基于小RNA深度测序和RT-PCR鉴定鹅绒藤花叶病的病毒病原

鹅绒藤(Cynanchum chinense)是一种传统中药,为明确造成鹅绒藤叶片花叶症状的原因,本研究采用小RNA深度测序技术结合RT-PCR的方法鉴定引起山西太谷鹅绒藤病毒花叶症状的病原,并通过生物信息学的手段对病毒序列进行分析。结果表明,发病鹅绒藤样品经小RNA深度测序技术共获得15039334个原始序列,将拼接contigs与NCBI中的病毒数据库进行比对注释,结果显示病原为苜蓿花叶病毒(AMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)。利用特异引物克隆了AMV和CMV的外壳蛋白(CP)和移动蛋白(MP)基因全序列,分别命名为AMV-BR和CMV-BR。通过序列比对分析,发现AMV-BR CP氨基酸序列和核苷酸序列与AMV分离物AMV-Gyn(MH332899)、Dich-rep(MW835989)和VIC-320(MF075254)的相似性均达到100%;MP氨基酸序列和核苷酸序列与AMV分离物AMV-Gyn(MH332899)的相似性最高,均为99.3%。CMV-BR CP氨基酸序列和核苷酸序列与CMV亚组ⅠA中CMV分离物YA17(MH119159)的相似性最高,分别为100%和99.1%;MP氨基酸序列和核苷酸序列与CMV亚组Ⅰ分离物PV-0185(ON013887)的相似性最高,分别为98.2%和96.4%。MP和CP氨基酸序列系统进化分析表明,CMV-BR属于CMV亚组Ⅰ中的成员。这是首次在山西鹅绒藤上检测到AMV和CMV,该研究有助于深入了解AMV、CMV的分子进化,也为鹅绒藤病毒病的防治提供一定的理论依据。

苹果响应盐胁迫相关miRNA的深度测序数据集

土壤盐渍化已成为限制农作物产量与质量的重要因素之一,影响着全世界范围内的农作物产量。苹果作为一种重要的水果作物,盐胁迫的危害及耐盐砧木的缺乏已成为威胁现代苹果产业健康可持续发展的重要问题。因此,研究苹果对盐胁迫的反应和适应具有重要的现实意义和紧迫性。本研究分别以0%、0.2%和0.6%NaCl处理0、4、8和12天后的珠美海棠实生苗为试验材料,从叶片及根系中提取总RNA,构建RNA-seq文库,共鉴定获得575个miRNA,包括315个已知mdm-miRNA和260个新miRNA。此外,Differential Expression(DE) miRNA对盐胁迫反应具有组织特异性表达模式。同时提供珠美海棠miRNA深度测序的数据集,结合生物信息学方法对原始数据质量控制,获得高质量序列并利用BLAST软件将预测靶基因序列与NR、Swiss-Prot、Pfam等数据库比对,获得响应盐胁迫相关基因的注释信息。GO分析表明与盐胁迫有关miRNA及靶基因主要参与生物过程中对刺激的反应。本研究为珠美海棠的利用提供理论数据基础,并为耐盐砧木的选育提供有力支持。

基于小RNA深度测序技术对呼和浩特地区紫花苜蓿病毒病病原检测及分析

内蒙古地区是我国紫花苜蓿主产区之一,苜蓿病毒病的大面积发生严重影响了内蒙古地区紫花苜蓿的产量和质量。本研究利用小RNA深度测序技术结合RT-PCR/PCR,对内蒙古呼和浩特地区采集的8份紫花苜蓿病样进行病原鉴定,结果表明8份病样被苜蓿花叶病毒(AMV)、紫花苜蓿alpha双生病毒1(MsAPV1)、紫花苜蓿alpha双生病毒2(MsAPV2)、紫花苜蓿amavirus病毒1(MsAV1)和紫花苜蓿delta双生病毒1(MsDPV1)5种病毒所侵染,检出率分别为25.0%、75.0%、50.0%、37.5%、62.5%。样品1、3、4、6、7、8被两种以上的病毒复合侵染,其中样品4受到5种病毒的复合侵染。对5种病毒进行核苷酸系统进化分析,结果显示呼和浩特地区紫花苜蓿病毒分离物AMV/PP080165、MsAPV1/PP100171、MsAPV2/PP100172、MsAV1/PP100173和MsDPV1/PP100174分别与AMV/MZ22178.1、MsAPV1/MT787573.1、MsAPV2/MZ221805.1、MsAV1/OL521710.1和MsDPV1/ON669073.1亲缘关系最近。本研究首次对呼和浩特地区紫花苜蓿病毒病进行系统鉴定和分析,为进一步研究内蒙古地区紫花苜蓿病毒病病原的遗传进化和防治奠定了基础。

深度测序技术在畜禽疫病诊断中的应用

下一代测序(NGS),也被称为深度、高通量或大规模并行测序,可一次同时测定几十万到几百万条核酸分子序列。在畜禽疫病中应用于复杂诊断和密集监测、病因学、基因组学、进化和流行病学,以及宿主-病原体相互作用和感染生物学等方面。本综述首先简要介绍了深度测序技术,并通过实例对深度测序在畜禽疫病诊断中的应用进展进行阐述,为今后的相关研究提供些许参考。

利用小RNA深度测序技术鉴定白芷病毒病病原

[目的]白芷(Angelica dahurica)是一种药用历史悠久的传统中药,本研究利用小RNA深度测序技术明确引起山西太谷白芷花叶、褪绿症状的病原,为白芷病毒病的防控提供依据。[方法]将采集的白芷病样进行小RNA深度测序,通过RT-PCR和序列相似性分析明确白芷病毒病的分类地位。[结果]白芷样品经小RNA深度测序共获得22158005个原始序列,将拼接contigs与NCBI中的病毒数据库进行比对注释,结果显示比对到黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)3条正义链RNA 3、RNA 2、RNA 1的比对率分别为2.14%、1.28%和1.10%。利用特异引物克隆了CMV-BZ RNA3的外壳蛋白和移动蛋白基因全序列。通过序列比对分析,发现CMV-BZ CP氨基酸序列和核苷酸序列分别与CMV亚组ⅠB中CMV分离物(CMV-SD-YT和CMV-SXCH)和(CMV-SD-QD)的相似性最高,分别为99.1%和99.5%;MP氨基酸序列和核苷酸序列分别与CMV亚组Ⅰ分离物Ah的相似性最高,为99.3%和99.0%。MP和CP氨基酸序列系统进化分析表明,CMV-BZ与中国大多数CMV分离物聚为一类,属于CMV亚组Ⅰ中的成员。[结论]首次在山西白芷上检测到CMV,该研究有助于深入了解CMV的分子进化,为白芷产业的健康发展提供一定启示,也为病毒病的防治提供一定的理论依据。

利用小RNA深度测序技术鉴定江苏盐城辣椒病毒种类

2019年6月江苏省盐城市发生了较为严重的辣椒病毒病,危害症状表现为植株重度矮化、叶片黄化、蕨叶甚至畸形。将采集的11株疑似感染病毒的辣椒植株叶片研磨成浆液,再用其摩擦接种本氏烟植株,发现用其中3株辣椒的叶片浆液摩擦接种本氏烟植株后,本氏烟植株出现病毒侵染的典型症状,初步判断这些辣椒被病毒感染,但不能确定其种类和归属。为了进一步明确辣椒感染的病毒类型,将3株辣椒样品混成2份样品利用小RNA深度测序技术和生物信息学分析法进行检测,结果发现样品1被蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)、苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus,AMV)和辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)3种病毒复合侵染,从样品2中检测到BBWV21种病毒,通过RT-PCR检测验证了这一结果的可靠性。最后利用RT-PCR方法对田间采集的11份辣椒样品和接种的本氏烟植株进行毒源鉴定,其中2株辣椒样品及其接种的本氏烟叶片上鉴定出了BBWV2、ChiVMV和AMV,这3种病毒侵染辣椒在江苏省均为首次发现。研究结果为对江苏省辣椒构成潜在严重威胁的病毒的早期诊断和及时防控提供了参考。

基于小RNA深度测序的烟草脉坏死病病原分子鉴定及其全基因组序列分析

【目的】明确引起广西河池市南丹县烟草呈现斑驳花叶、叶脉坏死等症状的病毒病原,为烟草病毒病的综合防治提供理论依据。【方法】2022年5月,从河池市南丹县采集5份表现叶脉坏死、花叶等症状的烟草叶片样品,采用小RNA深度测序技术、反转录PCR(RT-PCR)、摩擦接种、分段克隆、系统进化及重组分析等方法对样品进行鉴定及遗传进化分析。【结果】小RNA深度测序获得与GenBank数据库中马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)不同分离物具有较高核苷酸相似性(99.00%~100.00%)的5条序列,将5条序列拼接后获得1条全长为9708 nt的全基因组序列;通过鉴别寄主苋色藜(Chenopodium amaranticolor)单斑分离的方法获得单一病毒,利用该分离纯化后的病毒单斑接种普通烟K326和本氏烟,其中K326的新叶产生坏死症状,而本氏烟的新叶呈不规则深绿色病斑症状;分别提取K326和本氏烟的叶片样品总RNA,通过RT-PCR检测、分段克隆的方法获得病毒分离物的全基因组序列,结果显示2个烟草品种中的病毒序列与小RNA深度测序获得的序列相似性达99.90%;将序列在GenBank中进行BLAST分析发现,研究获得的序列与已登录GenBank的PVY各分离物具有较高的核苷酸相似性,其中与我国黑龙江省马铃薯分离物PVY HLJ26(MF134425)的核苷酸相似性最高,为99.01%,表明研究获得的病毒序列为PVY分离物,命名为PVY-GXnd1(OP131591)。重组分析发现,PVY-GXnd1是由PVYO-139(U09509.1)、PVYN-Mont(AY884983.1)和PVYN-605(X97895.1)重组而来的新PVY分离物,重组主要发生在3个区域,分别是1~498、2415~5816和8555~9373 nt,覆盖PVY的P1、P3、6K1、CI、6K2、Vpg、Nib和CP蛋白编码区,包含了PVYN-Wi和PVYNTN株系的2种不同重组结构特征,表明PVYGXnd1株系更接近PVYNTN-NW株系;基于PVY编码区构建的系统发育进化树分析表明,PVY-GXnd1与我国黑龙江省分离物PVY HLJ26处于同一小分支,具有较近的亲缘关系,而该分离物归属于PVYNTN-NW(SYR-II)株系,与重组分析结果一致。【结论】侵染广西河池市南丹县烟草引起叶脉坏死症状的病毒PVY-GXnd1为一株PVYNTN-NW(SYR-II型)重组株系。

基于小RNA深度测序技术鉴定侵染广东辣椒的病毒种类

【目的】病毒病是广东省辣椒生产上主要病害之一,田间病株率一般为5%—30%,严重时可达100%。本研究旨在探明危害广东辣椒的病毒种类,为辣椒病毒病的防控提供理论依据。【方法】2013—2016年,从广东省广州、佛山、惠州、江门、梅州、湛江、茂名和韶关8市辣椒主要种植区采集疑似病毒病辣椒样品125份,分别提取每份辣椒病样总RNA,对从茂名、梅州、韶关3市采集的病样按地点和症状混合成7份混合病样进行小RNA深度测序分析,根据小RNA深度测序分析结果,对每种病毒分别根据小RNA深度测序拼接的基因片段序列和GenBank数据库中与该拼接序列同源性最高的病毒基因组序列保守区设计2对特异性引物,以小RNA深度测序的病样RNA为模板进行RT-PCR扩增,根据扩增效果对引物进行筛选,进一步应用筛选出的引物,对采集于广东省的125份辣椒病样分别进行RT-PCR检测,根据检测结果明确危害广东辣椒的病毒种类。【结果】从采集于广东省8市的辣椒主要种植区的125份病样中检测到14种病毒,按照检出率从高到低依次为辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)(44.0%)、甜椒内源RNA病毒(Bell pepper endornavirus,BPEV)(32.8%)、烟草轻型绿花叶病毒(Tobacco mild green mosaic virus,TMGMV)(31.2%)、辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)(29.6%)、辣椒黄脉病毒1(Pepper vein yellow virus 1,PeVYV-1)(26.4%)、甜椒斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus,PVMV)(25.6%)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)(18.4%)、辣椒环斑病毒(Chilli ringspot virus,ChiRSV)(16.8%)、辣椒黄脉病毒6(Pepper vein yellow virus 6,PeVYV-6)(16.8%)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)(15.2%)、辣椒褪绿病毒(Capsicum chlorosis virus,Ca CV)(14.4%)、蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV-2)(9.6%)、辣椒隐症病毒1(Pepper cryptic virus 1,PCV1)(8.8%)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)(4.0%)。其中,PMMoV、BPEV、TMGMV、ChiVMV、PeVYV-1和PVMV 6种病毒的检出率在25%以上,但PMMo V、Chi VMV和PVMV分布广泛,PMMo V除了茂名外,Chi VMV除了韶关外,其他7市辣椒产区均有分布;PVMV广泛分布于8市辣椒产区,根据检出率和分布范围,得出PMMo V、Chi VMV和PVMV是危害广东辣椒的优势病毒。同时发现,广东辣椒上多种病毒复合侵染现象普遍,在本研究125份病样中病毒复合侵染率达到88.0%,其中2种、3种、4种、5种、6种、7种和8种病毒复合侵染检出率分别为28.0%、25.6%、12.0%、9.6%、6.4%、1.6%和2.4%,由此可知,2种和3种病毒复合侵染是主要侵染形式。【结论】危害广东辣椒的病毒有14种,其中PMMo V、Chi VMV和PVMV为优势病毒,且复合侵染普遍,2种和3种病毒复合侵染是主要侵染形式。

利用深度测序技术检测玉米根系和叶片中已知的microRNAs

microRNA(miRNA)是一类具有20～24nt核苷酸长度的非蛋白质编码的内源小分子RNA,它在植物生长发育和逆境胁迫响应等过程中发挥着重要作用。文章利用基于Illumina/Solexa原理的小分子RNA深度测序技术,结合生物信息学的方法对玉米根系和叶片中已知miRNA的类型、丰度及靶基因进行了分析。研究发现,在根系中共检测到92个已知的miRNA,分别属于18个miRNA家族,其表达丰度在1～105943之间;在叶片中,共发现86个已知的miRNA,分别属于17个miRNA家族,其表达丰度在1～85973之间。靶基因预测结果表明,根系中的18个miRNA家族共靶向54个蛋白,进一步的功能预测发现,这些基因涉及了转录调控、物质能量代谢、电子传递、胁迫响应和信号转导等过程。以上研究结果表明,就已知的miRNA而言,无论是miRNA的类型还是表达丰度,在玉米根系和叶片中都存在较大差异。

基于低深度测序的无创产前基因检测技术对胎儿染色体拷贝数变异的检测效能评估

目的:探讨低深度测序的无创产前基因检测技术(NIPT)在胎儿染色体拷贝数变异(CNV)中的检测情况及临床意义。方法:抽取2017年9月至2019年5月所选873例孕妇的血浆,通过低深度测序方法对随机重排的样本进行盲法检测,并采用基因拷贝数变异分析算法(FCAPS)鉴定胎儿CNV。对比核型分析及染色体微阵列分析(CMA),评估低深度测序下NIPT对胎儿CNV的检测效能。结果:48例染色体微缺失/微重复(大小约0.1~47 Mb)样本中,与低深度(0.51~1.19X)测序的NIPT检测结果一致的有32例,结果不一致的有16例,另正常样本组有21例假阳性样本。NIPT对CNV总的敏感度和特异度分别为66.67%和97.45%,特别是对>2 Mb的CNV,其敏感度和特异度分别高达85.29%和98.18%。结论:基于低深度测序的NIPT对>2 Mb的CNV具有高效能。在NIPT中应用优化的检测和信息分析方法进行胎儿CNV的产前筛查是可能的。

血浆游离DNA低深度测序技术对胎儿性染色体异常筛查价值的初步探讨

背景染色体异常是导致出生缺陷的重要因素,目前无针对性染色体非整倍体的产前筛查方法。无创产前基因检测(noninvasive prenatal test,NIPT)应用于临床除了能常规检测目标疾病外,同时也能检测出性染色体异常,包括微缺失微重复。目的探讨血浆游离DNA低深度测序技术对胎儿性染色体异常的筛查价值。方法选取2018年6月-2021年7月于解放军总医院第一医学中心妇产科实验室行NIPT孕妇11239例,年龄17~46岁,检测时孕周为12~31周。对其中42例有产前诊断报告的性染色体异常病例进行回顾性分析。结果11239例标本中NIPT筛查出性染色体异常51例,阳性率为0.45%。42例(42/51)接受羊膜腔穿刺,确诊性染色体异常22例,阳性预测值(positive predictive value,PPV)为52%(22/42);18例性染色体数目偏少(XO)确诊8例(44%),21例性染色体数目偏多(XXX、XXY、XYY)确诊12例(57%),3例性染色体其他复杂异常(合并5号染色体微缺失)确诊2例(67%)。9例(9/51)拒绝接受产前诊断。结论NIPT检测技术应用于筛查胎儿性染色体异常有一定的临床意义,可发现性染色体罕见核型及微缺失微重复,但总体假阳性率偏高。

深度测序技术检测益生菌产品菌株组成及16SrDNA序列

目的:探查益生菌制品的标签标示与产品中实际检测到的菌株比较及不同产品中菌株的异同性。方法:以市场上购买的进口、出口酸乳制品作为研究对象,设计可区别24种产品的样品标签序列(Barcode),通过PCR及Illumina平台深度测序分析,获得了酸乳制品中所含益生菌种类及序列等详细信息,根据Barcode序列信息对其中所含的24个混合样本进行区分,然后利用16S RDP的16S数据库,对测序的Reads进行比对。结果:24种产品中标签标示与样品中实际检测到的菌株完全一致的仅有两种,在24种酸乳制品中,以嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌/德式乳杆菌为主要发酵菌株,双歧杆菌作为添加的益生菌基本在所有样品中存在,但含量较低,另一方面,不同产品中同一菌株的16S rDNA序列相似度较高,仅有两种菌株的1～2个碱基存在差异。结论:深度测序是一种可快速有效对食品中微生物群体精确筛查的技术,能够精确深入了解食品中微生物群落。使用溶方法检测目前市场上的酸乳制品,可发现使用的发酵菌种多来自商业化购买的菌剂,同质化程度较高,而作为后添加的双歧杆菌由于其生长条件的苛刻,实际活菌数量较低。

基于小RNA深度测序技术鉴定侵染我国部分省市草莓种苗的病毒种类

随着草莓保护地栽培面积的增加和无性繁殖种苗的繁殖与调运,草莓病毒病的发生与流行日益严重。为明确侵染我国部分省市草莓种苗的病毒种类,应用小RNA深度测序技术进行检测,并利用RT-PCR技术对结果进行验证及序列分析。结果表明,从来自我国7省市的41株具有典型病毒病症状的草莓种苗样品中检测到草莓斑驳病毒strawberry mottle virus(SMoV)、草莓镶脉病毒strawberry vein banding virus(SVBV)和草莓轻型黄边病毒strawberry mild yellow edge virus(SMYEV)3种。SMoV、SVBV和SMYEV的检出率分别为34.1%、24.4%和2.4%。选取不同产地草莓种苗上检出的不同病毒进行部分序列测定和分析,获得了3个SMoV分离物(四川分离物schhy13、辽宁分离物lnhy23和河北分离物hbhy28)的部分RNA13′端非编码区606 bp核苷酸序列,其一致性为98.12%~99.34%。测定并获得了5个SVBV分离物(辽宁分离物lnhy15、lnhy17、lnhy24、河北分离物hbhy28和陕西分离物shaxhy35)的ORF6的部分基因及其5′端非编码区的核苷酸序列,其中部分ORF6基因序列的一致性为97.98%~99.8%。仅1个辽宁样品中检测到SMYEV,获得了辽宁分离物lnhy26,其CP基因序列与中国甘肃分离物sy02的一致性为99.02%。病毒侵染草莓植株产生的典型症状有叶片畸形、变色和植株矮化。存在2种病毒和3种病毒复合侵染的情况,占所有阳性样品的41.2%。辽宁和河北的‘红颜’种苗中检出SMoV和SVBV或SMoV、SVBV和SMYEV的复合侵染情况;四川和陕西的‘红颜’种苗仅检出SMoV或SVBV,而其他省市和品种均未检出病毒。研究结果可以为草莓病毒的检测以及草莓病毒病的科学防治提供依据。

利用小RNA深度测序技术鉴定海南南瓜病毒种类

2016年在海南乐东、昌江、澄迈、海口、文昌、儋州等地采集疑似被病毒病感染的南瓜叶片样品6个,将样品合并,采用小RNA深度测序技术对上述混合样本的病毒种类进行鉴定,发现样本中含有黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、番木瓜环斑病毒(Papara ringspot virus,PRSV)、黄瓜绿斑驳病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)和中国南瓜曲叶病毒(Squash leaf curl China virus,SLCCNV),通过PCR方法进一步验证了深度测序结果的准确性。SLCCNV在4个样品中存在,P-CJ分离物的DNA-A和DNA-B组分全长分别为2 735 bp(登录号为MF062251)和2 722 bp(登录号为MF062252)。DNA-A和DNA-B组分均与SLCCNV分离物的同源性最高,同源性分别为89.2%~99.3%和79.1%~98.8%;P-CJ分离物与从中国植物样品中分离到的SLCCNV聚在同一进化分支上。上述研究结果表明,P-CJ是SLCCNV的一个分离物。

应用深度测序技术鉴定平菇球形病毒

旨在鉴定采集于北京顺义的畸形平菇样品中的病毒,提取总RNA,构建小RNA库,对小RNA库进行深度测序。测序结果表明,与平菇球形病毒(Oyster mushroom isometric virus,OMSV)基因组序列(NC_004560.1)匹配的小RNA共有3 075条,分布在OMSV基因组的不同位置,形成一些热点区域。经拼接,获得了3条长度大于500个核苷酸的序列。根据其中覆盖OMSV外壳蛋白(Coat protein,CP)基因的序列(seq22)中相对保守区域,设计引物,利用RT-PCR扩增获得cp基因部分序列。序列比对表明,其与OMSV相应区域序列相似度为91%,证实了OMSV在畸形平菇样品中的侵染。同时,将深度测序结果与现有4种si RNA预测软件的预测结果进行比较,发现测序结果与软件预测结果之间存在差异,讨论了这一差异出现的原因。

小RNA深度测序技术分析西瓜花叶病毒蜀葵分离物

蜀葵病毒病害的发生对其生长造成严重影响,明确蜀葵病毒病害的种类及变异进化对蜀葵病毒病害的防治具有重要意义。利用小RNA深度测序技术对具有明显脉明、花叶症状的蜀葵叶片进行鉴定。结果发现,感病蜀葵被西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus, WMV)、锦葵脉明病毒(Mala vein cleaning virus, MVCV)和一种新的RNA病毒[暂命名为蜀葵病毒1号(Althaea rosea virus1, ArV1)]所侵染。为进一步明确WMV蜀葵分离物(WMV-Tg)的进化关系,对病毒WMV-Tg全基因组进行扩增,获得全长为10 046个核苷酸序列(nt)。序列分析结果显示,WMV-Tg与已报道的WMV分离物基因组核苷酸序列的同源性为83.3%～90.2%。系统进化关系表明,WMV-Tg与WMV-Pg聚为一簇,亲缘关系最近。对蜀葵WMV-Tg来源的小RNA(WMV-derived small interfering RNAs, WMV-vsiRNAs)的长度分布、5′碱基偏好性、极性分布以及热点区分布的分析,有助于加深对WMV-vsiRNAs的了解,并为进一步研究病毒来源的小RNA(virus-derived small interfering RNAs, vsiRNAs)在抗病毒防御中的功能,以及为蜀葵病毒病的防治奠定理论基础。

深度测序鉴定玉米雄穗花器官分化期响应干旱胁迫的miRNA和其靶基因

【目的】运用现代分子生物学及高通量测序技术,研究不同品种玉米雄穗花器官分化期响应干旱胁迫的差异miRNA和其靶基因,挖掘和鉴定与玉米发育相关的基因,分析其性状差异的信号通路及分子调控网络。【方法】以耐旱自交系"PHBA6"和干旱敏感自交系“吉63”为研究对象,应用深度测序技术进行miRNA文库构建,鉴定其差异表达的miRNA,对差异表达mi RNA及其靶基因进行功能注释、聚类分析及通路富集。【结果】鉴定了总共337种前体miRNA,其中包含289种已知的miRNA和48种新的miRNA。在3个文库,两个分组中共有155种差异表达miRNA。基于GO功能分类及遗传和基因组(KEGG)的功能富集显示,这些miRNA可能通过靶向一系列与胁迫相关的基因而在干旱胁迫中发挥作用。至少55个预测的靶基因进一步被60个miRNA调控。NAC,MYB和MAPK基因家族在干旱胁迫下评分最高,在植物抗旱中重要作用。一系列miRNA与这些排名靠前的基因相关,包括miR164、miR172、miR1520、miR6158、ghr-n24、ghr-n56等。【结论】miRNAs可能在玉米雄穗花器官分化期耐旱中发挥重要作用,miRNAs的筛选为分子辅助育种和转基因育种将提供新的靶标。

深度测序法在检测HCV不同基因型/亚型混合感染中的应用

目的将深度测序法用于HCV感染者中不同基因型/亚型混合感染的检测。方法 2例HCV RNA阳性血浆标本(标记为1和2号标本),以NS5B和E1编码区为目的基因,经RT-PCR扩增后做sanger核苷酸序列测定,对其做基因分型发现2个编码区的分型结果后,重复3次NS5B基因PCR扩增;合并3次PCR产物用Ion TorrentTM半导体测序仪做深度测序。获得的序列用Geneious软件的"The map to reference algorithm"和"De novo assembly"2种方法做序列分析和比对,并用Mega 5构建进化树。结果 sanger测序:1、2号标本NS5B基因分型均为1b,E1基因分型均为2a;深度测序:2个标本均为HCV 1b与2a混合感染,其中The map to reference algorithm(Geneious)方法显示,1号标本中1b占92.7%、2a占3.8%、没有比对到的序列(unused seq)占3.5%,2号标本相应为84.3%、5.4%,没有比对到的序列占10.3%;De novo assembly(Geneious)方法显示,1号标本中1b占96.3%、2a占3.7%,2号标本相应为94.1%、5.9%。结论深度测序技术可以精确地获得HCV混合感染的不同基因型/亚型信息,De novo assembly(Geneious)分析HCV的深度测序数据更为精确和直观。

利用小RNA深度测序技术鉴定上海地区‘红美人’柑橘病毒种类

为明确上海地区‘红美人’柑橘的病毒种类,2020年4月在崇明、金山、奉贤、嘉定、闵行和浦东采集疑似病毒感染的叶片样品11份,采用小RNA深度测序技术结合RT-PCR对不同来源的混合样品进行病毒种类鉴定。结果表明,样品中含有柑橘衰退病毒Citrus tristeza virus(CTV)、柑橘黄化脉明病毒Citrus yellow vein clearing virus(CYVCV)、柑橘树皮裂纹类病毒Citrus bark cracking viroid(CBCVd)和柑橘类病毒ⅤCitrus viroid V(CVd-Ⅴ)。同时发现,上海地区‘红美人’柑橘病毒复合侵染现象普遍。基于CTV和CYVCV的CP全长基因及CBCVd和CVd-Ⅴ全基因组序列系统进化分析结果表明:除了CYVCV的分离物与地理来源具有明显的相关性外,其余病毒及类病毒均没有严格的地域相关性。研究结果为开展‘红美人’柑橘种苗病毒检测及病毒病的防治奠定基础。

利用小RNA深度测序技术检测灰飞虱病毒种类

灰飞虱是一种重要农业害虫,作为病毒介体,可以传播多种植物病毒引起水稻、小麦和玉米等粮食作物病毒病害。目前对于灰飞虱体内昆虫病毒种类尚缺乏系统认识,难以开展利用昆虫病毒防治灰飞虱相关研究工作。为挖掘灰飞虱体内昆虫病毒资源,本文通过小RNA深度测序技术对灰飞虱所携带的病毒种类进行分析鉴定。结果显示,测序数据比对得到13种病毒,涉及8个病毒科和2种未分类病毒。除占据优势的水稻条纹病毒外,其余均为专性寄生的昆虫病毒,包括5种正链RNA病毒、2种单链DNA病毒和5种双链DNA病毒。在这些病毒中,发现了一种与果蝇A病毒较相似的新病毒,克隆出其依赖RNA的RNA聚合酶(RdRP)基因1-1 932位核酸序列,经Blast比对和系统进化分析,在氨基酸序列中发现RdRP掌型亚结构域保守区呈现复制酶置换四体病毒科(Permutotetraviridae)病毒所具有的"C-A-B"排列样式,确定该病毒是一种新的类复制酶置换四体病毒,暂命名为Laodelphax striatellus permutotetra-like virus(LsPLV)。这是首次在半翅目昆虫中发现类复制酶置换四体病毒。本研究表明灰飞虱体内昆虫病毒种类较为丰富,为今后利用昆虫病毒生物防治灰飞虱奠定了基础。