同种和异种混合淋巴细胞反应及分类混合淋巴细胞反应的比较

目的:对比体外人外周血淋巴细胞对于异种小鼠细胞和同种异体细胞混合淋巴细胞反应. 方法:建立异种-同种混合淋巴细胞反应模型,进行分类细胞反应试验. 结果:人外周血淋巴细胞对于异种小鼠细胞的反应明显低于对于同种异体细胞的反应(P<0.05).细胞分类研究显示:在异种混合淋巴细胞反应中,主要是CD4+T细胞通过间接途径受小鼠抗原刺激而增生;在同种混合淋巴细胞反应中,主要是CD4+T细胞通过直接途径受同种异体抗原刺激而增生.在两种混合淋巴细胞反应中,CD8+T细胞也参与. 结论:异种混合淋巴细胞反应弱于同种混合淋巴细胞反应, 异种细胞只通过间接途径刺激T细胞.同种和异种混合淋巴细胞反应均需要抗原提呈细胞参与,CD4+T淋巴细胞是反应的主要细胞.

联合应用活体染料CFDA-SE和SNARF-1检测混合淋巴细胞反应

目的建立一种能够对单向混合淋巴细胞反应中应答细胞的应答强度进行更全面评价的增殖检测方法。方法BALB/cJ小鼠淋巴结细胞经CFDA-SE标记后作为应答细胞,BALB/cJ或C57BL/6小鼠脾细胞经丝裂霉素C处理后再用SNARF-1标记,作为刺激细胞,进行混合培养。混合培养96h后收获细胞,用流式细胞术进行检测,分析SNARF-1-CFSE+应答细胞的增殖情况,并用ModFitTM软件拟和以获得更多增殖相关指数。结果随着应答细胞分裂代数的增加,CFSE荧光强度逐渐减弱直至与刺激细胞无法分开,通过划除SNARF-1阳性细胞以确定应答细胞,解决了这一问题。应用ModFitTM软件,获得应答细胞的前体频率和增殖指数等多项重要的增殖相关指标。结论联合应用CFSE和SNARF-1染色,结合流式细胞术,可作为评价混合淋巴细胞反应中应答细胞的应答强度的有力工具。

HCV C-Fc基因转染的小鼠树突状细胞促进混合淋巴细胞反应的作用

目的 :观察HCVC Fc基因电穿孔法转染的小鼠树突状细胞(DC)功能的改变。方法 :分离小鼠骨髓单个核细胞与rmGM CSF和rmIL 4培养 1wk,对培养的细胞进行形态学观察 ,并用FACS检测细胞表面DEC2 0 5的表达。以通过质粒pcD NA3HCVC Fc电穿孔法转染培养的DC ,用间接免疫荧光染色测定转染细胞中HCVC Fc的水平 ;用混合淋巴细胞反应检测电穿孔法转染细胞的功能。结果 :培养 1wk后 ,得到具有典型DC形态的细胞 ,以质粒pcDNA3HCVC Fc为载体电穿孔法转染DC后 ,转染细胞中可检测到较高水平的HCVC Fc。与对照组相比较以电穿孔法转染的细胞能明显刺激混合淋巴细胞反应。结论 :小鼠骨髓单个核细胞加GM CSF和IL 4培养 1wk ,可生成大量的DC。质粒pcDNA3HCVC Fc转染培养的DC对T细胞刺激作用显著增强。

混合淋巴细胞反应体系中胎盘间充质干细胞的免疫抑制效应

背景:胎盘由滋养细胞及大量起源于胚外中胚层的间充质和血管共同组成,提示胎盘中存在间充质干细胞成分。目的:探索胎盘间充质干细胞对混合淋巴细胞反应体系中淋巴细胞增殖和细胞因子分泌的影响,评价其免疫学特性。方法:分离培养胎盘间充质干细胞,采用人以及兔双向混合淋巴细胞反应体系,根据胎盘间充质干细胞:外周血单个核细胞的不同比例(1:5,1:10,1:20,1:50,1:100,1:500)加入丝裂霉素处理胎盘间充质干细胞。3H掺入法测定淋巴细胞增殖率并用ELISA法测定混合培养上清液中白细胞介素2和γ-干扰素的含量。结果与结论:胎盘间充质干细胞抑制人或兔混合淋巴细胞反应体系中淋巴细胞的增殖,抑制率与加入的胎盘间充质干细胞数量成正比,同时胎盘间充质干细胞减少混合淋巴细胞反应中细胞因子白细胞介素2、γ-干扰素的分泌。提示胎盘间充质干细胞具有免疫调节作用,可以抑制同种异体或异种混合淋巴细胞反应体系中淋巴细胞的增殖。

室内常见气传真菌代谢提取物对异型小鼠混合淋巴细胞反应的影响

目的 探讨室内常见气传真菌代谢提取物的免疫抑制作用。方法 监测室内环境中的气传真菌 ,在此基础上 ,以改良的混合淋巴细胞反应实验研究其代谢产物的免疫抑制作用。结果 室内主要气传真菌属中的青霉属、曲霉属在无明显的细胞毒性浓度下 ,可抑制异型小鼠淋巴细胞混合刺激而产生的增生。

PDL_1Ig基因修饰的恒河猴肝细胞在混合淋巴细胞反应中的效应研究

目的探讨恒河猴来源的PDL1Ig在体外混合淋巴细胞反应中的作用。方法在Gen Bank中检索到恒河猴目的基因PDL1和Ig G1Fc的序列,采用重叠延伸PCR法合成该目的基因,与p GEM-T连接转化感受态E.coli TOP10,经鉴定得到PDL1Ig基因,p Shuttle-CMV线性化后连接目的基因转化感受态E.coli TOP10,克隆p Shuttle-CMV/PDL1Ig重组穿梭质粒。将p Ad Easy-1和线性p Shuttle-CMV/PDL1Ig共电转至BJ5183细胞中同源重组,构建重组腺病毒载体p Ad Easy-1/PDL1Ig骨架,以脂质体2000将p Ad Easy-1/PDL1Ig转染至293细胞中包装成有活性的重组腺病毒。感染恒河猴肝细胞,RT-PCR和Western blotting检测目的基因的表达。混合淋巴细胞反应(MLR)测定其生物学活性。结果成功构建了PDL1Ig重组腺病毒载体,能感染恒河猴肝细胞,RT-PCR和Western blotting检测有目的基因表达,在混合淋巴细胞反应中其能抑制T细胞增殖。结论成功构建了p Ad Easy-1/PDL1Ig重组腺病毒载体,其可在恒河猴肝细胞中高效表达,该重组蛋白可在体外通过PD-1/PDL1通路抑制T淋巴细胞增殖。

去牛血清清蛋白化对复方壳多糖组织工程皮肤单向混合淋巴细胞反应的影响

目的探索复方壳多糖组织工程皮肤去牛血清清蛋白化的洗涤方法及对其单向混合淋巴细胞反应的影响。方法从头制备复方壳多糖组织工程皮肤,ELISA法检测不同洗涤条件下外渗液中牛血清清蛋白的浓度,然后检测在最优洗涤条件下组织工程皮肤单向混合淋巴细胞反应的强度。结果当洗涤间隔时间为3h,洗涤次数为2次时能使外渗液中牛血清清蛋白的浓度降到50ng/mL以下;按该方法洗涤后,组织工程皮肤的单向混合淋巴细胞反应强度显著降低。结论复方壳多糖组织工程皮肤以3h×2次洗涤,能够显著降低其外渗液中牛血清清蛋白的浓度及其单向混合淋巴细胞反应的强度。

人-鼠间同种和异种混合淋巴细胞反应的对比

目的 :对比体外人外周血淋巴细胞对于小鼠细胞和同种异体细胞混合淋巴细胞反应 .方法 :建立异种—同种混合淋巴细胞反应模型 ,进行分类细胞反应试验 .结果 :人T淋巴细胞对于小鼠细胞的反应明显低于对于同种异体细胞的反应 .细胞分类研究显示 :在异种混合淋巴细胞反应中 ,主要是CD4 + T细胞通过间接途径受小鼠抗原刺激而增殖 ;在同种异体细胞混合淋巴细胞反应中 ,主要是CD4 + 细胞通过直接途径受同种异体细胞抗原刺激而增殖 .在两种混合淋巴细胞反应中 ,CD8+ T细胞也增殖 .结论 :异种混合淋巴细胞反应弱于同种混合淋巴细胞反应 .同种和异种混合淋巴细胞反应均需要抗原提呈细胞参与 .同种混合淋巴细胞反应中存在直接和间接两种途径 ;

全血保存前去白细胞的血小板保存7天,质量符合要求无混合淋巴细胞反应

背景全血制备的血小板(WBD-PCs)汇集，在保存前作去白细胞处理，这种方式有利于输血机构按血制品制备的时间顺序发放，减少未被输注血液所致的浪费，简化细菌筛查方面，WBD-PCs优于单一供者浓缩血小板(PC)。研究设计及方法无菌连接将4～6单位去白细胞PC汇集到-1．5LCLX-HP血小板保存袋中。质控是保存前去白细胞PC，单份保存第5和7天取样检测血小板的质量；凝集性、

离体CD4^+CD25^+调节性T细胞的扩增和混合淋巴细胞反应研究

为研究健康人外周血CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+regulatory T cells,CD4+CD25+Tregs)在协同刺激信号作用下的扩增反应及与CD4+CD25-T细胞混合淋巴细胞反应,采用免疫磁珠法分离CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T细胞,在抗CD3-mAbs和抗CD28-mAbs的刺激下行CD4+CD25+Tregs培养和CD4+CD25+Tregs+CD4+CD25-T细胞混合淋巴细胞培养72 h。然后加入CCK-8溶液孵育1 h,用酶标仪检测OD450值。结果为:CD4+CD25+Tregs组OD450值极显著性地低于CD4+CD25-T细胞组(P<0.01)。CD4+CD25+Tregs与CD4+CD25-T细胞混合组OD450值也极显著性地低于CD4+CD25-T细胞组(P<0.01)。CD4+CD25+Tregs表现出无反应性特征,还可抑制CD4+CD25-T细胞扩增,因此,CD4+CD25+Tregs不只是很惰性的免疫细胞,而是对保持免疫耐受发挥了积极的调节作用。

CTLA4-FasL双功能融合蛋白分子抑制混合淋巴细胞反应及促进淋巴细胞凋亡

目的 构建人CTLA4 FasL融合蛋白真核表达载体 ,表达CTLA4 FasL融合蛋白 ,通过体外实验初步研究其生物学特性。方法 通过特异引物分别扩增出CLTA4和FasL胞外区的cDNA ,将它们拼接后 ,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中 ,体外表达纯化。Westernblot分析CTLA4 FasL融合蛋白的抗原性。体外细胞结合试验研究其结合特异性配体作用。混合淋巴细胞反应研究其抑制免疫应答的效应。结果 测序证实所扩增的PCR产物分别是CLTA4和FasL胞外区的cDNA ,其序列与文献报道相符。成功构建了pcDNA3.1 CTLA4 FasL真核表达载体。Westernblot分析结果显示 ,表达获得的蛋白具有CTLA4和FasL的抗原性。体外细胞结合试验显示 ,CTLA4 FasL融合蛋白可以分别与Jur kat细胞表面的Fas受体和Raji细胞表面的B7分子结合。混合淋巴细胞反应结果显示 ,该融合蛋白可以有效抑制异基因淋巴细胞的刺激作用及诱导淋巴细胞凋亡 ,并显示了显著的协同效应。结论 成功构建了CTLA4 FasL融合蛋白真核表达载体 ,体外表达并纯化了CTLA4 FasL融合蛋白 ,体外实验证实CTLA4

尖锐湿疣病损组织粗提蛋白对混合淋巴细胞反应的影响

目的 通过观察尖锐湿疣病损组织粗提蛋白刺激后的树突状细胞(DC)对混合淋巴细胞反应的影响,探讨尖锐湿疣病损粗提蛋白对DC免疫功能的影响。方法 用聚合酶联反应(PCR)鉴定尖锐湿疣病损组织中人乳头瘤病毒(HPV)6 DNA和HPV11 DNA。人脐带血和外周血分离培养10 d的DC分别用尖锐湿疣病损组织和健康儿童包皮组织粗提蛋白刺激2次。另设空白对照组磷酸盐缓冲液(PBS)刺激。用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测DC刺激同种异体和自体混合淋巴细胞反应的能力。同种异体淋巴细胞来源于脐带血和外周血,同种自体淋巴细胞来源于外周血。结果 PCR结果显示尖锐湿疣病损组织中HPV6b DNA阳性。尖锐湿疣病损粗提蛋白刺激后的DC刺激来源于脐血的T淋巴细胞,其增殖指数(5.514)高于包皮对照组(2.645)和空白对照组(1.698,DC∶T均为1∶11)。尖锐湿疣病损粗提蛋白刺激后的DC刺激来源于外周血的T淋巴细胞的增殖指数(2.352)高于包皮对照组(1.083)和空白对照组(0.644,DC∶T均为1∶3)。结论 尖锐湿疣病损粗提蛋白可能因存在的HPV病毒抗原对DC的刺激和功能活化,进一步促进了T淋巴细胞的增殖活化,并进而推测可以提高机体抗病毒特异性细胞免疫。

mOX40-Fc的真核表达及其对混合淋巴细胞反应的影响

构建重组pcDNA3.1-mOX40-Fc真核表达载体,在CHO细胞中表达,并初步研究融合蛋白mOX40-Fc对MLR中细胞增殖的影响。克隆编码hIgG1Fc基因片段,与编码小鼠OX40胞外段的基因融合,构建mOX40-Fc融合基因及其分泌型真核表达载体pcDNA3.1-mOX40-Fc;转染CHO细胞构建融合蛋白的稳定真核表达细胞株,用RT-PCR及夹心ELISA检测其表达,纯化后经SDS-PAGE及Western blot法对其进行鉴定,混合淋巴细胞反应(MLR)测定其生物学活性。结果:核苷酸序列测定显示构建的mOX40胞外段和hIgG1Fc段基因序列与GenBank序列一致、阅读框完整;RT-PCR、ELISA和Western blot检测表明转染细胞有分泌型重组蛋白的表达;功能实验提示mOX40-Fc能抑制MLR中的细胞增殖。成功构建mOX40-Fc真核表达载体并获得高效表达,该重组蛋白可在体外通过抑制OX40/OX40L共刺激通路抑制淋巴细胞增殖。

混合淋巴细胞反应中白细胞介素-2和肿瘤坏死因子-α的表达对肝移植急性排斥反应的预测价值

白细胞介素（IL）-2和肿瘤坏死因子（TNF）-α的表达水平与器官移植供受体间主要组织相容复合体（MHC）的吻合度密切相关。动物实验叫和临床病例中，移植物受体术后血浆IL-2或TNF-α浓度升高提示急性排斥反应（AR）的发生。淋巴细胞激活是肝脏移植AR的首要因素，供受体淋巴细胞混合反应（MLR）是研究移植排斥反应机制的可靠模型。

天花粉蛋白抑制同种异体混合淋巴细胞反应与诱导IL-9＋IL-10／IL-24＋Th9细胞间关系的初步探讨

建立同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)体系,采用同位素3 H-TdR掺入、FACS、Real-time PCR、ELISA、Westernblot等方法研究低剂量Tk抑制细胞增殖反应的效果及作用机制。FACS及同位素掺入检测结果显示,低剂量Tk通过非RIP的方式显著抑制MLR的增殖;Real-time PCR及ELISA结果表明,天花粉抑制的增殖体系中较对照组IFN-γ表达水平降低,IL-4、IL-9、IL-10、IL-24表达水平增强;Western blot显示,Tk使得JNK磷酸化增强。以上结果说明Tk显著抑制人同种异体混合淋巴细胞增殖反应,其负向免疫调节作用可能由多种细胞因子、信号通路及T细胞亚群的介导参与。

胎盘间充质干细胞与免疫抑制药物体外联合应用对单向淋巴细胞混合反应的作用

目的提取并鉴定胎盘间充质干细胞,检测胎盘间充质干细胞对单向淋巴细胞混合反应的免疫调节作用,并将胎盘间充质干细胞与免疫抑制药物(环孢素A或霉酚酸)联合应用,检测二者联合后对单向淋巴细胞混合反应的作用。方法组织块培养法提取胎盘间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标志,II型胶原免疫组化染色及甲苯氨蓝染色检测胎盘间充质干细胞向软骨细胞分化的能力。MTT检测单独应用胎盘间充质干细胞或与环孢素A或霉酚酸联合应用后,单向淋巴细胞反应中T细胞的增殖情况。结果成功提取胎盘间充质干细胞,其表面阳性表达CD29和CD44。II型胶原及甲苯氨蓝染色均呈阳性。单独应用胎盘间充质干细胞可抑制单向淋巴细胞混合反应中T细胞的增殖。与环孢素A联合后该作用减弱,与霉酚酸联合后该作用增强。结论组织块培养法可成功提取胎盘间充质干细胞。该细胞对单向淋巴细胞混合反应有负向免疫调节作用。胎盘间充质干细胞与不同的免疫抑制药物联合对单向淋巴细胞混合反应产生的作用是有差异的。

滑膜间充质干细胞分离培养、免疫表型鉴定及在混合淋巴反应体系中的抑制效应

背景:滑膜组织中可分离出具有多向分化潜能干细胞特性的细胞。目的:探索滑膜间充质干细胞体外分离、培养的可行性、免疫表型的鉴定及对混合淋巴细胞反应体系中淋巴细胞增殖的影响,评价其免疫学特性。方法:关节镜下获取10例半月板损伤患者的膝关节滑膜组织,胶原酶消化获得有核细胞。挑选单细胞克隆,筛选获得滑膜间充质干细胞。检测其增殖能力、细胞活力,流式检测其细胞免疫表型,采用人双向混合淋巴细胞反应体系及植物血凝素刺激的淋巴细胞增殖反应体系,根据滑膜间充质干细胞与外周血单个核细胞的不同比例加入丝裂霉素处理滑膜间充质干细胞。MTT法检测并计算其抑制率。结果与结论:10组滑膜间充质干细胞系增殖能力和细胞活力差异无显著性意义(P>0.05)。10组细胞系免疫表型:CD44、CD90、CD105呈阳性,CD14、CD34、CD45和HLA-DR呈阴性。滑膜间充质干细胞抑制混合淋巴细胞反应体系中及植物血凝素刺激的淋巴细胞增殖反应体系中淋巴细胞的增殖、抑制率与加入的滑膜间充质干细胞数量成正比。提示关节滑膜组织可以分离、培养获得滑膜间充质干细胞,其具有间充质干细胞特异性表型,且滑膜间充质干细胞具有免疫调节作用。