苯硼酸固相萃取-液相色谱-串联质谱法检测动物源食品中潮霉素B

研究建立了使用苯硼酸(Phenylboronic acid,PBA)共价固相萃取柱结合液相色谱-串联质谱法测定猪肉、猪肝、猪肾、羊肉、牛奶、鸡蛋等6种动物源食品中潮霉素B残留的检测方法。样品采用乙酸铵-三氯乙酸混合溶液提取,通过具有独特共价机理的Bond Elut PBA进行固相萃取净化,采用Poroshell 120 EC-C18分析柱,在流动相不含七氟丁酸离子对试剂的条件下,梯度洗脱,于电喷雾离子源正离子模式下检测,同位素内标法定量。结果表明,在10~500 ng/mL的浓度范围内,使用同位素内标校正所得到的线性关系良好,相关系数大于0.99;方法检出限为10μg/kg,定量限为20μg/kg;3个不同加标浓度水平下,平均回收率为94.2%~110.8%,相对标准偏差在2.7%~10.2%。该方法简单、准确,同时避免了七氟丁酸离子对试剂对仪器造成污染及产生离子抑制效应,适用于多种动物源食品中潮霉素B残留的测定。

潮霉素B对拟南芥种子萌发及幼苗生长的影响

为探究拟南芥种子进行1/2 MS培养基筛选的最适潮霉素浓度,将野生型拟南芥种子灭菌后,点播在含0,20,30,40,50 mg/L潮霉素的1/2 MS培养基上进行培养(分别记为M_(0)、M_(1)、M_(2)、M_(3)、M_(4)),观察潮霉素对种子萌发、幼苗生长形态变化的影响,统计种子萌发率、第3天萌发势、第13天幼苗失绿死亡率,测定第7天幼苗鲜重、干重、相对含水率、主根长度,结合逆向思维的变异系数-熵权组合赋权的TOPSIS方法得出不同浓度潮霉素处理效果的综合排序。结果表明,潮霉素对拟南芥种子萌发和幼苗生长均有明显的抑制作用;变异系数-熵权组合赋权的TOPSIS方法得出不同处理对拟南芥种子萌发和幼苗生长抑制效果的排序为:M_(4)>M_(3)>M_(2)>M_(1)>M_(0),M_(2)的接近度为0.531 5,约为0.5,最接近抑制效果的50%;综合实验结果可知,拟南芥种子进行1/2 MS培养基筛选的适宜潮霉素浓度为30 mg/L,种子点播的第7~10天为幼苗移栽的适宜时期。

不同甘蔗品种对潮霉素B耐受性的研究

旨在探讨不同甘蔗品种对潮霉素B的耐受性,为甘蔗遗传转化后的筛选提供参考。以甘蔗品种新台糖22号与粤糖00-236的胚性愈伤组织与增殖阶段的组培苗为试验材料,分别接入加有潮霉素B5、15、25、35、45 mg/L的愈伤分化培养基和加有潮霉素B 15、30、45 mg/L的繁殖培养基中。结果表明,2个品种甘蔗对潮霉素B的耐受性存在差异。新台糖22号的愈伤组织在潮霉素B浓度为45 mg/L时转绿率和成苗率分别为12.60%和5.20%;粤糖00-236转绿率和成苗率分别为36.17%和2.66%,2个品种绝大部分转绿的愈伤块都不能分化成苗。潮霉素B浓度为45 mg/L时,新台糖22号组培苗的死亡率为76.28%,勉强存活的苗生长受到严重抑制,苗矮小叶色黄;而粤糖00-236的组培苗死亡率已达92.6%,基本停止生长。因此,在甘蔗愈伤组织分化阶段和组培苗增殖阶段选择潮霉素B浓度45mg/L为适合的筛选浓度。

具有潮霉素B抗性的NIH3T3细胞饲养层的制备

目的建立具有潮霉素B(hygromycin B)抗性的3T3细胞系,用于转染目的基因(pTRE2 -human-Ins)的ES阳性细胞克隆筛选的饲养层。方法通过脂质体转染的方法,将含有潮霉素B 磷酸转移酶基因(hyg)的质粒pHyg导入NIH3T3细胞中,利用潮霉素B的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,并对其进行PCR和Southern blot鉴定。结果经300 μg／ml的潮霉素B压力筛选后,获得了抗性细胞克隆。抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出相应的核苷酸片段,Southern blot 鉴定结果表明潮霉素基因片段已整合入潮霉素抗性NIH3T3细胞。结论本实验通过脂质体介导的方法成功地培育了潮霉素B抗性的NIH3T3细胞,为进行目的基因(pTRE2-human-Ins)转染ES 细胞的阳性细胞克隆筛选打下了基础。

具潮霉素B抗性的NIH3T3细胞饲养层的制备

[目的]建立具有潮霉素B(hygromycinB)抗性的3T3细胞系,用于转染目的基因(pTRE2-human-Ins)的ES阳性细胞克隆筛选的饲养层。[方法]通过脂质体转染的方法,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因(hyg)的质粒pHyg导入NIH3T3细胞中,利用潮霉素B的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,并对其进行PCR和southernblot鉴定。[结果]经300ug/ml的潮霉素B压力筛选后,获得了抗性细胞克隆。抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出相应的核苷酸片段,Southernblot鉴定结果表明潮霉素基因片段已整合入潮霉素抗性NIH3T3细胞。[结论]本实验通过脂质体介导的方法成功地培育了潮霉素B抗性的NIH3T3细胞,为进行目的基因(pTRE2-human-Ins)转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选打下了基础。

以潮霉素B磷酸转移酶基因为遗传标记的启动子探针型载体的构建

用来自大肠杆菌的潮霉素Ｂ磷酸转移酶基因（ｈｙｇｒ）作为遗传标记构建了启动子探针型载体ｐＳＵＰＶ８，该基因的转录和翻译起始区以及５’－端编码区两个密码子均被除去，载体骨架为大肠杆菌质粒ｐＵＧＶ２。

G418和潮霉素B双重抗性小鼠胚胎干细胞饲养层的制备

通过脂质体转染的方法,先后将含有neo基因的质粒pWL/neo和含有潮霉素基因的质粒导入NIH3T3细胞中,利用G418和潮霉素B的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,经500μg/ml的G418和300μg/ml潮霉素B压力筛选后,获得了具有G418和潮霉素B双重抗性细胞克隆。抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异,用PCR法特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出对应的核苷酸片段。生长在双抗NIH3T3细胞饲养层上ES细胞基本保持正常ES细胞特征,成功地培育了G418和潮霉素双重抗性的NIH3T3细胞,为进行pTet-on和pTRE-H-Insulin目的基因电转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选打下了基础。

潮霉素B抗性基因在木醋杆菌中的整合表达

以质粒pSET152为出发载体,构建潮霉素B抗性基因的表达载体pSET152-HYG,通过大肠杆菌-木醋杆菌的属间接合转移将pSET152-HYG导入木醋杆菌,在位点特异性重组酶作用下潮霉素抗性基因B整合到木醋杆菌的染色体上。与出发菌株相比,重组菌株传代稳定,潮霉素抗性有了较大的提高,从100μg/mL提高到了400μg/mL以上,而产纤维素能力只略有下降。

抗潮霉素B的水稻原生质体的再生

本实验室构建的具有潮霉素Ｂ（ＨＰＴ）抗性基因、卡那霉素抗性基因（ＫａｎＲ）和虫萤光素酶基因（ＬＣＣ）的质粒ｐＴＨＬ２７ＤＮＡ，用聚乙二醇（ＰＥＧ）法导入到水稻广亲和品种０２４２８的原生质体细胞内．研究原生质体抗性筛选和原生质体再生的条件．结果，在含有２５μｇ／ｍｌ潮霉素Ｂ和１００ｎμｇ／ｍｌ卡那霉素的培养基ＫＰＲ和Ｎ６内连续处理４星期，可以很好地除去非转化的敏感的原生质体再生细胞，然后在无抗菌素选择压力的培养基中，转化细胞可再生成小植株．

潮霉素B预混剂的临床驱虫试验研究

为了解潮霉素B预混剂临床驱除绦虫线虫的有效性和给药时间的合理性,依据兽药临床试验规范,试验选择了蠕虫自然感染皖西麻黄鸡824只,按要求随机分为3组,分别为潮霉素B预混剂治疗组284只,芬苯哒唑粉对照药物组284只,不治疗的感染对照组256只,试验周期根据临床治疗效果确定。结果显示,潮霉素B预混剂,推荐剂量10 mg/kg混饲,连续饲喂21 d,对鸡蛔虫和绦虫的粗计驱虫率分别为63%和26%,表现明显的驱除蛔虫作用(P<0.05),连续饲喂42 d,对鸡蛔虫和绦虫的粗计驱虫率分别为100%和-13%,驱蛔虫效果极显著(P<0.01);对照药物芬苯哒唑粉,50 mg/kg混饲,连续饲喂6 d,对鸡蛔虫和绦虫的粗计驱虫率分别为100%和44%,同样具有极显著的驱除蛔虫作用(P<0.01),本试验中2种药物的驱蛔虫效果相当,对绦虫的驱除作用不明显(P>0.05)。潮霉素B预混剂10 mg/kg混饲,连续饲喂42 d,可以驱净鸡蛔虫的感染,但对鸡绦虫感染无明显的驱除作用。

潮霉素B在遗传转化中应用的研究进展

本文简介了潮霉素B及其他常见抗生素的作用机制,总结了近年来在遗传转化研究中用到的潮霉素B的筛选浓度及其体系,以期为后续相关研究中筛选体系的确定提供指导。

转基因及常规水稻幼苗对潮霉素敏感性的研究

研究了转基因及常规水稻幼苗叶面喷施潮霉素B溶液后的反应。结果发现,常规水稻吸收潮霉素B后,叶片会出现以褐斑为特征的中毒症状。在50～100mgL浓度范围内,褐斑的数目和面积随时间和浓度的增加而增加,溶液中滴加DMSO可提高潮霉素对稻苗的毒性。浓度在75mgL及以上时,喷后第7天,处理的所有幼苗都出现症状。而浓度在50mgL时,个别幼苗经处理后未出现中毒症状。在上述浓度范围内,带潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的Bt转基因水稻(克螟稻)幼苗均未出现中毒症状。苗期鉴定与抽穗前后成株期鉴定的结果相一致。讨论了叶面喷施潮霉素B溶液在转基因水稻育种和筛选潮霉素敏感转基因水稻突变体中的可能应用。

扣囊复膜孢酵母BGL1基因在工业酒精酵母中的整合表达

构建了含有工业酿酒酵母自身GPD2启动子和终止子、扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因(BGL1)和潮霉素选择性标记hyg的重组质粒pPIC-gpd-bgl-hyg,通过酵母染色体同源重组,将BGL1基因整合进入工业酒精酵母的染色体上。重组酵母可以在以纤维二糖为唯一碳源的培养基上生长,48h时β-葡萄糖苷酶酶活达到0.764U/mL。在玉米浓醪酒精发酵实验中,与宿主菌株相比,重组酵母醪液中纤维二糖含量减少约80%,达到了消耗醪液中纤维二糖含量的目的。

带有xyIE基因的EB病毒穿梭质粒PFD_(891)的构建

我们构建了一个以EB病毒为基础,以邻苯二酚氧化酶(XylE)基因为靶基因,以潮霉素B邻酸转移酶为转化细胞的选择标记基因的穿梭质粒。这种质粒既能在细菌中复制,又能在真核细胞中自主复制,并有较高的拷贝数,因而可以很容易地从真核细胞中分离出来。应用这一特点,可以研究基因突变和突变类型的形成机制,并建立一种化学物质诱变性的分子检测系统。由于我们采用的是XylE基因,反应底物价格便宜,又立足于国内,因此具有极大的推广应用价值。

转Bt基因玉米后代抗虫性快速鉴定技术研究初报

在玉米5～6叶期用1000、1250mg/L卡那霉素和500mg/L潮霉素B进行处理。结果表明,药后4d,不含Bt基因玉米的叶片出现明显的黄斑,而含Bt基因的玉米叶片无症状。田间抗虫鉴定,叶片无症状的玉米表现出不同程度的抗虫性,而叶片出现明显黄斑的玉米则表现出不抗虫。田间抗虫鉴定结果与潮霉素B的鉴定结果t检验未达到显著性差异,说明通过抗生素来鉴定转Bt基因玉米的方法可以在生产上应用。

表达荧光素酶报告基因稳定细胞系的建立及对CBLB502活性的检测

目的建立表达NF-κB-RE-luc2P荧光素酶报告基因的稳定细胞系以检测CBLB502的活性。方法利用脂质体转染试剂Lipofectin2000将含有NF-κB报告基因的质粒NF-κB-RE-luc2P转染入人胚肾细胞(HEK293细胞),并通过潮霉素B进行克隆筛选,最后挑取单克隆进行放大并应用荧光素酶检测方法进行鉴定。结果经200μg/ml的潮霉素B筛选,得到所需要的单克隆株,鉴定并保存。应用该潮霉素抗性单克隆细胞系对基于NF-κB信号通路的新型抗辐射蛋白药物CBLB502活性的检测显示出良好的量效关系。结论本实验通过Lipofectin2000转染法并在潮霉B筛选成功培育出稳定表达NF-κB报告基因活性的HEK293细胞系。

扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在工业酿酒酵母中的表达

以工业酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiaeY)为研究对象,针对其复杂的生理生化遗传特性,建立了相对应的转化体系。以pRS41H质粒为基础载体,构建了含有工业酿酒酵母自身的gpd2启动子、终止子和扣囊复膜孢酵母的β-葡萄糖苷酶基因bgl的重组质粒pRS-gb。电击转化进入工业酿酒酵母细胞,潮霉素抗性筛选,获得重组菌。该重组菌可以在以纤维二糖为唯一碳源的培养基中生长,培养36h,β-葡萄糖苷酶酶活达到0.967μ/ml。以纤维二糖为唯一碳源的酒精发酵中,酒精度可以达到0.92g/l。这对工业生产中利用纤维素为原料发酵生产酒精具有重要意义。

抗酸酵母遗传特性的初步研究

研究了酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）单倍体突变株YNN-27-24（atrpura）对乳酸抗性产生原因及其遗传特性。结果表明，该突变株对乳酸的抗性不是由于对环境条件的适应，而是由基因突变所致。通过对A13-18（alys）和YNN-27-24进行杂交得到的30株杂交子代的遗传特性进行分析可以看出，YNNM-27-24突变株对乳酸和潮霉素B（HygromycinB）的抗性，均由单基因控制，并且，该突变株抗L-乳酸与抗潮霉素B基因之间存在着非常紧密的连锁关系。

根癌农杆菌介导的深绿木霉菌T23遗传转化研究

采用根癌农杆菌介导的方法,成功地建立了丝状生防真菌深绿木霉(Trichoderma atroviride)菌株T23的遗传转化体系。并且,通过提高筛选培养基中潮霉素B的浓度和调整农杆菌的培养时间,对转化体系作了进一步的优化。转化效率约为50个突变体/107个分生孢子。所有转化子经继代培养5代,潮霉素B抗性筛选后,共得到118个遗传稳定的转化子。随机抽取部分转化子,进行PCR和Southern blot分子鉴定,结果证实外源的T-DNA已经随机整合到T23的基因组中。通过形态学观察,筛选出3个在产孢量和菌丝体生长速度方面显著不同于野生型菌株T23的转化子。农杆菌介导的遗传转化方法在深绿木霉菌株T23上的成功运用,将为研究该菌的功能基因组提供强有力的工具。

基因枪法遗传转化双孢蘑菇菌褶

以双孢蘑菇(Agaricus bisporus)2793为试材,采用基因枪法对其菌褶进行遗传转化,相对转化率为2.69%,转化子经PCR检测表明,外源潮霉素B抗性基因已经被转入到菌丝体中。