TaqMan探针法实时荧光定量PCR检测西瓜潜隐病毒

【目的】西瓜潜隐病毒(Citrullus lanatus cryptic virus,CiLCV)是近年来新发生的一种重要种传病害,研究旨在建立基于TaqMan探针法的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR with TaqMan probes,TaqMan-qPCR)检测技术,为开展种子、种苗带毒鉴定和病害防控提供技术支撑。【方法】通过基于小RNA高通量测序技术在北京西瓜产地发现了CiLCV,并克隆CiLCV的dsRNA1和dsRNA2全长序列,设计特异性引物建立RT-PCR和TaqMan-qPCR检测方法。以黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottled mosaic virus)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus)、甜瓜内源病毒(Cucumis melo endornavirus)、瓜类褪绿病毒(cucurbit chlorotic yellows virus)、南瓜花叶病毒(squash mosaic virus)、番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus)、西瓜花叶病毒(watermelon mosaic virus)、小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus)8种常见病毒为对照进行检测方法特异性分析;利用建立的实时荧光定量标准曲线对方法灵敏度进行评价;进一步利用TaqMan-qPCR和RT-PCR技术监测我国葫芦科作物主产区的西瓜、黄瓜、甜瓜和南瓜(砧木)种苗带毒情况。【结果】通过分析获得的高质量小RNA数据,发现17条组装的contig与CiLCV基因组有较好同源性。进一步克隆获得CiLCV的dsRNA1和dsRNA2序列全长(分别为1603和1466 nt),发现其与河南省鉴定出的CiLCV同源性高达99.4%和99.8%(GenBank number KY081285、KY081284)。建立的RT-PCR检测技术对CiLCV有单一扩增条带;建立的TaqMan-qPCR检测技术具有较好特异性和灵敏度,且能够检测到最低拷贝数为2×10^(3)的病毒,灵敏度是RT-PCR的100倍。同时,发现有1份来自北京的西瓜种苗检出了CiLCV,而其余地区的西瓜、黄瓜、甜瓜和南瓜(砧木)种苗均未检出该病毒,表明我国葫芦科作物主产区种苗带毒情况总体不高。【结论】建立的TaqMan-qPCR检测CiLCV技术特异性强、灵敏度高,适用于口岸和实验室开展CiLCV快速检测和精准鉴定。鉴于CiLCV可以通过种子、种苗等传播方式快速扩散,我国应重视种子、种苗的带毒检测,防止带毒种子、种苗流入生产环节进而调运扩散至全国,给产业造成重大经济损失。

应用RT-PCR分子检测技术快速检测大蒜普通潜隐病毒

根据大蒜普通潜隐病毒(Garlic common latent virus,GCLV)的外壳蛋白区域的保守序列设计合成一对寡核苷酸引物,以带毒植物的总RNA为模板,进行反转录和PCR扩增,通过反应体系和反应程序的建立与优化,扩增得到长300 bp的目的片段,并将目的片段转入大肠杆菌进行了克隆和序列测定。测序结果与GenBank中其他GCLV相应区域的序列同源性最高达98%。并对其检测的特异性和灵敏度进行了验证,从而建立了快速、灵敏、特异性强的GCLV分子生物学检测方法。

应用多重RT-PCR检测甘肃‘成县迟蒜’中的大蒜潜隐病毒和洋葱黄矮病毒

根据大蒜潜隐病毒(garlic latent virus,GLV)和洋葱黄矮病毒(onion yellow dwarf virus,OYDV)的外壳蛋白基因核苷酸序列分别设计2对特异性引物,在单重RT-PCR检测的基础上,建立同时检测GLV和OYDV的多重RT-PCR技术体系.结果表明:该方法可从带病的甘肃‘成县迟蒜’大蒜样品中扩增出GLV(849bp)和OYDV(571bp)的2条特异性片段.GLV扩增产物与GenBank中登录的其他分离物核苷酸同源性在90.00%～99.76%,OYDV扩增产物与其他分离物核苷酸的同源性为90.00%～98.00%.

应用RT-PCR检测水仙潜隐病毒

根据已报道的水仙潜隐病毒(Narcissus latent virus,NLV)外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列,设计一对特异性引物,以提取的水仙样品总RNA为模板进行RT-PCR,并进行特异性和灵敏度测定。结果表明,此法能够从携带NLV的水仙样品中成功扩增出大小约829 bp的特异性目的片段,具有良好的特异性和较高的灵敏度,可有效地应用于水仙样品中NLV的检测。

苹果潜隐病毒(Latent virus)研究——Ⅱ.苹果品种和矮生砧木潜隐病毒鉴定

在1980—1985年,对我国主要苹果产区的潜隐病毒种类进行调查鉴定,基本明确渤海湾果区、黄河故道果区和西北高原果区主栽苹果品种普遍潜带褪绿叶斑病毒、茎痘病毒和茎沟病毒,未检出其他病毒。营养系矮生砧木也普遍潜带这三种病毒。解决潜隐病毒为害的主要途径是培育无病毒母本树,栽培无病毒苗木。这方面的研究工作正在进行中。

甘薯潜隐病毒外壳蛋白基因的克隆、表达及其抗血清的制备

根据已报道的甘薯潜隐病毒(Sweet potato latent virus,SPLV)外壳蛋白(CP)基因的核苷酸序列合成引物,利用RT-PCR方法克隆了SPLV河南分离物(SPLV-HN)的CP基因及部分3′端非编码区序列,序列分析表明,SPLV-HN CP基因由879个核苷酸组成(GenBank登录号为DQ399862),编码293个氨基酸残基。与GenBank中SPLV-CH(X84011)和SPLV-T(X84012)分离物的核苷酸序列相似性分别为96.8%和93.0%;与日本分离物(E15420)的核苷酸序列相似性为83.6%。将CP基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原,免疫家兔,制备了SPLV外壳蛋白的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清可用于田间甘薯样品的检测。

水仙潜隐病毒病病原鉴定

在中国水仙主产区水仙病毒病的系统调查中,从无症和褪绿斑驳的病叶中分离到3个分离物NC、Ⅱ-3和Ⅹ-3.经人工根接和汁液摩擦接种在昆诺藜和千日红上,表现为局部枯斑;在番杏和苋色藜上,表现为局部褪绿或局部褪绿白斑;在克利夫兰烟和菜豆上产生系统褪绿;而对曼陀罗、豇豆和裂叶牵牛则不侵染。电镜观察病原病毒为635～660nm×13nm的线状粒体。体外抗性测定表明:TIP为65～70℃、DEP为10^(-2)～10^(-3),而LIV为3天。ELISA测定结果与来自荷兰水仙上的NLV标准抗血清起阳性反应。这些结果表明,3个分离物为同一病原,均属水仙潜隐病毒(NLV)。

苹果潜隐病毒的研究——Ⅱ.苹果茎沟槽病毒对苹果生理生化的影响

用金冠、富士二品种幼苗接种茎沟槽病毒(SGV)后,分期测定蛋白质、核酸、DNA、总氮、氨基酸、可溶性糖、铁和锌含量。结果表明:受SGV侵染的植株,核酸、蛋白质含量下降;DNA、总氮、游离氨基酸含量增加;铁含量增加,锌含量减少,可溶性糖含量增加。

两种苹果潜隐病毒脱毒技术研究

该文应用热处理、热处理加茎尖组织培养以及在培养基中加入抗病毒药剂等方法，脱除了苹果优系短枝富士的苹果褪绿叶斑病毒（ＣＬＳＶ）和苹果茎沟病毒（ＳＧＶ），从而获得无潜隐病毒苗木。

苹果潜隐病毒的研究——苹果主栽品种脱毒研究

西北地区的苹果主要栽培品种都普遍带有苹果潜隐病毒,其带毒株率高达80—100%。1985—1988年在37±1℃的恒温下、热处理28天,对苹果主要栽培品种进行了脱毒研究。目前,已培育出金冠、红星、红富士和秦冠的无毒母树。

苹果潜隐病毒的研究——Ⅲ.茎沟槽病毒对苹果内源激素的影响

用LC—6A高效液相色谱仪测试富士二年生苹果苗的三种内源激素。结果表明:受茎沟槽病毒侵染植株GA_3、CTK及IAA,三种内源激素的含量均较对照(无毒植株)低。GA_3降低最显著,比无毒植株低111.18％,CTK比无毒株低19.66％,IAA比无毒株低17.69％。

啤酒花潜隐病毒新疆分离物的全基因组序列分析

对新疆啤酒花上获得的HpLV分离物HpLV-XJ进行了全长克隆和基因组序列分析。结果显示:HpLV-XJ的全基因组序列为8612个核苷酸(nt)(不包括poly A),含有6个开放阅读框(ORF),分别编码224 kDa(ORF1)、25kDa(ORF2)、11 kDa(ORF3)、7 kDa(ORF4)、34 kDa(ORF5)、和12 kDa(ORF6)蛋白。序列相似性分析结果表明,HpLV-XJ与HpLV(GenBank:AB032469)序列相似性达98.5%,6个开放阅读框的核苷酸序列相似性分别为98.3%、99.0%、97.6%、96.7%、99.5%和98.4%;由此推导的氨基酸序列相似性分别为98.6%、98.7%、97.2%、95.0%、99.4%和98.1%,各个基因的核苷酸序列和蛋白的氨基酸之间存在着一定的差异。

接种和检测苹果潜隐病毒

通过试管微嫁接,分别将苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎沟病毒接种到小金海棠组培苗上,并用PAS-ELISA法检测其带毒率。结果表明:接穗小金海棠苹果褪绿叶斑病毒的带毒率为60.0％,其苹果茎沟病毒带毒率为73.3％,从而证明用此方法可以对组培苗进行快速病毒接种而得到带毒的实验材料。

苹果潜隐病毒检测技术的研究

1986～1989年,对国内已有的三种主要苹果潜隐病毒,进行了温室与田间检测技术的研究。结果表明,将木本指示植物检测法,由田间改在温室内进行,可将检测周期由1～3年缩短到2～5周;同时因采用了温室与田间检测技术相结合,仅在一年内即可准确地确定一个被检样品是否带有病毒。

生物素标记cDNA探针杂交检测梨树上3种潜隐病毒研究

本研究合成了苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和苹果茎痘病毒(ASPV)的生物素标记cDNA探针,对斑点杂交和免疫印迹杂交检测这3种病毒的效果进行了分析。以含ACLSV和ASGV克隆片段的大肠杆菌菌液为样品时,斑点杂交检测灵敏度分别为80 cfu/μL和50 cfu/μL。以离体培养砂梨植株为材料,采用斑点杂交法检测砂梨离体培养植株粗提液中的3种病毒,均产生强的杂交信号,且特异性好。比较斑点杂交和ELISA检测病毒含量相对较低的热处理再生植株中ASGV和ACLSV,结果表明斑点杂交具有较高的灵敏度。组织印迹杂交检测砂梨离体植株ASGV和ACLSV的结果显示,这2种病毒在离体植株的各部位均有分布,自基部至茎尖各部位印迹均产生很强的杂交信号。

潜隐病毒对苹果(Malus pu mila)无机和有机营养状况的影响

分别对携带和不携带 3种苹果潜隐病毒 (ACLSV、ASPV、ASGV)的乔纳金 (Jon agold)、新红星 (Redchief)和长富_2 (Fuji) 3个苹果品种结果树的水分、无机营养和有机营养水平进行了测定 .测定结果表明 ,携带和不携带 3种苹果潜隐病毒的苹果结果树的水分、无机营养和有机营养状况有着不同程度的差异 .无毒树叶片的含水量、含氮量和可溶性蛋白含量均显著高于带毒树 ,而带毒树的含钙量则显著较高 .

应用间接ELISA法检测苹果潜隐病毒

据报道,世界各地感染苹果树的病毒种类中,分布最广、危害较大的是一组潜隐病毒。在50—60年代,欧美国家苹果潜隐病毒的感染率平均75％-80％,我国现有苹果主要栽培品种的潜隐病毒带毒率高达80—100％。苹果潜隐病毒主要包括褪绿叶斑病毒(Chlorotic leaf spot virus.CLSV)、茎沟病毒(Stem grooving virus)和茎痘病毒(Stempitting virus.SPV)。这些病毒常以复合感染方式存在,在栽培品种的叶、果。

苹果潜隐病毒脱除技术的改进研究

目前,已报道侵染苹果的病毒有30余种,其中大部分可在苹果的叶、果实和枝条上引起明显症状.另外,有些病毒在栽培品种上呈潜伏性感染,又称潜隐病毒.已经鉴定出我国苹果潜隐病毒有3种:苹果褪绿叶斑病毒(A-CLSV)、苹果茎沟病毒(ASGV)和苹果茎痘病毒(ASPV).潜隐病毒由于其潜隐性,在栽培中不易被发现清除,我国苹果主要栽培区上述3种苹果潜隐病毒的感染株率达90%以上,每年使苹果减产约40%～73%.

苹果潜隐病毒快速检测

该文以优系短枝富士为主要试材，采用木本指示植物和间接酶联免疫（ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ）两种方法，对苹果褪绿叶斑病毒（ＣＬＳＶ）、苹果茎沟病毒（ＳＧＶ）和苹果茎痘病毒（ＳＰＶ）进行了检测．试验表明，俄罗斯苹果Ｒ１２７４０－７Ａ、司派２２７和弗吉尼亚小苹果３种指示植物可作为上述３种潜在病毒的鉴定植物．植物生长状况对鉴定结果有重大影响．间接酶联免疫检测速度快，准确度高．该试验所用最佳抗体工作浓度ＣＬＳＶ：第一抗体１／６０００，第二抗体１／２０００；ＳＧＶ：第一抗体１／５０００，第二抗体１／３０００．