灵芝酸C2调控S6K/SREBPs信号通路对肝细胞脂代谢的影响及机制研究

目的:研究灵芝酸C2(GAC2)的体外降脂作用,并基于核糖体S6蛋白激酶(S6K)/固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)信号通路探讨其可能机制。方法:以人肝细胞HL-7702为对象,采用MTT法考察低、中、高剂量(5、10、20μmol/L,下同)GAC2作用后细胞的相对活力;以洛伐他汀为阳性对照,采用酶联免疫吸附测定法检测低、中、高剂量GAC2作用后细胞中胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)的含量,并采用尼罗红染色法观察细胞内的脂质堆积情况;转染SREBPs报告基因质粒后,以25-羟基胆固醇(25-HC)为阳性对照,采用荧光素酶报告基因法检测低、中、高剂量GAC2作用后细胞中SREBPs荧光素酶的相对活性;以25-HC为阳性对照,采用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测中、高剂量GAC2作用后细胞中SREBPs及其下游基因mRNA的表达情况;以SREBPs抑制剂(25-HC)、S6K抑制剂(雷帕霉素)为参照,采用Western blotting法检测细胞中SREBP-1、SREBP-2的表达情况[以成熟SREBPs(n-SREBPs)表示]以及磷酸化S6K与S6K的相对表达量比值(p-S6K/S6K比值);利用AutoDock 4.0等软件对S6K与GAC2进行分子对接。结果:低、中、高剂量GAC2对细胞相对活力无显著影响(P>0.05)。与空白对照组比较,洛伐他汀组和GAC2高剂量组细胞中TC含量以及洛伐他汀组和GAC2中、高剂量组细胞中TG含量均显著降低(P<0.05或P<0.01),各给药组细胞中的脂滴均有所减少。与空白对照组比较,25-HC组和GAC2低、中、高剂量组细胞中的SREBPs荧光素酶相对活性均显著降低;25-HC组和GAC2中、高剂量组细胞中HMGCS1、MVK、SCD、HMGCR基因mRNA,25-HC组细胞中DHCR7基因mRNA,GAC2高剂量组细胞中SREBP-2基因mRNA,25-HC组和GAC2高剂量组细胞中DHCR24、MSMO2基因mRNA的相对表达量均显著降低;25-HC组和GAC2低、中、高剂量组细胞中SREBP-1蛋白的相对表达量,25-HC组和GAC2高剂量组n-SREBP-2蛋白的相对表达量以及霉帕霉素组和GAC2各剂量组p-S6K/S6K比值均显著降低(P<0.05或P<0.01)。分子对接结果显示,GAC2可通过氢键与S6K的氨基酸残基Arg335、Arg330、Ala332结合。结论:GAC2可降低HL-7702细胞的脂质水平,其调控作用可能与抑制S6K/SREBPs信号通路的表达有关。

HPLC法和UV-VIS法测定灵芝孢子粉中灵芝三萜及灵芝多糖的含量

目的建立测定灵芝孢子粉中的两个有效成分灵芝三萜及灵芝多糖含量的方法,为进一步开发和应用灵芝孢子粉提供依据。方法以灵芝酸C2为标准品,通过HPLC法对灵芝孢子粉中灵芝酸C2的含量进行测定。色谱条件为:检测波长254nm;流动相为甲醇:水=55∶45,各加1%冰醋酸;柱温40℃;流速0.7mL/min。以葡萄糖为标准品,采用硫酸-蒽酮比色法,通过UV-VIS法对灵芝孢子粉中灵芝多糖的含量进行测定。结果HPLC法测得三批灵芝孢子粉中灵芝酸C2含量约为0.129‰,0.108‰和0.094‰,灵芝酸C2在7.35～147μg/mL范围内,浓度与峰面积呈良好的线性关系,r=0.9999,回收率为95.9%,95.6%和96.4%。UV-VIS法测得三批灵芝孢子粉中灵芝多糖的含量约为1.152%,1.129%和1.007%,葡萄糖在14.9～119.1μg/mL的范围内,浓度和吸光度呈线性关系,r=0.9991,回收率为95.0%,95.1%和95.2%。结论方法简便、准确,可用于灵芝孢子粉中灵芝三萜和灵芝多糖的含量测定。

一测多评法测定灵杞益肝口服液中4种灵芝酸类成分

目的建立一测多评法同时测定灵杞益肝口服液中灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝酸B和灵芝酸A含量。方法采用Agilent SB-C18色谱柱;流动相为乙腈-0.05 mol·L^-1磷酸二氢铵水溶液(27∶73),等度洗脱;体积流量为1.0 mL·min^-1;检测波长为254 nm;柱温为30℃。以灵芝酸A为内参物,计算灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝酸B的相对校正因子,并测定其含量。结果 4种灵芝酸类成分在各自范围内与峰面积线性关系良好(r≥0.9998),平均加样回收率为96.9%~98.0%,RSD为0.80%~1.6%,一测多评法所得结果与外标法测得结果接近。结论该方法简便、准确、可靠,可用于灵杞益肝口服液的质量控制。

HPLC法测定灵芝子实体和孢子粉中灵芝酸C_2、灵芝酸G和灵芝酸A

目的建立灵芝子实体和孢子粉中3种灵芝酸类成分的HPLC测定方法 ,为全面评价灵芝药材和孢子粉的质量提供依据。方法采用HPLC方法测定,Diamonsi(l钻石)C8色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相乙腈-0.03%磷酸(28:72),体积流量1.2mL/min,检测波长250nm;柱温35℃。结果灵芝酸C2、灵芝酸G、灵芝酸A分别在0.40～10.06μg(r=0.99999)、0.40～10.00μg(r=0.99999)、0.40～10.00μg(r=0.99999)线性关系良好,平均回收率分别为101.04%、99.39%、101.22%,RSD值分别为1.64%、1.86%、2.20%(n=6);灵芝子实体中3种灵芝酸的质量分数分别在0.06～0.29mg/g、0.12～0.37mg/g、0.19～0.41mg/g,灵芝孢子粉供试品中3种灵芝酸的质量分数分别在0～0.01mg/g、0、0～0.03mg/g。结论本方法简便,稳定,可用于灵芝三萜类成分C2、灵芝酸G、灵芝酸A的定量分析。

HPLC同时测定赤芝中4种三萜酸的含量

目的：建立HPLC同时测定赤芝药材中灵芝酸C2、灵芝烯酸A、灵芝酸A和灵芝酸D含量的方法。方法：采用Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.03%磷酸水溶液采用梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，检测波长252 nm，柱温35 ℃。结果：灵芝酸C2、灵芝烯酸A、灵芝酸A和灵芝酸D的线性范围分别为：5.0～50.0 mg·L-1（r=0.999 9），7.2～72 mg·L-1（r=0.999 9），11.67～116.7 mg·L-1（r=0.999 9）和5.32～53.2 mg·L-1（r=0.999 8）；平均回收率（n=3）分别为98.8%（RSD1.5%），99.1%（RSD1.9%），99.5%（RSD1.4%）和98.5%（RSD1.9%）。结论：该方法简便、准确，重复性好，为赤芝药材的质量控制提供了实验依据。