果表明,初步应用S3-5孢子悬液于田间栽培品种正红311上,发现其对玉米灰斑病具有一定的防治效果,喷施两次的效果更显著(P<0.05);最佳稳定剂为2.5%甲基纤维素,最佳紫外保护剂为0.3%异维C钠。可为S3-5制剂的后续研究奠定基础。

刺孢吸水链霉菌与淡紫灰链霉菌原生质体制备条件研究

通过对甘氨酸浓度、酶解温度、酶浓度、酶解时间等影响因素考察,及正交试验优化,确定了刺孢吸水链霉菌和淡紫灰链霉菌原生质体制备的最佳条件.实验结果表明,刺孢吸水链霉菌最佳原生质体制备条件是:甘氨酸浓度为0.5%,酶解温度28℃,溶菌酶浓度为3×10-3g/mL,酶作用时间60 min;淡紫灰链霉菌:甘氨酸浓度为1.0%,酶解温度32℃,溶菌酶浓度4×10-3g/mL,酶作用时间60 min.有效的原生质体保存条件是:-20℃,在5 d内,原生质体再生率在15%以上.

淡紫灰链霉菌H2产α-葡萄糖苷酶抑制剂发酵条件优化

采用响应面的方法对淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)H2产α-葡萄糖苷酶抑制剂的发酵条件进行优化,经过单因素试验和Plackett-Burman试验设计筛选出对产α-葡萄糖苷酶抑制剂影响较为显著的3个因素:初始pH、接种量、发酵时间,利用最陡爬坡试验确定Box-Behnken中心组合试验设计的中心点,然后进行中心组合试验对发酵条件进行优化,得出最佳发酵条件为初始pH值为6.5、发酵时间4 d、接种量9%,经过3次试验验证,该发酵液抑制率稳定在68.79%,与预测值相接近。

淡紫灰链霉菌X33发酵产物的毒性试验评价

利用小白鼠进行急性和亚急性经口毒性试验,研究抑制柑橘绿霉病菌的淡紫灰链霉菌菌株X33无菌发酵液对小鼠的毒性,并测定小白鼠血常规指标,观测小鼠主要脏器。结果表明,菌株X33无菌发酵液的小鼠LD50>10.0 g/kg,受试物属于无毒级物质;小白鼠经28 d喂养,各试验组小白鼠生长发育良好,体质量、食物利用率及血常规与对照组之间无显著差异;对小白鼠肝、肾、脾、胃、肠、十二指肠、睾丸(或卵巢)等主要脏器进行组织解剖,均未见病变。淡紫灰链霉菌菌株X33无菌发酵液对小鼠安全、无毒。

淡紫灰链霉菌X33水溶性抗真菌产物高产菌株的诱变选育

以淡紫灰链霉菌X33(Streptomyces lavendulae X33)野生菌为出发菌株,柑橘致病菌指状青霉(Penicillium digitatum)为指示菌,诱变选育对柑橘采后致病青霉具有显著抑制作用的水溶性抗真菌产物的高产菌株。经自然分离选育后,采用紫外线、亚硝基胍、五溴尿嘧啶与二氨基嘌呤混合三轮系列诱变处理,筛选获得一株性能稳定的高产诱变菌株BP39,其相对抑菌效价较出发菌株X33提高了279%。表明传统的物理、化学诱变选育方法,可大幅提高野生菌株活性产物产量,是一种简便、快速的育种手段。

淡紫灰链霉菌X33发酵提取物对采后柑橘绿霉病菌的抑制作用

为了揭示淡紫灰链霉菌X33发酵提取物(SLFE)对柑橘采后绿霉病菌——指状青霉Pd165的抑制作用,以SLFE处理的菌株Pd165为研究对象,测定病原菌菌株Pd165细胞完整性及相关细胞内容物的变化。采用扫描电镜、拉曼光谱、荧光光谱和荧光定量PCR,探究SLFE处理对菌丝形态、细胞应答和DNA的影响。结果表明:1.2 mg/mL SLFE处理导致菌株Pd165菌丝干瘪、扭曲折叠,分生孢子梗与分生孢子畸形,且产孢抑制率高达94.86%。SLFE诱导菌丝细胞完整性受损严重,导致胞外上清液中代表脂肪酸、核酸和蛋白质的特征峰增强(1 129,1 330,1 565 cm-1),胞内糖类、可溶性蛋白和丙酮酸含量下降。SLFE处理破坏了菌株Pd165基因组DNA构象和结构,上调了与细胞完整性、产孢、代谢和氧化应激相关的基因表达水平(cej60377.1、oko99898.1、crl18986.1和kzn90160.1)。结论:SLFE处理导致菌株Pd165细胞完整性受损,扰乱细胞内原有的稳态,并严重破坏DNA构象及菌丝体形态。

拮抗淡紫灰链霉菌xjy的发酵条件优化

采用单因素和正交试验相结合，对笔者分离保存的生防放线菌淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendu-lae）xjy菌株的液体发酵培养基和培养条件进行了优化。单因子试验结果表明，碳源葡萄糖、麸皮和空白处理三者之间无显著差异；氮源为豆粕、鱼粉和黄豆粉时发酵效价明显高于空白处理和其他氮源；添加0.04%的磷酸氢二钾和0.01%的硫酸亚铁可促进发酵液活性物质的产生。正交试验得出较适合于工业生产的摇瓶培养基配方为：麸皮2%、豆粕1%、氯化钠1.5%、碳酸钙0.6%、硫酸铵1%、磷酸氢二钾0.04%、硫酸亚铁0.001%。优化后的发酵液效价提高了36%。较为适宜的发酵非营养条件为：最适温度为20-35℃、摇床转速为150 r/min、初始pH值为5.5-8.0、装料量为50 mL/250 mL。这些结果为该菌株今后的应用、抗生素的分离提纯和产业化提供了依据。

淡紫灰链霉菌gCLA4坏死诱导蛋白基因的克隆表达及功能

【背景】淡紫灰链霉菌(Streptomyceslavendulae)gCLA4是从黄瓜中分离到的一株放线菌,研究表明该菌对多种植物病原菌均有很好的拮抗作用,具有潜在的生防价值。【目的】深入研究Streptomyces lavendulae gCLA4中坏死诱导蛋白(necrosis-inducing protein)4955的功能,明确其提高植物抗性的作用机制。【方法】对坏死诱导蛋白4955基因进行克隆,于Escherichia coli BL21(DE3)中表达,并以烟草为材料检测该蛋白的活性和稳定性;使用Protparam、PredictProtein、NCBI CDD、SWISS-MODEL分析蛋白的基本性质和三维结构;检测该蛋白对烟草防御反应相关酶活(CAT、SOD、POD、PAL)和防御相关基因(NPR1、PR1-b、PAL、LOX、PR1-a)表达量的影响。【结果】蛋白4955的耐受温度达40℃,耐受pH 6.0-10.0。该蛋白分子量为24491.12 Da,由225个氨基酸组成,其等电点为5.96,经氨基酸序列比对含保守NPP1结构域。蛋白4955处理烟草2 d时,烟草CAT、SOD、PAL酶活增加,POD酶活无显著变化。该蛋白处理烟草第1、3、5天时,基因PR1-b、LOX表达量提高;在第4天时,基因PAL的表达量提高。【结论】Streptomyces lavendulae gCLA4中的坏死诱导蛋白4955确实能诱导烟草中的植物防御反应。

一株拮抗水稻白叶枯病菌的淡紫灰链霉菌的筛选鉴定及其生防效果研究

为发现绿色安全的水稻白叶枯病天然生物防治微生物,本研究从植物根际土壤中分离获得165株放线菌。利用共培养法和牛津杯法,筛选获得了5株拮抗水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)的放线菌,其中拮抗能力最强的是Sl-10菌株,发酵液抑菌圈直径为62.1 mm±1.5 mm。根据形态特征、生理生化实验、16S rDNA序列和系统发育分析,鉴定Sl-10菌株为淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)。Sl-10菌株发酵液对大豆斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.glycinea)、烟草野火病菌(P.syringae pv.tabaci)、油菜黑腐病菌(X.campestris pv.campestris)、大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)、水稻条斑病菌(X.oryzae pv.oryzicola)、烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)和番茄叶斑病菌(P.syringae pv.tomato)7种植物病原细菌均有拮抗作用。Sl-10菌株发酵液具有较好的耐光、耐酸碱和热稳定性。SDS-PAGE电泳结果显示,Sl-10菌株可抑制Xoo的蛋白质合成。4个品种水稻(甬优15、湘两优900、嘉丰2号和甬优1540)喷施Sl-10菌株发酵液,水稻白叶枯病的病斑抑制率达到82.27%~91.78%。研究结果显示,淡紫灰链霉菌Sl-10菌株具有较好的水稻白叶枯病生物防治潜能。

玉米灰斑病拮抗链霉菌S3-5的筛选及鉴定

为筛选对灰斑病有高效拮抗作用的微生物,采集四川双流、平武以及云南文山州三地玉米种植田土壤,利用平板对峙实验筛选到对灰斑病病原菌玉蜀黍尾孢菌（Cercospora zeae-maydis Tehon＆Daniels）菌丝生长有抑制作用的6株细菌和2株放线菌.放线菌S3-5的抑菌效果最好,其抑菌能力是可稳定遗传的性状;结合菌株形态学、生理生化特征以及16S rDNA序列同源性分析将S3-5鉴定为淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendulae）.S3-5对玉蜀黍平脐蠕孢、立枯丝核菌、茄链格孢、核盘菌、胶孢炭疽菌、链格孢菌等常见植物病原真菌均有较好抑制作用,其生长的NaCl浓度耐受度为5%,最适生长温度为25~30℃,显示S3-5具有应用于田间抑制灰斑病发生的潜能.

链霉菌ZG0429的分类鉴定与链霉亲和素的分离纯化研究

从土壤中筛选得到1株高产链霉亲和素的放线菌ZG0429,根据形态观察、培养特征、生理生化鉴定以及16S rRNA序列分析,初步判定该菌株为链霉菌属中的淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)。经发酵,ZG0429的链霉亲和素产量可达201.0mg/L。进一步采用硫铵沉淀和凝胶过滤层析纯化,链霉亲和素的回收率为76.87%,纯度可以达到97.03%。该方法简单易行,成本低廉,可得到高产量、高纯度、高活性的目的蛋白,为链霉亲和素发酵产品的大规模纯化提供了依据。

飞龙斩血内一株链霉菌属的分离鉴定及抑菌活性检测

采用严格的表面消毒程序以及在培养基中添加抑菌剂的方法从中药植物飞龙斩血中分离得到一株内生放线菌F-3-003,菌株的发酵产物通过纸片扩散法体外检测具有一定的抑菌活性.菌落形态特征和23S rDNA序列分析表明,菌株F-3-003属于链霉菌属,通过16S rDNA序列分析显示菌株F-3-003与多株淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)的序列同源性均高于99%,因此,将菌株F-3-003命名为淡紫灰链霉菌F-3-003,基因登录号为KF751667,本研究为飞龙斩血内生菌资源的开发利用提供了基础.

葡萄白腐病拮抗链霉菌G4的筛选、鉴定及发酵条件的优化

从长春市葡萄园采集的9份土样中分离出放线菌菌株70株,采用平板对峙法初筛到了对葡萄白腐病菌(Coplodiella diplodiella)有较好拮抗作用的放线菌菌株7株,采用琼脂扩散法复筛出拮抗作用最好的菌株G4。对G4菌株的发酵液进行了抗菌谱测定,结果表明发酵液对番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)等其他8种植物病原真菌都有拮抗作用,对葡萄白腐病菌的拮抗作用最好,抑菌圈直径达26.5mm。通过对菌株G4的形态特征、培养特征、生理生化反应和16S rDNA鉴定该菌株为淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)。通过发酵条件优化,确定了菌株G4的最佳发酵条件:玉米粉60 g/L,葡萄糖30 g/L,大豆粉60 g/L,硝酸钾5 g/L,磷酸二氢钾1 g/L,碳酸钙3 g/L,氯化钠1 g/L,pH为自然,种龄22 h,装瓶量40mL/250mL,接种量4%,发酵温度28℃,转速200 r/min,发酵时间48 h。

西洋参根腐病拮抗菌XT-25的生防作用研究

为探讨西洋参根腐病的生物防治技术,本研究以西洋参根腐病病原茄病镰孢菌(Fusarium solani)和土赤壳属的Ilyonectria mors-panacis为靶标,从西洋参根际土中筛选具有拮抗作用的生防菌,通过对峙培养、菌丝抑制活性、抑菌促生物质测定和离体接种防效等试验,初步探讨拮抗菌株对西洋参根腐病的抑菌机制和防治效果。结果表明,分离到1株对2种西洋参致病菌的抑菌率皆在55%以上的菌株XT-25;结合形态学特征及16S rRNA、atpD和rpoB基因序列系统发育分析结果,将菌株XT-25鉴定为淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae);菌株XT-25对黄瓜枯萎病菌等6种病原菌的抑菌率为59%~70%。菌株XT-25不仅具有分泌蛋白酶、淀粉酶以及β-1,3葡聚糖酶等抑菌物质的能力,还具有溶解有机磷、无机磷、产氨、固氮、以及分泌IAA和ACC脱氨酶等促生物质能力。菌株XT-25挥发性气体对F.solani的抑菌率为9.04%;其可造成F.solani、I.mors-panacis菌丝的畸形。离体接种西洋参的防效试验结果表明,菌株XT-25对致病菌F.solani和I.mors-panacis引致的西洋参根腐病的防治效果分别为40.00%和24.74%。本研究结果为防治由镰孢菌和土赤壳菌引起的西洋参根腐病提供了生防材料和理论参考。

中生菌素在我国发明专利的申请现状分析

中生菌素是由淡紫灰链霉菌海南变种(Streptomyces lavendulue Var.Hainanensis)发酵液中获得的农用抗生素,其具有广谱的杀菌活性,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、分支杆菌、酵母菌及丝状真菌等都具有很好的抑制或杀死作用。该文梳理统计分析其专利申请量、申请趋势、重点专利,并对主要申请人、技术主题等进行分析,以期为后续发展提供有益的参考价值。

草莓炭疽病拮抗放线菌DTJ-24的筛选及鉴定

本研究采集草莓根际土壤样品15份,用稀释平板法分离获得79株放线菌。以草莓胶孢炭疽菌为指示菌,采用平板对峙法初筛、发酵液生长速率法复筛,获得5株拮抗效果较好的拮抗菌。其中菌株DTJ-24抑菌率达到69.89%,且传代稳定。根据该菌的形态学、生理生化特征及16s r DNA序列系统发育分析结果,确定该菌株为淡紫灰链霉菌。该研究结果是淡紫灰链霉菌对草莓胶孢炭疽菌具有拮抗作用的首次报道。

中生菌素高产菌株的选育

通过中生菌素高产菌株初筛研究,得到在培养基的 pH 值为7.0时,菌落琼脂柱对指示菌抑菌圈的大小与其产素量成正相关;在此基础上,比较了用紫外线处理、低温加紫外线复合处理、原生质体加紫外线复合处理及原生质体融合等4种育种方法,结果所用方法都能有效地提高中生菌素产生菌的效价,其中原生质体加紫外线处理的方法最佳。最终得到了4株高产菌株,产素量比亲株提高了50%～90%,达到5000～6500μg/mL。

微生物源黄酮类化合物的除草活性

菌株SPIR94166是从广西采集的土壤样品中分离得到的具有产除草活性物质菌株,根据其形态学特征、生理生化特性和分子生物学特性等,认为菌株SPIR94166是属于淡紫灰链霉菌。通过对菌种发酵液中除草活性物质的分离,得到3个活性组分,经NMR、红外、质谱等手段分析,这些除草活性物质分别鉴定为染料木素、黄烷酮以及槲皮素。

中生菌素高产菌的选育及发酵条件的研究

中生菌素是由淡紫灰链霉菌海南变种产生的一种氨基糖苷类抗生素，其产生菌用紫外诱变、磁场辅助紫外诱变等手段获得高产菌株O－66，产量达500mg/ml，比原株提高了2．5倍。在选育过程中注意了菌落形态与产量的相关性并采用正交法筛选出发酵培养基。

中生菌素产生菌的紫外诱变育种

以中生菌素产生菌C5为出发菌株,经过紫外诱变处理,获得突变株UV-69,其摇瓶发酵效价比出发菌株提高30.2%。传代试验表明,该突变株的高产性能遗传特性较稳定。在15t发酵罐上连续5批验证,平均发酵效价比原生产水平提高47.8%。