除草剂乙草胺对非洲爪蟾性腺发育的影响

使用性腺发育对内分泌干扰作用敏感的两栖动物非洲爪蟾作为模型动物,通过考察性别比、性腺整体形态和组织学形态来揭示乙草胺对其性腺发育的影响,从而确定乙草胺是否具有内分泌干扰活性.46/47期蝌蚪经不同浓度(5μg·L-1、10μg·L-1、20μg·L-1)的乙草胺暴露处理至变态后1个月,在变态结束后3个月时,解剖性腺、鉴别雌雄并固定性腺做组织切片.实验中对照组所有性腺都为典型的卵巢或睾丸,雌性百分率为48.78%(20/41).而乙草胺暴露组却出现了明显的异常睾丸,其总体上是睾丸,但又带有部分卵巢的特征,在统计性别时将具有异常睾丸的爪蟾归为雄性.5μg·L-1、10μg·L-1、20μg·L-1暴露组的雌性百分率分别为:57.14%(24/42)、66.67%(22/36)、55.26%(21/38).虽经统计分析无显著性差异,但乙草胺暴露组中雌性多于雄性的趋势和出现带有雌性特征的雄性的现象,一定程度上却暗示了乙草胺可能对非洲爪蟾的性腺发育有雌性化作用.正常睾丸的组织学结构应有发育成熟的生精小管,其内有各个时期的精子囊和生精细胞及精子.但经乙草胺处理的爪蟾睾丸却表现出几种明显的异常:没有生精小管,相反却像发育早期的睾丸一样,充满大量的精原细胞,完全没有生精细胞和精子;有生精小管结构,但其内精子囊结构不明显,生精细胞少并且排列混乱,其间有很大的空隙;睾丸出现腔隙,并有大量体细胞存在,这种结构与57期的卵巢相似;睾丸中出现异常的生精细胞,与58期卵巢的卵细胞相似;睾丸组织中有明显的卵细胞散布.组织学研究发现的乙草胺导致的睾丸结构证明了乙草胺对非洲爪蟾的睾丸发育有抑制雄性化作用和雌性化作用,即乙草胺对非洲爪蟾的性腺发育有内分泌干扰作用.

乙草胺对热带爪蟾的早期致畸效应及遗传毒性研究

为了评价乙草胺对热带爪蟾Xenopus tropicalis早期发育阶段的影响,采用爪蟾胚胎致畸试验(FETAX)测定了乙草胺对爪蟾胚胎发育的致畸效应。结果表明,乙草胺对热带爪蟾胚胎的致畸中浓度(TC50)为有效成分1.20 mg/L,且能引起爪蟾腹部水肿、面部畸形、脊柱弯曲、尾巴弯曲、头部畸形等多种胚胎畸形。乙草胺的致畸指数(TI)为1.88,具有潜在的致畸风险。爪蟾蝌蚪在亚致死浓度的乙草胺中暴露4 d后,微核和单细胞凝胶电泳试验结果显示,乙草胺可导致蝌蚪血细胞的微核率显著升高,其尾部DNA含量和Olive尾矩两个指标也均显示细胞DNA受到损伤,且随着药剂浓度的增加,对DNA的损伤程度增强。

除草剂西玛津对非洲爪蟾生存和性腺发育的影响

为了研究三嗪类除草剂西玛津对两栖动物非洲爪蟾（Xenopuslaevis）生存和性腺发育的毒性作用，并且与另一种三嗪类除草剂阿特拉津的毒性进行比较，将非洲爪蟾从46／47阶段开始暴露西玛津和阿特拉津到变态1个月后停止，再饲养2个月后将其解剖，取性腺做形态学和组织学观察，暴露期间，每天记录蝌蚪的生长发育情况和存活率，结果显示，在暴露的第1周内（蝌蚪处于46～50阶段），西玛津可导致蝌蚪死亡率明显升高，随后的时间内西玛津对非洲爪蟾的生存不再有明显影响，但却使发育阶段明显的不整齐，阿特拉津对非洲爪蟾的生存和发育则没有明显影响，西玛津和阿特拉津对非洲爪蟾性腺的总体形态和性别比没有明显影响，然而两种除草剂均在一定程度上导致了睾丸组织学的改变，西玛津可能与阿特拉津一样能够通过雌性化／去雄性化作用影响非洲爪蟾睾丸的发育。

川芎嗪对爪蟾卵母细胞外源清道夫受体基因表达的影响

目的研究川芎嗪对SRAI基因表达的影响,从基因调控水平探讨其抗动脉粥样硬化作用的机制。方法将人SRAI基因构建在γ干扰素活性位点(GAS)调控元件的下游,并导入爪蟾卵母细胞,建立人类清道夫受体SRAI基因表达调控系统。分别用经oxLDL刺激培养牛主动脉平滑肌细胞后制备的平滑肌细胞条件培养液(SCM)以及含有川芎嗪的SCM培养卵母细胞。3d后,对卵母细胞膜上的SRA1表达量检测。结果结果显示川芎嗪可抑制SCM诱导的SRAI表达,且有量效关系。结论说明川芎嗪和γ干扰素有类似的作用,可以通过干预GAS调控途经,阻止oxLDL诱导引起的SRA1过量表达。

丹参酮对爪蟾卵母细胞外源清道夫受体-AⅠ基因表达的影响

目的从基因调控水平探讨丹参酮对清道夫受体AⅠ(SR-AⅠ)基因表达的影响以及抗动脉粥样硬化的作用机制。方法将人SR-AⅠ基因构建在其调控元件SRad-SRap的下游,并经显微核注射导入爪蟾卵母细胞,建立SRad-SRap元件调控的SR- AⅠ表达系统；氧化低密度脂蛋白(OXLDL)刺激培养牛主动脉平滑肌细胞,制备平滑肌细胞条件培养液(SCM)；分别用SCM和含有丹参酮的SCM培养注射后的卵母细胞,用荧光标记配体法和ABC-Elisa法定性、定量检测卵母细胞膜上SR-AⅠ的表达。结果丹参酮可以抑制卵母细胞膜SR-AⅠ表达,且有量效关系。结论OXLDL可通过诱导平滑肌细胞产生相关因子,经SRad-SRap调控途径的作用上调SR-AⅠ的表达；丹参酮可以阻止SR-AⅠ的过量表达,可能是治疗As的作用机制之一。

多氯联苯(Aroclor 1254)对非洲爪蟾变态发育的影响

为了研究多氯联苯(Aroclor 1254)对非洲爪蟾变态发育的影响,将非洲爪蟾受精卵暴露在一定浓度(0、400ng·L-1、2μg·L-1、10μg·L-1、20μg·L-1)的Aroclor 1254中,直至完全变态.结果表明,20μg·L-1Aroclor1254暴露可使变态所需时间显著延长(p<0.05),低于20μg·L-1的各组变态所需时间与对照组无显著差异.2μg·L-1以上的Aroclor1254暴露可使蝌蚪甲状腺发生明显的组织学改变,包括甲状腺组织滤泡扩张、胶体面积相对缩小,滤泡细胞增殖、高度增加,并且这种变化随暴露剂量的增加而愈发明显.提示多氯联苯可干扰非洲爪蟾的变态发育,引起甲状腺组织学改变.采用定量组织病理学技术检测甲状腺激素干扰物较为灵敏,方法简单易行,是一种切实可行的筛选和确证甲状腺干扰物的体内方法.

全氟辛磺酸(PFOS)对非洲爪蟾(Xenopus laevis)生长发育、甲状腺和性腺组织学的影响

为了揭示全氟辛磺酸(PFOS)的甲状腺激素和性激素干扰效应,并探索运用爪蟾动物模型同时检测多种环境内分泌干扰效应的可能性,将NF48阶段非洲爪蟾(Xenopus laevis)蝌蚪暴露于0.01、0.1和1mg·L-1PFOS中6个月,检测PFOS对爪蟾生长、变态、甲状腺和性腺的影响.结果表明,在各取样时间,PFOS组爪蟾体长、体重和蝌蚪尾长与对照组均无显著差异(p>0.05);2个月后,PFOS组比对照组平均慢1个发育阶段,4和6个月后,0.01mg·L-1PFOS组反而比对照组分别快1和2个发育阶段.6个月后,PFOS组甲状腺出现滤泡上皮细胞增生、胶质减少甚至空泡化等现象,且随着PFOS浓度的增加而加重;各组幼蛙性腺出现间性、睾丸珍珠状和先天性萎缩等畸形现象,外观为间性的性腺主要表现为睾丸组织中产生类似雌性个体的卵巢腔.对照组幼蛙的雌雄比为0.5:1,而暴露组分别为2.3:1(0.01mg·L-1组)、4.5:1(0.1mg·L-1组)和5:1(1mg·L-1组).上述结果表明,PFOS对爪蟾的变态过程具有小剂量刺激效应,能引起甲状腺组织结构的损伤,导致睾丸组织的雌性化和雌雄性比的异常升高,表现出明显的甲状腺激素和性激素干扰效应,可以认定为一种环境内分泌干扰物.实验同时表明非洲爪蟾可以用于多种环境内分泌干扰效应的同时检测.

黑斑蛙与非洲爪蟾蝌蚪急性毒性试验方法敏感性的比较

两栖动物蝌蚪急性毒性试验是评价化学品急性毒性的一种方法。以毒死蜱、乙草胺、重铬酸钾和全氟辛烷磺酸盐(PFOS)为测试物,比较了我国本土黑斑蛙(Rana nigromaculata)与国际通用种非洲爪蟾(Xenopus laevis)在蝌蚪急性毒性试验中的敏感性。结果发现:2类蝌蚪分别进行的11次试验中,空白对照组黑斑蛙蝌蚪死亡率(0.9%)远低于非洲爪蟾蝌蚪的死亡率(5.8%);重铬酸钾和PFOS对黑斑蛙蝌蚪的96 h-LC50分别为34.0 mg·L-1和81.0 mg·L-1,而对非洲爪蟾蝌蚪的96 h-LC50分别为51.6 mg·L-1和92.1 mg·L-1,显示黑斑蛙蝌蚪对这2种化学品的敏感性略高于非洲爪蟾蝌蚪;毒死蜱和乙草胺对黑斑蛙蝌蚪的96 h-LC50分别为0.41 mg·L-1和4.1 mg·L-1,而对非洲爪蟾蝌蚪的96 h-LC50分别为0.12 mg·L-1和3.1 mg·L-1,显示黑斑蛙蝌蚪对这2种化学品的敏感性略低于非洲爪蟾。鉴于2类蝌蚪对化学品的敏感性存在差异,且黑斑蛙蝌蚪的自然死亡率低,材料更易获得,笔者认为黑斑蛙蝌蚪比非洲爪蟾更适合作为蝌蚪急性毒性试验的材料,用于我国化学品环境管理中的毒性评价。

3种抗生素对热带爪蟾胚胎发育的毒性影响

由抗生素在畜牧养殖业中的滥用造成的水环境污染问题及其对水生生物的毒害作用日益受到关注。用0.5～1.5g/L的氯霉素(Chloramphenicol)、红霉素(Erythromycin)和0.01～0.5g/L的四环素(Tetracycline)对热带爪蟾(Xenopus tropicalis)胚胎进行72 h暴露。结果表明,1.25 g/L和1.5 g/L的氯霉素使胚胎存活率分别下降了7%和14%,红霉素对胚胎存活无明显影响,0.5g/L四环素导致胚胎全部死亡。1.5g/L的氯霉素和红霉素使胚胎体长分别减少了7%和9%,0.25g/L的四环素使胚胎体长减少了4%。3种抗生素能引起围心腔水肿、泄殖腔增大或拉长、肛门扩张和尾部弯曲等多种畸形现象,1.5g/L的氯霉素造成的总畸形率和围心腔水肿率分别为44%和34%;1.5g/L的红霉素造成的总畸形率和泄殖腔增大率分别为22%和20%;0.25g/L四环素造成的总畸形率和肛门扩张率分别为75%和59%。3种抗生素对热带爪蟾胚胎的发育毒性从大到小为四环素、氯霉素、红霉素。

爪蟾胚胎致畸实验(FETAX)在检测污染物发育毒性中的应用

爪蟾胚胎致畸实验(FETAX)是一种用于检测污染物发育毒性的有效方法。用CuSO_4、CdCl_2和三丁基锡(TBTCl)对热带爪蟾(Xenopus tropicalis)胚胎进行48 h暴露。结果表明,对照组胚胎均未出现死亡或畸形现象,Cu^(2+)、Cd^(2+)和TBTCl对胚胎的半致死质量浓度(LC_(50))分别为0.38 mg/L、4.28 mg/L和3.18μg/L。48 h后,各暴露组胚胎出现颅面缺陷、眼睛突出、漏斗形嘴、肠道蜷曲、尾巴弯曲、水肿和色素沉着等多种畸形现象。Cu^(2+)、Cd^(2+)和TBTCl对胚胎的半致畸质量浓度(EC_(50))分别为0.16 mg/L、2.16 mg/L和2.98 μg/L,致畸指数分别为2.38、1.98和1.04。用脱碘酶抑制剂碘番酸(IOP)对非洲爪蟾胚胎进行暴露。36 h后,暴露组胚胎主要出现眼睛异常发育甚至消失等现象,这表明IOP对眼的发育有特定的毒性作用。研究表明,运用热带爪蟾胚胎检测污染物发育毒性的灵敏性并不高于非洲爪蟾(X.laevis)胚胎致畸实验,运用FETAX进行污染物发育毒性的检测并未显示出明显优势,其实验方案还有待进一步改进,但爪蟾胚胎模型在研究污染物特定的毒性机理方面具有较大潜力。鉴于爪蟾胚胎很适合进行分子操作,在现有FETAX实验的基础上增加一些分子生物学指标,将不仅能提高发育毒性效应检测的灵敏性,而且也增加了对污染物特定毒作用模式的解析功能。

姜黄素对爪蟾卵母细胞表达人低密度脂蛋白受体的影响

目的在爪蟾卵母细胞中建立人低密度脂蛋白受体(lowdensitylipoproteinreceptor,LDL- R)表达系统,并研究姜黄素降脂作用的分子机理。方法将含人LDL R的表达质粒p3 7LDL导入细胞核中,用免疫荧光、配体荧光以及免疫胶体金标记透射电镜等方法检测细胞膜上LDL- R的表达情况;用不同浓度的姜黄素对爪蟾卵母细胞人LDL- R基因的表达进行干预,并用酶联免疫吸附分析法测定LDL- R的表达量。结果人LDL -R基因在爪蟾卵母细胞膜上得到表达;姜黄素具有增强其表达的作用,且有明显的量效关系。结论姜黄素降血脂和抗动脉粥样硬化的作用途径之一可以是通过促进LDL- R基因的表达,增加细胞对低密度脂蛋白胆固醇的吸收,从而降低血清胆固醇。

三丁基锡对非洲爪蟾甲状腺组织结构的影响

幼龄非洲爪蟾(Xenopus laevis)暴露于低浓度三丁基锡(25ng.L-1TBTCl)中2个月,运用组织学切片的方法观测甲状腺组织结构的变化.结果表明,TBT暴露1个月能引起爪蟾甲状腺滤泡胶质减少甚至空泡化,暴露2个月后,甲状腺滤泡的变形率也显著增加,相对甲状腺横截面积和滤泡面积仅为平行对照的35.3%和45.6%,而滤泡数目没有明显变化.空白组和暴露组均未观察到明显的滤泡上皮增厚或肥大等现象.由此可见,甲状腺萎缩是由于滤泡面积减小而不是滤泡数目减少所引起的;滤泡中胶质的减少和变形等与常见的滤泡上皮代偿性增生或肥大无关.所用低浓度的TBT能对爪蟾甲状腺组织结构造成严重损伤,TBT可以被认定为一种环境甲状腺激素干扰物.

非洲爪蟾消化道的5-羟色胺免疫活性细胞

目的:应用5-羟色胺(5-HT)抗血清研究非洲爪蟾消化道内的5-HT免疫活性细胞的分布密度及形态,并探讨其分布型的成因及细胞形态与功能的关系。方法:免疫组织化学ABC法。结果:5-HT细胞在非洲爪蟾消化道的各个部位均有分布,分布密度近似呈M形,其中以空肠分布密度最高,胃贲门部次之,食管最低。5-HT细胞的形态多样,呈圆形、椭圆形、锥体形等,主要分布于消化道黏膜上皮细胞之间、上皮基部、同有膜以及腺泡上皮细胞之间等。结论:非洲爪蟾消化道5-HT细胞具有内、外分泌2种功能。

非洲爪蟾短型肽聚糖识别蛋白基因的克隆与鉴定

采用生物信息学方法首次对非洲爪蟾短型肽聚糖识别蛋白(xePGRP-S)基因进行了克隆,并对其在胚胎发育和成年爪蟾各组织中的表达状况进行了分析。xePGRP-ScDNA全长720bp,开放阅读框为549bp,编码182个氨基酸。序列比对显示xePGRP-S与其他物种PGRP-S的序列相似性在42.4%—50.5%之间。RT-PCR显示在非洲爪蟾胚胎发育至3d时可以明显检测到xePGRP-S的表达,之后呈持续性表达,且在所检测的心、肝、脾、肺、肾、肠和胃这7种组织器官中呈组成型表达。

非洲爪蟾卵母细胞GABA_B和GABA_C受体介导的电流反应

实验应用双电极电压箝技术 ,在具有滤泡膜的非洲爪蟾 (Xenopuslaevis)卵母细胞上记录到γ 氨基丁酸(γ aminobutyricacid ,GABA) 激活电流。此GABA 激活电流的特点及有关GABA受体类型的研究和分析如下 :( 1)在 3 5 5 % ( 5 5 / 15 5 )的受检细胞外加GABA可引起一慢的浓度依赖性的外向电流。 ( 2 )GABAA 受体的选择性拮抗剂bicuculline ( 10 -5mol/L)对GABA ( 10 -5mol/L)引起的外向电流无阻断作用 (n =6)。 ( 3 )GABAB 受体的选择性拮抗剂2 hydroxysaclofen ( 10 -4mol/L)能将GABA ( 10 -5mol/L)引起的外向电流可逆性地转变为内向电流 ,后者又可被GABAC 受体的选择性拮抗剂I4AA ( 10 -5mol/L)所消除 (n =6)。 ( 4 )GABAB 受体的特异性激动剂baclofen可引起部分 ( 2 0 % ,12 / 60 )受检细胞产生一慢的浓度依赖性的外向电流。 3× 10 -6 、3× 10 -5及 3× 10 -4mol/L 2 hydroxysaclofen分别阻断baclofen ( 10 -5mol/L) 激活电流 ( 6 3± 3 2 ) % ,( 4 4 1± 2 2 ) %及 ( 86 0± 1 6) % (n =6)。 ( 5 )baclofen激活电流的I V曲线显示逆转电位在 - 96 8± 7 2mV左右 ,此电流可分别被TEA ( 5mmol/L)和BaCl2 ( 2mmol/L)所阻断。以上结果提示 :在非洲爪蟾的卵母细胞上存在内源性GABAB 和GABAC 受体 。

注射老龄大鼠脑皮层mRNA的爪蟾卵母细胞对乙酰胆碱，谷氨酸和5－羟色胺的反应

从老年（３２月龄）和成年（３月龄）大鼠大脑皮层提取多聚腺啤呤ｍＲＮＡ，注入非洲爪蟾卵母细胞表达有功能的神经递质受体。用电生理方法检测乙酰胆碱，谷氨酸和５－羟色胺诱发的去极化反应，揭示老化脑递质受休反应的变化。注射老年大鼠大脑皮层ｍＲＮＡ的卵母细胞对三种递质诱发反应去极化幅度下降，上升时间及潜伏期延长，Ｔ１／２缩短，与成年对照组有显著性差异；三种递质受体反应幅度约为成年对照组的４０％－６０％，其变化趋势相同。

pH变化对非洲爪蟾卵母细胞ATP受体激活电流的影响

目的:观察pH变化对非洲爪蟾卵母细胞ATP受体激活电流(IATP)的影响。方法:采用双极电压钳技术记录卵母细胞膜ATP受体介导的电流。结果:检测的绝大多数细胞对ATP敏感,pH为7.4的ATP引起细胞特征性膜电流,并呈浓度依赖性。该电流包括3个部分:快内向电流(D1),慢内向电流(D2)和慢外向电流(H)。当细胞外pH降低到6.0、5.5时,10-3mol/L的ATP引起的IATP幅值明显被抑制,并以对D1电流抑制最明显。胞内应用G蛋白抑制剂阻断P2Y受体,对D1电流影响不大,D2电流明显减小。胞外应用P2X受体拮抗剂,对D1电流有明显的阻断作用。结论:pH值降低对爪蟾卵母细胞IATP的抑制主要通过对P2X受体的影响而实现。

卵泡抑素参与爪蟾心的形成

目的：研究卵泡抑素在爪蟾心形成过程中的作用。方法：切下发育第14期胚胎形成心的组织，并分别加入卵泡抑素、骨形成蛋白和活化素进行培养。4h时后，用MEMPHA固定并进行胚胎整体原位杂交。利用Morpholio Oligo技术减弱了卵泡抑素的表达，检测了在缺乏卵泡抑素条件下心形成的变化。结果：早期心表达卵泡抑素；增加或降低卵泡抑素均抑制Nkx2．5的表达。结论：卵泡抑素在心的形成过程中发挥十分重要的作用，缺乏或过量卵泡抑素均影响心的形成。

人胎肝中肝细胞生长因子poly(A)^+mRNA在非洲爪蟾卵母细胞内的翻译

采用SDS/氯仿/苯酚法和oligo(dT)纤维素亲和层析从人胎肝提取poly(A)^+mRNA,注入非洲爪蟾卵母细胞,翻译出肝细胞生长因子(HGF),产物能从卵母细胞中分泌。在9种细胞(包括人与小鼠的4种不同组织和5种细胞系)检测系统中,证明翻译的HGF与直接提取的HGF活性一致,应用滤膜超滤法估计分子量均在10～30kDa,可以初步认为两者是同一物质。从而,支持了人胎肝HGF是胎儿肝脏细胞基因表达的产物。

氟吗啉对非洲爪蟾的急性毒性

本研究以非洲爪蟾(Xenopuslaevis)处于不同发育期的幼体(蝌蚪)为对象进行了杀菌剂氟吗啉急性毒性的研究。试验以受试蝌蚪48、72、96h死亡数,半数致死浓度及蝌蚪的中毒形态观察为评价终点。试验结果表明:处在同一发育期的蝌蚪,96hLC50值比48hLC50值低。处于不同发育阶段的蝌蚪,随着发育阶段的改变,发育后期的蝌蚪(46/47期和48/50期)要比发育前期的蝌蚪对化学物质氟吗啉表现更敏感。形态观察发现,在不同发育期,中高剂量蝌蚪表现出不同程度的黏液分泌过多、脊柱弯曲、弯尾及体色变淡等症状。