利用^(15)N示踪法研究土壤氮对烤烟氮素累积和烟碱合成的影响

以烤烟(Nicotiana tabacum L.K 326)为试验材料.在大田条件下,利用^(15)N示踪法,研究了土壤氮对烤烟氮素累积和烟碱合成的影响。结果表明。对烤烟氮素累积和烟碱合成的影响。土壤氮比例均随叶位上升而上升,且打顶后上、中、下三个叶位和根茎中土壤氮比例均随生育时期推进而显著增加;打顶后烤烟各器官的土壤氮占总氮比例和占总烟碱氮比例分别为50%和60%。显著高于肥料氮。

烟碱合成分子调控研究进展

烟碱由一个吡咯环和一个吡啶环构成,是栽培烟草中最重要的生物碱,占总生物碱含量的90%～95%。烟碱合成途径除最后一步聚合反应仍需试验证实外已基本明确,主要途径基因已被克隆。近年来,烟碱合成调控机制研究进展迅速,多个调控基因被发现参与调控烟碱的合成。文中对烟碱合成途径及其合成调控因素、参与合成调控的转录因子等方面进行了综述,并对烟碱合成调控的未来研究发展进行了展望。

不同氮形态处理对烤烟生长及烟碱合成的影响

为研究不同氮形态对烤烟生长及烟碱合成的影响,以烤烟品种K326为供试材料,研究了不同铵态氮与硝态氮配比(铵硝比)处理对烤烟生长发育,打顶前、后烟叶烟碱含量及烟碱合成关键酶活性的影响。结果表明:铵硝比为50/50处理可以显著促进烤烟旺长期和成熟期株高;铵硝比为97/3处理可以显著增加打顶前、后烤烟中、上部叶烟碱含量,显著增强烤烟根系打顶前、后烟碱合成关键酶腐胺N-甲基转移酶(PMT)和鸟氨酸脱羧酶(ODC)的活性。

遮阴对烤烟烟碱合成调控的影响

为探究遮阴处理对烤烟各生育期次生代谢的影响,在大田条件下,测定和分析了不同遮阴程度下烤烟烟碱、烟碱前体、中间物质含量及烟碱合成酶基因相对表达量。结果表明:遮阴15~55 d,根部烟碱含量随生育期推进呈现先升高、后降低、再升高、最后降低的趋势,即呈双峰曲线;遮阴25~65 d,与对照相比,中重度遮阴处理显著增加多胺含量,最大增幅分别为40.05%、36.14%、36.27%、23.47%、162.40%;遮阴15~55 d,中重度遮阴处理的烤烟根部天冬氨酸含量都高于对照,最大增幅分别为7.01%、25.65%、253.85%、22.70%、89.28%;遮阴25~55 d,与对照相比,中重度遮阴处理显著增加NtPMT基因相对表达量,最大增幅分别为283.80%、85.97%、67.17%、54.59%,且遮阴15~45 d中重度遮阴显著增加NtADC基因相对表达量,最大增幅分别为85.97%、181.83%、103.93%、54.59%。因此,中重度遮阴通过增加根部游离氨基酸、多胺含量,且有利于NtPMT、NtADC基因的表达,从而降低烟碱合成。研究结果可为烟田烟叶烟碱含量的调控提供生产指导。

鉴别电子烟中天然烟碱和合成烟碱的分析方法研究进展

烟碱是电子烟等新型烟草制品中的核心成分之一,烟碱有天然提取和化学合成两种来源方式,如何鉴别成为近年来的研究热点。综述了8种分析方法,主要包括烟碱异构体比例法和同位素法等,对各方法的优缺点进行了讨论,并探讨了其它可能的方法。烟碱异构体比例法包括旋光仪法、HPLC法、GC法、SFC法和NMR法等,具有简单、快速、定性定量等特点,可作为间接鉴别的方法;同位素法包括δ^(2)H、δ^(14)C、同位素模式法等,具有准确、高效、无需定量的特点,可作为直接鉴别的方法。采用上述多种方法同时确证电子烟中的烟碱来源,将大大提高结果的准确可靠性,为产品质量控制和市场监管提供技术参考。

基于同位素模式峰的串联质谱鉴别天然烟碱与合成烟碱

天然烟碱和合成烟碱的生物合成和化学合成过程不同,其同位素分馏也不同。本研究利用这一特性开发了一种基于同位素模式峰的串联质谱方法,通过对比烟碱的[M+H]^(+)和[M+H+1]^(+)峰的丰度和面积比,以及[M+H]^(+)和[M+H+1]^(+)峰作为母离子产生的碎片峰丰度比来验证烟碱的来源。结果表明,天然烟碱与合成烟碱的MS谱图中m/z 164.1、163.1峰的丰度比和面积比,以及MS/MS谱图中m/z 163.1、164.1碎片离子的丰度比均具有显著性差异。在具有显著性差异的变量中,合成烟碱的总体丰度比高于天然烟碱。同时,结合化学计量学方法进一步构建鉴别天然烟碱与合成烟碱的评价模型。在OPLS-DA模型中,164.1-85.1/84.1、164.1-85.1/(84.1+85.1)、163.1-131.1/131.1、163.1-131.1/(130.1+131.1)为筛选出来的天然烟碱与合成烟碱鉴别的主要变量,准确度达97.87%。该方法具有操作简单、快速、无需定量等特点,有助于市场上不同来源烟碱烟草制品的准确识别、标签和监管。

烟碱生物合成分子机制的研究进展

烟碱是烟草主要的生物碱,其生物合成受烟株生长时期、激素水平、生物和非生物胁迫等诸多因素的调控。从烟碱生物合成途径及相关酶、参与烟碱合成的调控因素、用于解析烟碱生物合成相关基因的方法等方面,综述了有关烟碱生物合成代谢的分子机制及其调控的研究进展,旨在为烟碱生物合成的基因调控、代谢工程提供参考。

烟碱酰胺合成酶基因的原核表达及多克隆抗体制备

以重组克隆质粒p0390-MF-NASHOR1为模板,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增出烟碱酰胺合成酶基因(nas)片段并将其克隆到原核表达载体pGEM-KG中,获得重组表达质粒pKG-NAS。将此重组表达载体质粒转化到大肠杆菌DH5α中,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-poly acrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)结果显示,烟碱酰胺合成酶基因在大肠杆菌中成功表达,表达的烟碱酰胺合成酶融合蛋白分子量大约为61 kDa。将初步的纯化产物作为免疫原去免疫新西兰大白兔制备兔抗烟碱酰胺合成酶血清,用蛋白免疫印迹法(western blot-ting)对制备的兔抗血清中的多克隆抗体进行了鉴定,显示该抗体具有较好的特异性。烟碱酰胺合成酶基因多克隆抗体的成功制备为检测该基因在草坪草中的表达提供了可靠的手段和技术平台,为进一步阐明该基因的作用机理奠定了基础。

NtMYC1在打顶调控烟碱生物合成中的功能研究

烟碱的合成受到众多因素的调控,打顶是提高烟草(Nicotiana tabacum)中烟碱合成能力的一项重要栽培措施。为了阐述打顶调控烟碱合成的机制,本文研究了NtMYC1在打顶调控烟碱生物合成中的功能。结果表明,打顶和茉莉酸甲酯(MeJA)能显著增加NtMYC1a/1b的表达,过表达NtMYC1a/1b能够显著提高NtPMT1/2的表达,增加烟碱的含量,而沉默NtMYC1a/1b能够降低NtPMT1/2的表达,减少烟碱的含量,说明该基因参与了烟碱的生物合成调控过程。酵母单杂交和凝胶迁移实验(EMSA)结果显示, NtMYC1a/1b转录因子能够与NtPMT1/2启动子的G-box识别结合,说明NtMYC1a/1b通过与启动子G-box的结合调控NtPMT1/2基因的表达。以上结果证明烟草打顶诱导的茉莉酸除了激活释放NtMYC1a/1b外,还能上调NtMYC1a/1b的表达,增加烟草体内活性NtMYC1a/1b的含量,进而提高NtPMT的表达,促进烟碱的合成。