解淀粉芽孢杆菌PB-1对灰葡萄孢的抑菌机理

为筛选灰葡萄孢(Botrytis cinerea)高效生防菌株,对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株PB-1从抑菌谱、发酵液的抑菌作用、抗生素合成基因PCR检测、挥发性物质(VOC)的抑菌作用、离体叶片防效几个方面进行研究。研究结果表明,PB-1的抑菌谱较广,对8种供试植物病原菌菌丝生长均有抑制作用,其中对灰葡萄孢(B.cinerea)、新月弯孢霉(Curvularia lunata)、大斑凸脐蠕孢(Exserohilum turcicum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)4种病原真菌具有较强的抑制作用,抑菌率分别为63.5%、70.7%、63.4%、56.0%。PB-1发酵液不仅对灰葡萄孢菌丝生长具较强抑制作用(20%浓度发酵液抑菌率达96.6%,受抑制菌丝肿胀扭曲、原生质外渗、分枝异常),而且对分生孢子萌发也具有强烈抑制作用。抗生素合成基因PCR检测发现,PB-1扩增出srfAB、ituA基因片段,这说明PB-1能够产生表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturins)脂肽类抗生素。PB-1挥发性物质对灰葡萄孢菌丝生长也具有明显抑制作用。此外,小白菜品种上海青离体叶片防病效果检测发现,PB-1能明显抑制灰葡萄孢的侵染。本研究结果表明,PB-1有作为植物灰霉病生物防治菌剂的潜力。

灰葡萄孢寄生菌Clpse01的杀线活性研究

在用灰葡萄孢菌Botrytis cinerea培养松材线虫的过程中,发掘了一株具有杀线活性的灰葡萄孢寄生菌Clpse01。本文在光学显微镜下对菌株Clpse01的形态和其对灰葡萄孢菌的生长影响进行了观察;采用ITS4/ITS5、LR5/LR0R、Bt2a/Bt2b和EF1-688F/EF1-1251R引物进行了分子生物学鉴定;同时测试了菌株Clpse01对松材线虫的杀线活性及对松材线虫卵孵化能力和繁殖能力的影响;最后测试了菌株Clpse01的胞外蛋白浓度,胞外β-葡萄糖苷酶活性和胞外几丁质酶活性。根据形态学和分子生物学结果,将菌株Clpse01鉴定为假卡鲁卡枝惠霉Clonostachyspseudochroleuca。菌株Clpse01可以缠绕、侵入灰葡萄孢菌的菌丝以获得营养来源,使灰葡萄孢菌的菌丝生长受到抑制。将2000条松材线虫接种到长满菌株Clpse01的培养基上,8 d后仅分离出6条/皿活线虫,而对照灰葡萄孢菌培养基上分离的线虫数为33066条/皿活线虫;菌株Clpse01发酵液处理松材线虫48 h后的校正死亡率为88%,浓度为1×108孢子/mL的孢子悬液处理松材线虫24 h后的校正死亡率为88.33%;菌株Clpse01 2×稀释发酵液24 h对卵的孵化抑制率为100%。发酵培养6 h后,菌株Clpse01胞外蛋白浓度为1782.917μg/mL,胞外β-葡萄糖苷酶为9.99 U/mL,胞外几丁质酶含量为0.8792U/mL,并随发酵时间推移而升高。菌株Clpse01通过寄生松材线虫的食物来源灰葡萄孢菌和影响松材线虫的繁殖、存活和卵的孵化起作用,胞外β-葡萄糖苷酶、几丁质酶是毒杀松材线虫的两个重要生理因子。

生防真菌T1-3的筛选、鉴定及对灰葡萄孢菌的拮抗作用研究

为筛选能拮抗灰葡萄孢菌的真菌菌株作为灰霉病生物防治的菌株资源储备,从番茄的根际土壤中筛选得到一株对灰葡萄孢菌具有拮抗作用的真菌,通过形态学和分子生物学对其进行了鉴定,并对其拮抗机制进行了研究.结果表明,菌株T1-3为一株长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum),其生长速率较病原菌快,对病原菌的抑菌率为87.75%;其无菌发酵滤液对病原菌的抑制率为84.75%,另对病原菌孢子萌发抑制率为80.51%,具有明显的抑制作用;且菌株T1-3生长过程中能够产生果胶酶和淀粉酶.长枝木霉T1-3具有良好的生防潜力和应用前景.

放线菌LA-5主要抑菌成分及对灰葡萄孢的抑制作用

灰葡萄孢引起的灰霉病是葡萄采后重要病害之一。为筛选拮抗葡萄灰霉病的生防菌并明确其主要抑菌成分,本研究采用生长速率法分析了拮抗链霉菌LA-5发酵提取物的抑菌活性,测定了菌株LA-5发酵液提取物拮抗活性和稳定性,利用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析了代谢产物的主要成分。结果表明,LA-5发酵提取物对灰葡萄孢具有明显的抑制作用,其对灰葡萄孢的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MFC)分别为9和14 mg·L^(-1)。LA-5发酵液提取物耐高温、酸和紫外照射,对病原菌具有较稳定的拮抗活性。GC-MS分析结果显示,LA-5发酵液中的主要活性成分有17种,其中邻苯二甲酸二丁酯(DBP)含量高达52.87%。DBP对灰葡萄孢菌丝生长及分生孢子萌发均具有强烈的抑制作用。本研究为灰霉病的生物防治提供了理论基础。

灰葡萄孢霉菌产脱落酸发酵工艺优化

脱落酸(S-abscisic acid,S-ABA)是五大植物生长调节剂之一,现代农业广泛使用于农业生产,具有增强植物抗逆胁迫,保花保果,促进果实转色、增糖降酸等诸多功能。多种植物病原真菌可以合成,现广泛应用于生产的为灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea),该文以使用响应面分析方法,考察碳氮比、初始pH、CaCO 3质量浓度、搅拌转速、通气条件、接种量等关键营养条件和工艺条件对Botrytis cinerea菌体形态和产S-ABA的影响。确定最佳发酵条件为:碳氮比25、搅拌强度535 r/min、初始pH 5.1、接种量11%、通气量1.0 vvm,最佳菌丝球尺寸0.95 mm。此条件下S-ABA产量提升了约8.23%。

葡萄致腐菌灰葡萄孢及其拮抗菌贝莱斯芽孢杆菌的分离鉴定

分离筛选出对葡萄致腐菌灰葡萄孢有较强拮抗作用的拮抗菌,丰富葡萄采后保鲜拮抗菌资源,以期为葡萄灰霉病的生物防治提供理论依据和奠定应用基础。利用组织块分离法在腐烂的葡萄果实中分离得到灰葡萄孢,梯度稀释法从葡萄园土壤中分离得到潜力拮抗菌,通过平板对峙及琼脂扩散法筛选出拮抗作用较强的生防菌,并通过形态学观察、生理生化测定、生物学鉴定确定其种属。通过对拮抗菌进行溶血性测定初步探索其是否对人体有溶血作用。分离得到的葡萄致腐菌通过形态学观察,病原菌PH-23菌丝初期呈灰白色,继续培养会逐渐转变为淡淡的青灰褐色,菌丝繁盛,孢子众多。对病原菌PH-23进行ITS、β-tub序列分析,结合形态学特征确定其为灰葡萄孢。致病力测定结果表明,PH-23接种后葡萄症状与葡萄灰霉病症状相符,腐烂严重。筛选得到对葡萄致腐菌PH-23拮抗作用较强的生防菌TP-1,抑菌圈直径为22.49 mm。通过形态学观察,菌体为杆状,芽孢呈椭圆形,大小为0.62μm×2.35μm。TP-1革兰氏染色阳性。生理生化鉴定结果初步认为TP-1为芽孢杆菌。基于16S rDNA基因、rpoB基因、gyrB基因序列分析确定其为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。拮抗菌TP-1的溶血性测定显示其对人体无溶血作用。拮抗菌TP-1对灰葡萄孢有较强的拮抗作用,在葡萄采后贮藏及生物保鲜中具有潜在的应用价值。

灰葡萄孢菌BcGLS基因的克隆、生物信息学分析及逆境胁迫下转录表达分析

β-1,3-葡聚糖合成酶(β-1,3-glucan synthase,GLS)催化合成的细胞壁核心组分β-1,3-葡聚糖对真菌的生存和毒力至关重要,该酶是研发抗菌药物的重要作用靶点。为了了解β-1,3-葡聚糖合成酶基因(BcGLS)在灰葡萄孢菌生存和侵染进程中的功能,该研究通过克隆获得BcGLS全长序列,序列全长7137 bp,编码1932个氨基酸,生物信息学分析结果显示,其编码蛋白(BcGLSp)理论相对分子质量为220.05 kDa,理论等电点为7.97;亚细胞预测其定位于细胞膜,存在17个跨膜结构,不存在信号肽,为非分泌蛋白;含有176个磷酸化位点,为亲水性蛋白。保守结构域分析结果表明,BcGLSp含有一个β-1,3-葡聚糖合成酶结构域和一个β-1,3-葡聚糖合成酶亚基FKS1,属于葡聚糖合成酶超家族。系统进化分析表明,灰葡萄孢菌BcGLS与植物致病菌如山茶叶杯菌、景天白粉菌等的葡聚糖合成酶亲缘关系近。不同逆境胁迫条件(氯化钠、十二烷基硫酸钠、过氧化氢)显著抑制灰葡萄孢菌菌丝生长,实时定量PCR进一步分析显示BcGLS在不同非生物胁迫条件下均上调表达,表明BcGLS基因的转录表达与环境压力密切相关。该研究为深入探讨BcGLS在灰葡萄孢菌生存和侵染进程中的基因功能和灰葡萄孢菌的新型防治策略提供理论材料和实践依据。

不同百合品种的花和叶片对灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的抗性评价

评价不同百合品种叶片和花对灰霉病的抗性,分析叶片和花的灰霉抗性相关性,以期为评估百合对灰霉病的抗性及百合抗病育种提供支持。以A、O、L、LA和OT等5个系列的28个百合品种为材料,利用分离鉴定的灰葡萄孢菌,采用离体菌丝块直接接种和刺伤接种法,对百合的叶片和花瓣进行灰霉病抗性评价,并根据叶和花的病斑直径进行相关性分析。结果表明,同一品种百合叶片对不同灰葡萄孢菌株抗性存在差异,不同品种间百合叶片的抗性差异较大。其中白色帝王和眼线这2个品种属于高感品种;红星、丝雨、桃色事件等8个品种属于易感品种;地魔星、秘密之吻、穿梭等7个品种属于中抗品种;索邦、微微安娜、布林迪西等6个品种属于高抗品种;依兰、西伯利亚、俯视等5个品种属于免疫品种。对叶片进行刺伤,可导致灰霉菌侵染性增强。花瓣接种结果显示大部分百合花瓣比叶片更容易受到侵染,但是百合花和叶片对灰葡萄孢的敏感性没有显著相关性;红星、丝雨、桃色事件等13个品种的花和叶对灰葡萄孢菌的敏感性一致;地魔星、秘密之吻、布林迪西等14个品种的花比叶对灰葡萄孢菌更敏感;白色帝王的叶片较花对灰葡萄孢菌更敏感。组织损伤会降低百合对灰霉病的抗性,百合叶片与花对灰霉菌敏感性无显著相关性。依兰、微微安娜、西伯利亚和红色宫殿4个高抗品种可为百合灰霉病抗性资源合理利用以及品种选育提供参考。

灰葡萄孢全基因组效应因子的预测与分析

为了对灰葡萄孢全基因组效应因子进行预测筛选,本研究利用SignaIP 5.0、TMHMM、ProtComp 9.0等软件和预测程序对已经公布的灰葡萄孢全基因组筛选出具有分泌功能的蛋白;再对筛选出的分泌蛋白的半胱氨酸含量、信号肽长度及冗余性进行分析,最后使用EffectorP 3.0进行最终预测和表达差异分析,结果表明,从灰葡萄孢中筛选出109个候选效应因子和101个分泌蛋白。为了进一步探究筛选的候选效应因子的功能,本研究利用SMART预测109个候选效应蛋白的功能结构域以及侵染转录组数据分析,结果发现,候选效应因子均有信号肽,并选出持续高表达的候选效应基因Bcin04g03920和Bcin02g04350,验证发现其具有分泌功能。本研究从灰葡萄孢全基因组筛选获得了效应蛋白和分泌蛋白,为揭示灰葡萄孢的侵染机制奠定了重要基础。

拮抗灰葡萄孢菌乳酸菌的筛选与鉴定

灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)是导致果蔬腐败的主要病原菌之一。乳酸菌因为安全、无毒且具有一定的抗菌作用,在抑制果蔬腐败病原菌方面具有一定的潜在价值。鉴于此,文章期望从发酵食品和常见水果表面分离并筛选出抑制灰葡萄孢菌活性的乳酸菌,结果发现有10株乳酸菌对灰葡萄孢具有抑菌活性。经鉴定,3株(JZ a1、MJ a2、PS b1)为Limosilac tobacillus fe rme ntum,2株(ZLJ、MDF b)为Lactobac illus pentosus,MHT b为Lactobacillus ac idophilus,4株(SCb1、MJ a、MDF a、MHT a1)还有待进一步鉴定。文章为开发果蔬生物保鲜剂提供了实践基础与理论支撑。

氟吡菌酰胺与咯菌腈混配对灰葡萄孢菌的联合毒力及药效评价

筛选氟吡菌酰胺和咯菌腈对灰葡萄孢菌的增效组合。通过菌丝生长抑制法测定两种药剂之间的最佳配比组合,并通过离体叶片法和田间药效试验验证最佳配比。氟吡菌酰胺与咯菌腈以质量比为3:1、2:1、1:1、2:3、1:2、2:5和1:3的比例进行混配时,其对灰霉菌生长抑制的增效系数都大于1.5,表现明显的增效作用,其中以质量比为2:3的组合增效作用最强。30%氟吡菌酰胺·咯菌腈SC(2:3)用量在25~35 mL/666m^(2)时,离体叶片法和大田试验中均表现出了优异的防治效果。30%氟吡菌酰胺·咯菌腈SC配比为2:3时,对番茄灰霉病有极佳的防控效果,推荐剂量为25~35 mL/666m^(2)。

ARTP诱变灰葡萄孢霉筛选高产脱落酸菌株

目的:利用常压室温等离子体(Atmospheric Room Temperature Plasma,ARTP)技术对生产脱落菌的潜力宿主灰葡萄孢霉进行诱变,以获得遗传稳定性好的高产脱落酸的突变菌种。方法:利用酶解法去除灰葡萄孢霉细胞壁,从而获得灰葡萄孢霉原生质体。接着将灰葡萄孢霉原生质体在输出功率120 W,工作气流10 L/min,照射距离2 mm,照射时间120 s的条件下进行ARTP诱变处理。检测突变菌株的脱落酸产量,并对最佳突变菌株进行发酵优化。结果:与野生型相比,突变菌株的脱落酸生产能力有了不同程度的提高,其中突变菌株A4和A7的脱落酸生产能力显著提高,分别提高了26.3%和30.5%。进一步通过单因素实验,确定突变菌株A7的最佳发酵碳源和氮源成分为葡萄糖和黄豆粉,最佳接种量为8%。结论:采用ARTP诱变技术能够有效获得高产脱落酸的突变菌株,为脱落酸的工业化生产提供了有利支撑。

灰葡萄孢霉菌产脱落酸工艺优化

灰葡萄孢霉菌是一种重要的病原真菌,其生物学特征对ABA合成具有重要影响。利用CRISPR/Cas9等基因降低ABA合成途径中关键酶,可提高ABA含量和纯度。笔者探讨了利用代谢工程技术调控灰葡萄孢霉菌的代谢网络,实现对其代谢通路的改造与优化,提升其合成代谢能力。通过用反应曲面方法(RSM)对基质组成进行优化,并通过调控温度、pH值、溶氧等参数,对ABA的生物合成进行优化。在此基础上,改进灰葡萄孢霉菌发酵工艺,使其在ABA合成中的含量及纯度得到显著提高,同时也可降低生产成本,拓展灰葡萄孢霉菌的使用范围。

汉防己甲素对5种植物病原真菌的抑制作用及对灰葡萄孢的作用机制初探

为寻找环境友好型的农药先导化合物,利用菌丝生长速率法研究了粉防己中汉防己甲素对常见植物病原真菌的抑制活性,结果表明,汉防己甲素对5种常见植物病原真菌均有抑制作用,对立枯丝核菌的抑制作用最强,EC_(50)为33.49 mg/L;对串珠镰孢和瓜类黑腐球壳菌的EC_(50)分别为41.71 mg/L和43.97 mg/L,抑制活性优于对照植物源药剂蛇床子素;对灰葡萄孢的抑制活性与蛇床子素相当。接种蓝莓离体叶片的试验结果表明,汉防己甲素对蓝莓灰霉病具有治疗和保护作用且作用效果与对照药剂蛇床子素基本相当;激光共聚焦显微镜检测发现汉防己甲素可降低灰葡萄孢菌丝内钙离子浓度,汉防己甲素分别与CaCl_(2)及钙通道阻滞剂维拉帕米两者相互作用可降低灰葡萄孢对各药剂的敏感性,表明其作用机制与钙离子及钙离子通道有关。本文首次报道汉防己甲素对5种植物病原真菌的抑制作用及其作用机制,为其进一步的开发应用提供理论基础。

膜醭毕赤酵母挥发性物质对灰葡萄孢菌的抑菌活性及组分分析

为探究膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)对采后灰葡萄孢菌的抑菌机制,该研究对其挥发性物质进行了抑菌活性与抑菌机制分析。结果表明,灰葡萄孢菌被挥发性物质熏蒸48 h时,菌丝长势明显受阻,抑制率高达72.41%,其产孢量始终低于空白组(P<0.05)。经熏蒸后72 h,菌丝体细胞膜内核酸、蛋白质的大量外泄(P<0.05)改变了细胞膜的通透性,同时,通过扫描电镜观察到处理过的菌丝表面出现干瘪、皱缩甚至部分菌丝胞内的内容物渗漏。有伤接种实验证明熏蒸处理的番茄果实病斑直径仅为(1.47±0.16)cm,显著低于空白对照组。利用顶空固相微萃取-气质联用法(headspace solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)分离鉴定到20种挥发性物质,主要组分为醇类(39.26%)、酮类(24.72%)和有机酸类物质(8.51%)。上述结果为研究酵母菌防控采后果蔬腐烂提供了理论依据,为生防菌的安全防腐策略提供新思路。

灰葡萄孢菌两种发酵粗提物对烟蚜的杀虫活性初步研究

用浸渍法测定灰葡萄孢菌的固体和液体发酵粗提物对烟蚜的触杀活性。结果表明:液体和固体的发酵产物对烟蚜都有杀虫活性,且固体发酵产物的触杀活性大于液体发酵产物,30 h后的LC50分别为0.4836 mg/mL和3.8036 mg/mL。

人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑敏感基线的建立及抗药性监测

为了解人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的抗药性情况,采用菌丝生长速率法测定了人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感性,采用最小抑菌浓度法监测人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的抗药性。结果表明:氯氟醚菌唑对供试的148株人参灰葡萄孢菌株的EC_(50)值为0.008 4~2.795 8 mg/L,其敏感性频率分布呈连续单峰曲线,经K-S法检验符合正态分布,未出现敏感性明显下降的抗药性菌株群体,EC50平均值为0.174 4 mg/L,可作为人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感基线;不同地区来源、不同年份分离的人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的敏感性差异显著(P<0.05);所检测的人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的抗药性水平多数为敏感菌株和低抗菌株,只有吉林省抚松县和集安市有少量中抗和高抗菌株,抗性频率均在3.70%以下。本研究为氯氟醚菌唑防治人参灰霉病提供了技术依据。

过氧化氢酶BcCAT2在灰葡萄孢生长发育和致病过程中的功能初探

为了明确灰葡萄孢过氧化氢酶BcCAT2在病菌生长发育时期和侵染过程中的功能,本研究利用生物信息学方法,对BcCAT2及其编码蛋白进行分析;构建了BcCAT2敲除载体,利用原生质体转化方法,获得了BcCAT2敲除突变体;利用PCR和qRT-PCR技术,对所获得的转化子进行鉴定;对野生型菌株和△Bccat2的表型(菌落形态、菌丝形态、生长速度、产孢量等)和致病力进行分析。结果发现,BcCAT2基因的缺失会导致菌丝形态纤细、生长速度缓慢、几乎不产菌核和分生孢子,且致病力明显下降,表明BcCAT2基因正调控病菌的生长发育和致病力。研究结果为进一步阐明灰葡萄孢过氧化氢酶BcCAT2基因调控病菌生长发育和致病力的分子机制奠定了基础。

灰葡萄孢对氟啶胺的敏感性检测及敏感性降低菌株生物学性状研究

为评价灰霉病菌对氟啶胺的敏感性及抗药性风险,本试验于2020年-2021年在吉林、江西、湖北、山东、北京、湖南等地区的草莓、辣椒、四季豆、茄子和番茄上采集病叶、病茎、病花和病果,经单孢分离获得117个灰葡萄孢Botrytis cinerea菌株,采用菌丝生长速率法测定其对氟啶胺的敏感性。结果表明:有4株灰葡萄孢BJ14、BJ45、BJ46和BJ47对氟啶胺的敏感性显著降低,EC_(50)在0.1137~0.3946μg/mL,抗性倍数为4.7~16.3,MIC值>4μg/mL。其余113个菌株对氟啶胺的平均EC_(50)为0.0251μg/mL。敏感性降低的4个菌株继代培养10代后,抗药性状稳定。交互抗性测定结果表明,对氟啶胺敏感性下降的菌株对腐霉利和咯菌腈2种杀菌剂表现为敏感,氟啶胺与腐霉利或咯菌腈没有交互抗性。生物学性状研究表明,4株敏感性下降菌株在PDA平板上的生长速率和在番茄果实上的致病力都显著低于敏感菌株,而菌丝生物量、产孢量和孢子萌发率与敏感菌株无显著差异。以上研究结果表明,田间已存在对氟啶胺敏感性降低的菌株,鉴于灰葡萄孢属于高风险抗性菌株,建议氟啶胺在防治灰霉病的使用中需谨慎。

氟吡菌酰胺与百菌清混配对灰葡萄孢菌的联合毒力及田间药效

[目的]筛选出氟吡菌酰胺与百菌清混配对灰葡萄孢菌的增效组合。[方法]采用菌丝生长速率法测定氟吡菌酰胺与百菌清混配对灰葡萄孢菌菌丝生长的联合毒力,并采用孢子萌发法和田间药效试验对优选出的配比进行验证。[结果]氟吡菌酰胺与百菌清以有效成分质量比10∶40、8∶42、6∶44、5.5∶44.5、5∶45、4∶46和3∶47混配抑菌菌丝生长的共毒系数(CTC)均大于120,表现增效作用。混配药剂对孢子萌发的抑制效果随百菌清含量增加而增强。41.7%氟吡菌酰胺悬浮剂与720 g/L百菌清悬浮剂按照有效成分质量比8∶42桶混在900~1 500 mg/L剂量下对番茄灰霉病的防治效果与对照药剂41.7%氟吡菌酰胺SC(400 mg/L)相当,略优于43%氟菌·肟菌酯SC(400 mg/L),显著优于720 g/L百菌清SC(1 260 mg/L)和50%异菌脲WP(1 000 mg/L)。[结论]氟吡菌酰胺与百菌清按有效成分质量比8∶42混配可以有效防控番茄灰霉病,推荐剂量为900~1 500 mg/L。