短指软珊瑚(Sinularia acuta)热休克蛋白HSP70家族特征及进化分析

热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)在生物细胞或组织免受热或氧化应激等方面起着关键作用,是已知高度保守的蛋白质之一。由于全球环境持续升温,珊瑚大面积白化、死亡,珊瑚如何应对持续升温的抗逆机制是科学研究热点。本研究从高温胁迫短指软珊瑚测序蛋白序列数据库分析鉴定出了28个HSP70蛋白家族成员,均为酸性亲水蛋白,大部分蛋白质结构较为稳定。亚细胞定位表明HSP70蛋白主要分布在珊瑚细胞核、细胞质中,在线粒体、内质网上也有少量分布。信号肽预测表明, 28个HSP70蛋白成员中26个没有信号肽,大部分不属于分泌蛋白,不存在跨膜结构。系统进化树结果表明短指软珊瑚HSP70蛋白家族成员聚成5大类。短指软珊瑚HSP70蛋白家族结构和保守基序分析中预测到了10条保守基序motif分为5个亚族。短指软珊瑚HSP70蛋白家族二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,α-螺旋的含量占比大。28个HSP70家族蛋白中有25个预测到了N-糖基化位点,且位点个数在1~9范围内。28个HSP70家族蛋白均预测到磷酸化位点和O-糖基化位点,总个数分别在41~96和1~23范围内。本研究HSP70家族蛋白结果为今后珊瑚在应对全球升温胁迫中的适应机制等方面研究奠定了基础。

栉孔扇贝热休克蛋白70(HSP70)基因的BAC-FISH定位

利用BAC-FISH技术,将包含HSP70基因的BAC克隆定位到栉孔扇贝的一对同源染色体的长臂上。HSP70基因的染色体定位将对深入研究该基因的结构及功能并将其应用于生产实践提供基础支持。同时,本研究是首次对栉孔扇贝低拷贝基因进行染色体定位的实践,其结果将为栉孔扇贝的染色体的深入研究以及染色体鉴别等工作提供必要的参考。

热休克蛋白70(hsp70)基因对利什曼原虫中国分离株的系统发育分析

目的选用hsp70基因探讨我国各疫区不同宿主利什曼原虫的种系发育关系。方法采用PCR方法扩增分离自中国各疫区不同宿主的利什曼原虫之热休克蛋白70(hsp70)基因,将扩增的目的片段纯化后测序。使用MEGA 5.0软件对测序产物进行多序列比对并构建系统发育树,同时与国外利什曼原虫分离株的hsp70序列共同分析,观察利什曼原虫中国分离株在世界范围利什曼原虫的系统发育和分子进化中的地位。结果中国各流行疫区利什曼原虫均获得约1 300bp长度的hsp70基因片段,存在丰富的多态位点。中国23株利什曼原虫经hsp70基因分型聚集为四群,其中人来源的原虫分离株均在A群,为杜氏利什曼原虫(L.donovani),并分为杜氏利什曼原虫指名亚种(L.donovani)和杜氏利什曼原虫婴儿亚种(L.infantum)两个亚支;分离自新疆沙鼠或白蛉的6株利什曼原虫聚在B群,为都兰利什曼原虫(L.turanica);分离自新疆白蛉和内蒙古沙鼠的两株利什曼原虫为C群沙鼠利什曼原虫(L.gerbilli);分离自内蒙古蜥蜴和新疆白蛉的两株原虫为D群蜥蜴利什曼原虫(Sauroleishmania)。结论利什曼原虫中国分离株属于利什曼原虫亚属的不同种和蜥蜴利什曼原虫亚属,我国利什曼原虫分离株的种系发育复杂多样。

模拟失重及再超重对猕猴腮腺组织热休克蛋白HSP70表达的影响

目的探讨模拟失重30 d及再超重对猕猴腮腺组织中热休克蛋白HSP70表达的影响。方法选用雄性猕猴23只,随机分为对照组(A组),失重(B组),超重+13 Gx/230s(C组),失重后再超重(D组,依据不同的+Gx强度和时间分为4个亚组:分别是+11 Gx/270s D1组、+13 Gx/230s D2组、+15 Gx/200s D3组、+13 Gx/230s后恢复9 d D4组)。通过HE染色观察腮腺组织形态学的变化,通过免疫组织化学染色及Western blot技术检测HSP70在腮腺中的表达。采用SPSS17.0对数据进行统计分析。结果对照组腮腺结构基本正常,实验组腮腺组织中可见不同程度的局灶性淋巴细胞浸润、腺泡细胞萎缩,导管扩张,血管扩张充血;对照组腮腺组织HSP70表达阴性,实验组腮腺组织HSP70表达阳性,随着+Gx强度的加大而表达增强的趋势。实验组(除D4组外)HSP70在蛋白水平的表达显著高于对照组(P<0.05)。结论模拟失重、超重环境可造成猕猴腮腺出现轻度病理变化,腮腺组织中HSP70表达显著增强。

合浦珠母贝热休克蛋白hsp70基因的克隆与表达分析

采用同源克隆和RT-PCR技术对合浦珠母贝(Pinctada fucata)热休克蛋白hsp70基因进行了克隆和表达分析。获得cDNA全长序列2 365 bp,其中3’非编码区域(UTR)为318 bp,5’UTR为88 bp,开放阅读框(ORF)为1 959 bp,编码652个氨基酸,分子量约为71.39 kD,理论等电点为5.22,并含有3个HSP70家族的签名序列IDLGTTYS、DLGGGTFD和EEVD。同源性分析表明,合浦珠母贝HSP70的氨基酸序列与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)等双壳贝类的相似性高达86%以上,基于氨基酸序列的聚类分析表明,合浦珠母贝与牡蛎属种类亲缘关系最近。高温、高盐刺激后,半定量RT-PCR检测发现hsp70基因的表达明显增加,高温刺激的表达量高于高盐刺激,高温刺激组不同组织的表达量由大到小依次为鳃、消化腺、外套膜、肌肉、性腺,高盐刺激组不同组织的表达量由大到小依次为鳃、外套膜、肌肉、消化腺、性腺,表明HSP70参与了机体对刺激的应答过程。该基因的克隆为进一步深入研究合浦珠母贝的抗逆机理及其遗传改良奠定了重要基础。

脊尾白虾热休克蛋白HSP70基因的克隆及其表达分析

克隆了脊尾白虾热休克蛋白基因全长cDNA,并进行了序列分析。该基因由2 250 bp的碱基组成,开放阅读框长1 959 bp,编码由652个氨基酸组成的蛋白,基因两翼分别存在83 bp(5'端)和208 bp(3'端)的非翻译区,将该基因命名为Ec-HSP70。与其它物种HSP70s氨基酸序列进行同源性比较发现,与甲壳动物的同源性都在90%以上,表明该蛋白属于热休克蛋白HSP70家族。聚类分析表明,脊尾白虾热休克蛋白氨基酸序列与中国明对虾和凡纳滨对虾紧密聚为一支,之后聚类顺序依次为斑节对虾、日本囊对虾、刀额新对虾等。通过荧光定量RT-PCR对该基因在肝胰腺、肌肉的表达分析表明,温度、pH和氨氮胁迫都可以引起该基因的高表达,而且肝胰腺中的高表达时间相对肌肉中出现的较早。试验结果表明,温度、pH和氨氮胁迫对脊尾白虾HSP70基因表达有一定的诱导效果,但胁迫的时间过长则抑制其表达,肝胰腺对胁迫比肌肉较敏感。

温度刺激下栉孔扇贝不同组织热休克蛋白HSP70的表达研究

采用免疫印迹(Western blot)和流式细胞术(flow cytometry,FCM)方法,研究了热激栉孔扇贝不同组织内热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)的表达变化.免疫印迹结果显示,HSP70的诱导表达有组织特异性,即热休克可以使扇贝鳃组织中HSP70的表达明显升高,但在肌柱、外套膜和性腺组织中,未检测到HSP70 的表达.流式细胞术结果表明:在不同的季节,相同的热刺激对扇贝血淋巴中HSP70的诱导表达存在差异.高温刺激后,栉孔扇贝血淋巴细胞中HSP70的表达量逐渐升高,在诱导7h时达到最高.

热休克对H22细胞膜HSP70蛋白及其mRNA水平的影响

研究不同热休克条件对H22小鼠肝癌细胞的HSP70mRNA及蛋白表达的影响,以期获得最佳诱导条件.分别用MTT、RT-PCR、免疫荧光和FCM检测等方法观察不同热休克条件对鼠H22细胞的生存率、胞内HSP70mRNA转录水平及胞膜HSP70蛋白表达水平的改变.结果表明,H22细胞经轻度热休克(42～43℃),细胞生存率无影响,而中重度热休克(44～45℃)则随休克时间的延长,细胞生存率明显下降;42℃热休克初期(0.5～4小时)胞内HSP70mRNA水平低于对照组,休克后期(8～12小时)mRNA水平有所恢复并逐渐增高;不同时间热休克组H22细胞胞膜HSP70表达均较对照组显著增高(P<O.005),其中非致死性热休克以12小时表达最高,42℃为59.5%,43℃为96.8%.因此适当热休克条件可引起H22细胞HSP7OmRNA的改变及膜上HSP70蛋白表达的增加,从而增加肿瘤细胞的免疫原性.

猪肺炎支原体中国分离株热休克蛋白Hsp70(Dnak)的全基因克隆及C末端基因的表达与免疫活性分析

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,MHP)是猪气喘病的病原。DnaK又称为热休克蛋白Hsp70,具有分子伴侣和免疫的作用。以MHP中国分离株Yin-1为模板,扩增了DnaK基因的全序列,将该序列克隆到pMD18-T载体上并测序。测序结果Yin-1株DnaK基因即Hsp70基因全长1 803 bp,编码600 aa,第631～633位TGA在支原体编码色氨酸而不是作为终止密码子。将该序列与多种致病支原体DnaK基因进行分析比较,发现Yin-1株与232株、J株、7 448株等MHP菌株的DNA同源性为99.3%～99.4%,氨基酸同源性为99.2%～99.3%,而与非同种支原体的DNA和氨基酸同源性仅为64.5%～74.4%和59.3%～77%。这表明DnaK基因在种内高度保守,种间差异较大。以pET28a为载体构建重组质粒,原核表达DnaK C末端大小为1 kb左右的基因,对表达的蛋白进行纯化后,通过Western blot检测它的免疫活性。原核表达得到大小为41 ku的目的蛋白,经Western blot证实,纯化蛋白可与MHP阳性猪血清反应,具有免疫活性。

昆虫热休克蛋白Hsp70的研究进展

热休克蛋白Hsp70诱导性显著,合成量多并具有高度的保守性。Hsp70表达于所有的活体细胞中。Hsp70具有分子伴侣、抗细胞凋亡功能,参与免疫反应、抗氧化功能,可以提高细胞对环境胁迫或伤害的耐受性。文章对Hsp70的特性以及其在昆虫学中的研究意义、研究现状及前景进行了综述。

团头鲂(Megalobrama amblycephala)两种热休克蛋白70(HSP70s)的原核表达、纯化及鉴定

采用PCR方法扩增团头鲂组成型HSC70和诱导型HSP70基因完整的编码区片段,并分别克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,然后转化大肠杆菌BL21(DE3),用1mmol/L IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达。采用Ni-NTA His Bind Resins亲和层析和DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析对目的蛋白进行纯化,并进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果表明,成功构建了团头鲂两种重组表达质粒pET-22b(+)/Ma-HSC70和pET-22b(+)/Ma-HSP70,表达融合蛋白的相对分子量均约为72kDa,并能与兔抗人HSP70多抗进行特异性结合,这两种HSP70s融合蛋白经纯化后的纯度均达到95%以上。本实验选择融合蛋白Ma-HSC70在25℃和Ma-HSP70在30℃下分别诱导7h作为可溶性表达的最佳条件。

Cd(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)胁迫对双齿围沙蚕热休克蛋白70(HSP70)基因表达的影响

为研究重金属浓度的变化对双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis热休克蛋白70(heat shock proteins 70,HSP70)基因的表达变化,采用实时荧光定量PCR方法,分析了重金属Cu(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)单一诱导及联合作用下双齿围沙蚕HSP70基因的表达规律。结果表明:Cu(Ⅱ)单独作用时,沙蚕HSP70 mRNA表达量随时间的增加而增大,在诱导的第3天时不同浓度组沙蚕HSP70 mRNA表达量依次为22.86μg/L浓度组>44.50μg/L浓度组>4.45μg/L浓度组,而在诱导的第7天和第14天时HSP70 mRNA表达量与Cu(Ⅱ)浓度呈正相关;Cd(Ⅱ)单独作用时,沙蚕HSP70 mRNA表达量则随Cd(Ⅱ)浓度和诱导时间的增加而增大,但较Cu(Ⅱ)单独作用下变化趋势平缓;Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)联合作用下,沙蚕HSP70 mRNA表达量亦与暴露浓度和时间呈正相关,在诱导的第3天和第7天时45.70μg/L Cu(Ⅱ)+10μg/L Cd(Ⅱ)浓度组HSP70 mRNA表达量高于Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)单一作用,表明Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)存在一定的协同作用。

猪肺炎霉形体热休克蛋白Hsp70单克隆抗体的制备及鉴定

以肺炎霉体体(Mhp)Yin-1株为模板,利用所合成的引物扩增了伴侣蛋白DnaK(热休克蛋白Hsp70)C末端基因,将得到的目的片段分别克隆至表达载体pET-28a和pGEX-6P-1中,原核表达获得了重组蛋白6P-1-DnakC和28a-DnakC,经Western-blot分析,均能被Mhp抗血清识别。以28a-DnakC作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法,以6P-1-DnakC为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠。筛选和鉴定了2株分泌抗DnaK的杂交瘤细胞株,命名为1AD10、2AF11。Western-blotting结果表明,这2株单抗与Mhp发生特异性反应而不与其他相关霉形体发生反应。抗体亚类鉴定结果显示,1AD10、2AF11分别为IgG2b和IgG2a亚类,且轻链均为κ链。相加ELISA试验表明,2株单抗能识别不同的抗原表位。

慢性萎缩性胃炎热休克蛋白70(HSP70)表达的相关研究

目的探讨热休克蛋白70(heat shock proteins 70,HSP70)在人胃粘膜组织中的表达。方法采用免疫组化SABC方法检测HSP70在浅表性炎、慢性萎缩性胃炎(CAG)、胃窦腺癌组织中的表达。结果HSP70在浅表性炎、慢性萎缩性胃炎伴高级别上皮内瘤变(CAG和H-IN)、胃癌组织中的阳性率分别为27%、49%、67%,过表达率分别为3%、37%、58%,细胞核内阳性过表达率分别为0%、14%、55%。结论HSP70在胃癌、CAG和H-IN中过度表达,可能在其致病过程中起着重要的作用,进一步研究其分子机制将为胃癌的防治提供理论依据。

杨絮热休克蛋白70(HSP70)结构域蛋白的生物信息学分析、原核表达及生物学活性鉴定

目的揭示杨絮热休克蛋白70(HSP70)结构域蛋白生物信息学特征,并探索该类蛋白外源表达方法及生物学活性。方法通过生物信息学软件对已获得的3个含HSP70结构域蛋白的理化性质进行分析,利用免疫表位数据库和分析资源(IEDB)对该类蛋白的T、B细胞表位进行预测;根据Uniprot数据库提供的氨基酸序列合成相关基因并克隆入pET28a(+)质粒进行原核表达,采用SDS-PAGE检测蛋白表达,表达产物经镍柱纯化后行Western blot鉴定目的蛋白;蛋白浓度定量试剂盒检测蛋白浓度后,分别以鉴定出的目的蛋白为抗原制备BALB/c小鼠哮喘模型,ELISA检测小鼠血清中IgE抗体浓度。结果经生物信息学分析B9N9W6、B9GX02及A0A2K2AYN8蛋白相对分子质量(Mr)分别为71 900、94 600和75 200,均为亲水性蛋白且稳定性较好;经在线预测,共鉴定出3种蛋白的高亲和力T细胞表位13个,B细胞表位14个;SDS-PAGE显示,B9N9W6蛋白、B9GX02蛋白及A0A2K2AYN8蛋白分别在约72 000、95 000和75 000处出现特异性条带,Western blot法也在相应位置出现特异性条带;ELISA检测显示,提取液组和A0A2K2AYN8组IgE表达水平高于PBS组;同A0A2K2AYN8组比较,B9N9W6组及B9GX02组IgE浓度显著增高。结论杨絮HSP70结构域蛋白A0A2K2AYN8、B9GX02及B9N9W6均可原核表达,为可溶性蛋白,且具有生成IgE的生物活性。

庆大霉素对人肾小管上皮细胞系(HK-2)热休克蛋白(HSP)70表达的影响

目的观察了庆大霉素在体外对肾小管上皮细胞内HSP70表达的影响。方法将庆大霉素(100mg·L-1)作用于人肾小管上皮细胞系(HK-2),用MTT法检测庆大霉素对HK-2细胞增殖活力的影响,应用免疫细胞化学和Westernblot法观察了HSP70蛋白表达的改变,采用RT-PCR法检测HSP70mRNA表达的变化。结果庆大霉素在作用HK-2细胞24、48、72h后,MTT吸光度值为0·166±0·02、0·181±0·009、0·237±0·016,均低于对照组0·187±0·011、0·32±0·016、0·515±0·035(P<0·01);HSP70蛋白阳性表达率(%)分别为69±17、86±21、89±25,均高于对照组6±3、4±3、7±2(P<0·01);还可增加HSP70蛋白和mRNA表达(P<0·01)。结论庆大霉素在降低人肾小管上皮细胞系细胞增殖活力的同时,增加HSP70的表达。

钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ对热休克小鼠胚胎成纤维细胞HSP70表达的影响

为证实热休克小鼠胎儿成纤维细胞中钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)对热休克蛋白70(Heat shock protein70,HSP70)基因表达的影响及其作用机理,将体外培养的小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblasts,MEF)随机分为39℃和41℃热处理组(分别处理0.5,1,1.5,2 h)和常温对照组(37℃),测定各组细胞CaMKⅡ和HSF1 mRNA的量。此外,将培养的细胞分为37℃和39℃CaMKⅡ特异性抑制剂(myr-AIP)处理组和相应的空白对照组,分别测定各组细胞HSP70、HSF1及其mRNA的量。结果表明,39℃热休克1 h后HSF1和CaMKⅡ的mRNA表达量极显著高于常温对照组,经过myr-AIP处理的39℃组细胞HSP70及其mR-NA含量显著低于39℃空白对照组,而37℃myr-AIP处理组与37℃对照组没有显著差异;myr-AIP对37℃组和39℃组的HSF1 mRNA和蛋白含量影响均不显著,却使p-HSF1的含量显著降低。热休克能增加CaMKⅡ和HSF1 mRNA的转录,且CaMKⅡ通过磷酸化HSF1促进HSP70基因表达。

热休克蛋白HSP70和gp96在抗病毒感染中的作用

热休克蛋白(HSP)是一组在进化上高度保守、具有重要生理功能的蛋白质家族,是生物在应激条件下产生的一种非特异性防御产物,在调节免疫应答和抗病毒反应中起重要作用。现简要介绍HSP70、gp96(HSP96,GRP94)这两种HSP与病毒感染的关系及在抗病毒感染中的作用。

热休克蛋白70(HSP70)基因在中国对虾染色体上的定位

以热休克蛋白70(HSP70)基因为探针,利用荧光原位杂交(FISH)的方法,将其初步定位在中国对虾(Fennerope-naeus chinesis)染色体上。观察150组精巢细胞染色体,有111组染色体有3个杂交信号,占所观察的74％,由此得出,热休克蛋白70基因(HSP70)很可能存在于中国对虾减数分裂细胞3对染色体的3个位点上。本研究首次将功能基因定位在了对虾染色体上,为中国对虾的遗传物理图谱的构建提供了有效可行的方法。

食管鳞癌组织中热休克蛋白70(HSP70)及其mRNA的表达研究

目的探讨食管鳞癌及正常食管黏膜组织中热休克蛋白70(HSP70)的表达状况及其意义。方法取食管鳞癌手术切除标本33例,液氮保存。提取新鲜组织中的蛋白质western blotting检测HSP70蛋白的表达;RT-PCR方法检测HSP70mRNA的表达,应用ImageTool3.0图像分析软件对检测结果进行定量分析。结果食管鳞癌中HSP70mRNA和蛋白阳性表达率分别为100%和93.9%,与食管正常黏膜相比明显升高(分别为69.7%和45.5%);食管鳞癌组织和正常食管黏膜中的HSP70mRNA的相对表达量分别为(1.35±0.21)和(0.73±0.19),差异有显著性(P<0.01);HSP70蛋白表达与食管鳞癌淋巴结转移相关,与年龄、性别和浸润深度无关。结论食管鳞癌组织中HSP70表达水平明显升高,且与淋巴结转移相关,HSP70基因可能参与了食管鳞癌的发生、发展过程。