应用小动物活体激光共聚焦成像系统对大鼠腹壁循经组织组织液分布的初步观察

目的:初步观察探究活体大鼠腹壁循经组织的组织液分布特征和相关形态结构。方法:大鼠麻醉后尾静脉注射10%的荧光素钠溶液(0.1 ml/kg),注射30 min后剥离腹部皮肤,使用活体激光共聚焦成像系统观察腹壁组织不同深度的荧光素钠溶液分布及相关组织的形态结构特征。结果:荧光素钠注射30 min后,使用活体激光共聚焦成像系统观察到在大鼠腹壁正中线即任脉循行位置不同深度组织中的组织间隙较大,其中填充着大量混合荧光素钠的组织液,并分布有少量胶原纤维、毛细血管、脂肪细胞等实体组织。腹中线水平旁开5 mm和1 cm处的非经组织主要为实体组织,其组织中的间隙空间和组织液含量远远小于腹中线。新鲜腹壁组织冰冻切片显示,腹壁组织中存在大小不等、纵横交错且相互连接沟通的组织间隙,腹中线组织的间隙空间大于周围组织,这一结果与激光共聚焦图像特征吻合。结论:大鼠腹壁循任脉组织中存在比周围非经组织较大的组织间隙和较多的组织液。

大鼠腹内壁中线间质通道微观结构的活体激光共聚焦成像观察

为探究循经间质通道的微观结构,应用活体激光共聚焦成像系统对大鼠腹内壁腹中线,即循任脉间质通道荧光素钠聚积部位进行观察。通过使用荧光照相法对尾静脉注射荧光素钠的大鼠腹内壁表面的荧光素钠聚集轨迹定位,应用活体激光共聚焦成像系统观察腹内壁表面中线荧光素钠聚集轨迹上不同位点与旁开点组织的结构差异,并同离体组织的Masson染色结果比较。结果发现:腹内壁中线分布有大量与中线走行平行、有序排列的纤维组织,其中富含大量组织液;旁开为致密的肌纤维,表面的纤维排列不与中线平行。循任脉间质通道具有大量平行纤维结构分布的特征,为组织液向腹中线汇聚,并在循任脉间质通道中流动提供了组织形态学基础,为经络循行和结构的可视化提供了新的方法和证据,对于经络生物学内涵研究具有重要意义。

小鼠胰腺腺泡细胞钙振荡的激光共聚焦成像研究方法

目的:建立一种简易高效的成年小鼠胰腺腺泡细胞钙振荡的激光共聚焦成像研究方法。方法:取成年昆明小鼠胰脏,用胶原酶法急性分离得胰腺腺泡细胞,加荧光染料fluo-4-AM标记胞内钙;以乙酰胆碱(ACh)为兴奋剂作用于胰腺腺泡细胞,激光扫描共聚焦显微镜发射488 nm激光并同步、实时、动态地记录此过程中胰腺腺泡细胞产生的钙振荡。结果:1一定浓度的ACh(如100 nmol/L)可稳定地激发胰腺腺泡细胞产生典型钙振荡,且此钙振荡可被阿托品完全阻断;2胞浆内不同部位的钙振荡有强弱不同,但呈同步变化节律;而不同细胞间的钙振荡强弱和节律往往不同;3钙振荡的幅度和节律与Ach具有剂量依赖效应。结论:小鼠胰腺腺泡细胞钙振荡的激光共聚焦成像研究方法简单易行、直观形象、高效、灵活,可作为常规方法使用,具有良好的应用前景和推广价值。

应用激光扫描共聚焦显微成像术研究光敏剂亚细胞定位

目的应用激光扫描共聚焦显微成像系统及荧光定量分析方法,探讨血卟啉单甲醚(HMME)在靶细胞亚细胞结构中的精确定位及定量分析的可行性。方法将传代培养的鼠肺内皮细胞与HMME共同孵育24h。应用激光扫描共聚焦显微成像系统,选择特异性细胞器荧光探针若丹明(rhodamine)-123、荧光素黄(luciferyellow)、DiOC6(3)和BODIPY分别标记细胞内线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体。采取不同的采集顺序激发染色细胞样品,通过预先设置的相应的发射滤光片分别采集细胞内HMME与细胞器探针的荧光图像。通过计算机图像处理,采用像素-荧光强度分析方法对光敏剂进行亚细胞定位。结果采用先激发探针后激发HMME的顺序,HMME及荧光探针的荧光强度及形态特征保持较好;细胞质与细胞核内HMME平均荧光光强差异有显著意义,前者是后者的2倍以上;HMME在4种细胞器区域平均荧光光强与细胞平均荧光光强(J1/J2)比值的差异有显著意义;随参数m的增高,HMME在4种细胞器区域J1/J2比值呈下降趋势。结论HMME在细胞内线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体均有分布;应用激光共聚焦显微成像系统结合荧光定量分析法能对荧光效率极低的光敏剂进行精确的亚细胞定位及分布定量比较。

二次离子质谱-激光扫描共聚焦显微镜联用对单细胞显微成像-原理及应用

二次离子质谱(SIMS)分析主要用于半导体、地质等领域材料表面分析,随着科学仪器技术的发展,近年来,SIMS在生命科学领域中得到了越来越广泛的应用。SIMS可以实现对样品表面的质谱分析、化学成像以及深度剖析。三维SIMS成像分析的横向分辨率可达80~100 nm,纵向分辨率1~5 nm。但是,由于缺少特异性指示亚细胞结构的碎片离子,单细胞SIMS成像分析仍然面临着诸多挑战。激光扫描共聚焦显微成像(LSCM)作为一种单细胞成像技术已日趋成熟,可以对单细胞中的荧光分子或者对荧光标记的目标分子、细胞器成像,获得高分辨率亚细胞结构成像图。因而,LSCM在单细胞形貌分析上的优势和SIMS在单细胞化学成像方面的优势可以有效互补,其联合应用能显著提升单细胞分析的应用范围、深度和结果的准确性。本文重点介绍SIMS成像以及SIMS-LSCM联用成像在单细胞成像研究中的应用进展,在总结、评述该领域代表性工作的同时,对SIMS-LSCM联用成像在化学和生命科学研究,特别是在细胞生物学和药物发现领域的应用前景进行了展望。

双波长激光共聚焦生物芯片扫描仪的研制

生物芯片扫描仪是生物芯片技术应用中的关键仪器,激光共聚焦成像的原理,着重介绍一种光学扫描和机械扫描相结合的双波长激光共聚焦生物芯片扫描仪,在保证分辨力、灵敏度等重要性能指标的前提下提高了扫描速度和扫描效率,最后对系统性能做了简要分析。

激光共聚焦显微镜样品制备方法(二)——组织切片样品

应用激光共聚焦显微镜技术对荧光标记的组织切片样品进行三维观察成像是生物学研究的常规手段。本文主要介绍实验室制备用于激光共聚焦显微镜成像的冷冻组织切片及免疫荧光标记过程。

新兴内镜成像技术在早期食管癌诊断中的应用进展

内镜成像技术是目前临床应用最广的早期食管癌诊断方法,白光内镜下取病理组织活检是早期食管癌诊断的金标准。伴随内镜技术的不断发展,涌现了化学染色内镜(DCE)成像技术、虚拟色素内镜(VCE)成像技术、放大内镜(ME)成像技术、激光共聚焦内镜(CLE)成像技术、细胞内镜(EC)成像技术、容积激光内镜(VLE)成像技术及自体荧光内镜(AFE)成像技术等多种新兴内镜成像技术。DCE成像技术、VCE成像技术可突出显示食管黏膜表面结构及血管纹理可视化效果,已经广泛用于早期食管癌的筛查及诊断中;ME成像技术可清晰显示食管上皮乳头内毛细血管袢,对早期食管癌浸润深度的诊断效能较高;基于CLE成像技术开发的pCLE内镜检查系统诊断巴雷特食管异型增生的特异度较高;EC成像技术联合人工智能对食管鳞癌的诊断效能较高;VLE成像技术的扫描深度可达黏膜及黏膜下层,对诊断早期食管癌及其分期具有一定的优势;AFE成像技术与其他成像技术联合应用可降低其诊断早期食管癌的假阳性率。

比率型过氧化氢荧光探针的合成及成像应用

以6-甲氧基苯并噻唑-2-羟基喹啉为双光子荧光团、硼酸酯为过氧化氢(H_(2)O_(2))识别基团,合成了比率型检测H_(2)O_(2)的双光子荧光探针{6-甲氧基-2-[6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)喹啉-2-基]苯并[d]噻唑}(MQH_(2)O_(2))。利用^(1)HNMR、^(13)CNMR、HRMS确定了其结构,利用荧光光谱和双光子荧光光谱对探针MQH_(2)O_(2)进行了H_(2)O_(2)响应能力的评估。结果表明,探针MQH_(2)O_(2)具有良好的H_(2)O_(2)比率[30 min内比率(I_(535)/I_(465),其中,I_(535)和I_(465)分别为波长为_(535)和_(465)nm处的荧光强度)响应信号比未加H_(2)O_(2)增强约25.4倍、检出限低至38.6nmol/L]和双光子性质(最大双光子荧光活性截面为150 GM)。通过双光子共聚焦成像完成了细胞和大脑组织成像。该探针能够实现脑卒中诱导细胞氧化应激的原位成像分析。

聚甲基丙烯酰胺包覆的ZnO发光量子点及其在细胞成像中的应用

通过溶胶-凝胶法合成了在水溶液中稳定发光、荧光颜色可调的ZnO@polymer核壳型纳米粒子,并研究了这种量子点对人类宫颈癌HeLa细胞的毒性以及细胞吞噬后激光共聚焦成像的效果.这种荧光探针的外壳是一种通过配位键与ZnO内核结合的共聚物,该共聚物外层是亲水的聚甲基丙烯酰胺,内层是疏水的聚甲基丙烯酸酯.细胞毒性实验证明,该材料有良好的生物兼容性,适用于生物荧光标记.共聚焦荧光成像结果显示,这些纳米粒子可以穿透HeLa细胞膜并在细胞质中稳定发光.

激光共聚焦显微成像技术对亚细胞位点光动力损伤的动态观察

目的探讨应用激光共聚焦显微成像技术对光动力效应所致亚细胞位点损伤进行动态观察的可行性。方法实验分为HMME+Rhodamine123组、单加HMME组、单加Rhodamine123组和单纯细胞组,后3组作为对照组。传代培养鼠肺毛细血管内皮细胞,将血卟啉单甲醚(HMME)与内皮细胞共同孵育24h后,加入细胞探针Rhodamine123对线粒体进行染色。应用激光共聚焦显微镜并采用细胞器细胞荧光强度比值法对HMME进行亚细胞定位,随后采集Rhodamine123的荧光图像动态序列。结果HMME+Rhodamine123组的Rhodamine123荧光图像在光照过程中逐渐发生变化:典型的线粒体形态特征逐渐消失,并伴有荧光强度下降,荧光在胞浆内趋于弥散分布,细胞核内出现Rhodamine123的荧光;而单加Rhodamine123组的Rhodamine123荧光图像未发生明显变化。结论应用激光共聚焦显微成像技术能实现亚细胞水平光敏损伤位点的动态光学检测,线粒体和核膜可能是HMME介导的光动力损伤亚细胞位点。

光谱成像技术在木材改性研究领域的应用进展

木材改性技术是木材提质增效的主要手段。改性剂筛选、改性工艺优化以及改性机理解析等都离不开先进的表征分析技术。光谱成像技术将光谱分析技术与显微成像技术相结合,能够精确表征样品物理化学结构,甚至微观性能,已成为木材改性研究的重要工具。针对近年来光谱成像技术在木材改性研究领域的应用现状,本文主要从红外光谱成像、拉曼光谱成像和激光共聚焦显微成像技术等方面进行了综述,并对此类技术在木材改性研究领域的应用前景进行了展望。

骨细胞在骨骼系统中的调控作用

封面图为骨细胞的高分辨率激光共聚焦成像,其细胞体呈梭形或类圆形,且有大量向外延伸的突触。骨细胞是骨骼中的重要调控细胞,由成骨细胞在矿化过程中分化而来,通过突触网络相互连接,形成骨细胞突触网络。骨细胞突触网络调控着破骨细胞介导的溶骨和成骨细胞介导的成骨,在骨稳态的维持中扮演着重要作用。骨细胞相关的病变会引起骨骼系统的衰老和破坏,引起骨质疏松、肌肉萎缩以及骨髓稳态失调等。

活性氧参与一氧化氮诱导的神经细胞凋亡

采用激光共聚焦成像技术 ,用氧化还原敏感的特异性荧光探针 (DCFH DA和DHR12 3)直接研究了一氧化氮供体S 亚硝基 N 乙酰基青霉胺 (SNAP)诱导未成熟大鼠小脑颗粒神经元凋亡过程中的细胞胞浆、线粒体中活性氧水平的变化 ,发现神经细胞经 0 5mmol/LSNAP处理 1h后 ,细胞胞浆及线粒体中活性氧水平大大增加 .一氧化氮清除剂血红蛋白能够有效抑制细胞胞浆、线粒体中活性氧的产生 ,防止细胞凋亡 .外源性谷胱甘肽对细胞也具有良好的保护作用 ,而当细胞中谷胱甘肽的合成被抑制后 ,一氧化氮的神经毒性大大增强 .实验结果表明一氧化氮通过促进神经细胞产生内源性活性氧而启动细胞凋亡程序 ,而谷胱甘肽可能是重要的防止一氧化氮引发神经损伤的内源性抗氧化剂 .

植物细胞过氧化氢的测定方法

过氧化氢是重要的活性氧之一,激素等发育信号和胁迫刺激可以诱导细胞内H2O2的产生和积累,继而调控植物的气孔运动、生长发育、衰老和逆境应答等诸多生理过程。准确测定植物细胞内H2O2的含量及变化模式是系统研究H2O2信号转导及其生物学功能的一个关键技术。该文以拟南芥为实验材料,介绍了目前植物细胞H2O2的主要测定方法,包括激光共聚焦显微检测、紫外分光光度计检测和DAB组织染色,在此基础上比较分析了上述方法在灵敏度、检测范围、定量、成本以及耗时等方面的差异,为相关研究选择合适的H2O2检测技术提供参考。

Caspase-3参与调控蟾酥诱导人肺腺癌(ASTC-a-1)细胞的凋亡

采用基因质粒转染技术、荧光发射谱检测分析以及荧光共振能量转移(FRET)受体光漂白技术,首次在活细胞中实时检测中药蟾酥(Chan-Su,CS或bufonis venenum)诱导人肺腺癌(ASTC-a-1)细胞凋亡过程中caspase-3的活化特性.采用CCK-8(Cell Couneing Kit-8)技术检测发现,蟾酥对细胞的活性具有显著的抑制作用;蟾酥处理稳定表达FRET质粒SCAT3的人肺腺癌细胞后,在不同的时间检测活细胞中SCAT3的荧光光谱;利用共聚焦扫描荧光显微成像技术检测蟾酥处理后细胞的形态,从而进一步证实蟾酥诱导细胞凋亡.实验结果表明:a.蟾酥可以有效抑制人肺腺癌(ASTC-a-1)细胞的增殖活性并诱导细胞的死亡.蟾酥对细胞的抑制作用具有剂量依赖性;b.蟾酥处理细胞6h后能检测到明显的细胞凋亡小体,连续作用24h后细胞全部皱褶,并有部分细胞破碎;c.蟾酥作用细胞2h就能明显切割细胞内的SCAT3,细胞内SCAT3的切割程度随着蟾酥作用时间的延长而增加,24h内细胞内的SCAT3完全被切割.受体光漂白实验也证实了该结论,表明caspase-3参与调控了蟾酥诱导的细胞凋亡过程.

无机硅壳类纳米颗粒对细胞的毒性检测

采用MTT分析方法结合激光共聚焦荧光显微成像系统研究了无机硅壳类纳米颗粒,包括无机二氧化硅纳米颗粒(SiNP)、二氧化硅壳荧光纳米颗粒(FSiNP)以及二氧化硅磁性纳米颗粒(MSiNP)对COS-7细胞、HNE1细胞和MCF-7细胞的毒性.研究结果表明:在有效浓度范围内,无机硅壳类纳米颗粒具有很好的生物相容性,对细胞的生长和代谢没有明显的影响,从而为无机二氧化硅纳米颗粒在生物医学中的应用提供了坚实的理论依据.

几种鬼臼毒素制剂局部外用的动物实验研究

目的:观察鬼臼毒素脂质体皮肤外用时的释药方式和药物在皮肤中的滞留量。方法:以鬼臼毒素二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）脂质体和大豆卵磷脂脂质体进行动物试验,即以相同浓度的鬼臼毒素酊剂及2种鬼臼毒素脂质体悬液涂于幼猪的皮肤上,用激光共聚焦显微成像仪观察不同制剂的鬼臼毒素在皮肤中的滞留量。结果:DPPC脂质体所包裹的鬼臼毒素在表皮及真皮的浅层滞留量大,48小时内药物浓度一直明显高于鬼臼毒素酊剂及鬼臼毒素大豆卵磷脂脂质体。结论:DPPC脂质体包裹鬼臼毒素外用具有更好的皮肤靶向性,是较好的皮肤外用制剂。

姜黄素眼用脂质体的角膜透过性研究

目的:研究姜黄素眼用脂质体的角膜透过性。方法:采用乙醇注入法制备姜黄素脂质体,以三甲基壳聚糖对脂质体囊泡进行包覆;采用过膜法、粒径及电位测定仪对脂质体进行理化性质分析;采用离体兔角膜透过实验及共聚焦激光扫描显微镜成像技术,对三甲基壳聚糖包覆的脂质体的角膜透过作用进行研究。结果:三甲基壳聚糖对脂质体的包覆对脂质体的包封率无明显影响,但粒径、电位有所增大,同时角膜透过显著高于未包覆脂质体组,随着作用时间的延长,可促进脂质体囊泡渗透至角膜上皮深层60μm处,并主要以细胞旁路途径发生角膜透过。结论:该研究表明三甲基壳聚糖对脂质体囊泡具有明显的角膜促透作用。

MTB和BCG诱导中性粒细胞胞外捕获网形成方法的建立

目的建立结核分枝杆菌和卡介苗体外诱导中性粒细胞胞外捕获网形成的方法,为研究中性粒细胞胞外捕获网对结核分枝杆菌的影响提供基础。方法分离健康志愿者外周血中性粒细胞,7H9液体培养结核分枝杆菌标准菌株(mycobacterium tuberculosis,MTB)和卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG),RPMI-1640培养基共培养中性粒细胞和细菌(MTB、BCG)。免疫荧光染色和激光共聚焦显微成像观察NETs生成;Pico Green^■染料定量检测上清游离DNA,反映NETs生成量。结果结核分枝杆菌和卡介苗体外刺激中性粒细胞均可产生大量胞外网状结构,包含DNA、组蛋白(H3Cit)和髓过氧化物酶(MPO),结核分枝杆菌诱导NETs形成的效率明显高于卡介苗。结论成功建立结核分枝杆菌体外诱导NETs的方法,为进一步研究中性粒细胞在抗结核中的作用提供基础。