牙龈卟啉菌蛋白酶rgpA的基因克隆和序列分析

目的:扩增牙龈卟啉菌蛋白酶rgpA催化结构域(rgpAcd)的基因片断并作鉴定。方法:利用PCR方法,克隆牙龈卟啉菌rgpAcd基因,并将基因片断插入pMD18-TVector,通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定。结果:克隆基因测序结果与GeneBank数据库中的序列一致。结论:成功克隆了牙龈卟啉菌rgpAcd的基因,为体外表达其活性蛋白奠定了基础。

牙龈卟啉菌和大肠杆菌内毒素对人牙周膜细胞分泌IL-6、TNF-α的影响

目的 :研究牙龈卟啉菌、大肠杆菌内毒素对人牙周膜细胞 (PDLC)分泌IL - 6、TNF -α的影响。方法 :采用细胞培养技术和ELISA方法 ,检测培养上清中IL - 6、TNF -α水平。结果 :在孵育 6h后 ,即可在培养上清中检测到IL - 6和TNF -α。IL - 6在 12h、TNF -α在 2 4h内呈时间依赖性方式升高。结论 :PDLC在内毒素作用下局部分泌IL - 6、TNF -α ,参与了牙周炎的发生、发展过程。

牙龈卟啉菌381对纯钛及钛75合金种植体表面失泽的腐蚀

目的 研究牙龈卟啉菌 381对纯钛及钛 75合金种植体表面失泽腐蚀 .方法 将纯钛 (TA 2 )、钛 75合金机加工成10 mm× 10 m m× 1m m板片 ,数量分别为 30片和 6 0片 ,取钛75合金试件 30片与纯钛试件分别进行化学钝化处理 .将每组试件 30片随机分空白对照组、培养基对照组、实验组各 10片 .厌氧环境中将牙龈卟啉菌 381接种到改良 GAM培养基上 ,将试件贴附表面 ,每周转换传递 1次 ,共 10 wk. 0 .5 m L· L- 1戊二醛消灭细菌 ,清洗 ,2 wk后 ,用 MINOL TA CR- 10 0型色度计观察 .结果 肉眼观察纯钛 (钝化 )、钛 75合金 (钝化、非钝化 )实验组试件表面颜色由银灰色变成淡黄色 .Bartlett方差齐性检验知纯钛 (钝化 )、钛 75合金 (钝化 )和钛75合金 (非钝化 )的空白对照组与培养基对照组的 L* ,a* ,b*值无显著差异 (P>0 .0 5 ) ;纯钛 (钝化 )、钛 75合金 (钝化 )、钛75合金 (非钝化 )的实验组分别与空白组、培养基组的 L,a,b值有明显差异 (P<0 .0 5 ) .结论 牙龈卟啉菌 381对纯钛 (钝化 )、钛 75合金 (钝化、非钝化 )发生肉眼可见的表面失泽 ,且不受钛 75合金表面钝化膜形成方式不同影响 .色度计分析知三种类型试件表面颜色由绿黄区域向红黄区域移动 .

五倍子提取物对牙龈卟啉菌内毒素介导白介素-1β活性的影响

目的 :研究五倍子提取物对牙龈卟啉菌内毒素介导白介素 - 1 β活性的影响。 方法 :采用人外周血分离培养单核细胞 ,2 5μg/mL牙龈卟啉菌内毒素作为刺激因子 ,观察 6 .2 5、1 2 .5、2 5、50、1 0 0 μg/mL五种质量浓度的五倍子提取物对单核细胞分泌细胞因子白介素 - 1 β活性的影响 ,以放射免疫分析法 (RIA)测定白介素 - 1 β的水平。 结果 :五倍子提取物可显著抑制牙龈卟啉菌内毒素介导单核细胞分泌白介素 - 1 β的活性 ,其作用在一定范围内呈浓度依赖性。结论 :五倍子提取物抑制牙龈卟啉菌内毒素介导的白介素 - 1 β的活性 。

四环素对侵袭性牙周炎血清抗牙龈卟啉菌抗体水平的影响

目的评价结合四环素的机械性牙周治疗对侵袭性牙周炎(AP)患者牙周附着水平、牙槽骨组织和血清抗牙龈卟啉菌(Pg)抗体亲和力水平的影响。方法研究对象由26例AP患者、20例牙周健康者组成。牙周治疗前及治疗3、6和12 个月后常规临床检查,记录牙周附着水平;治疗前及治疗3个月和6个月后拍摄全口曲面断层片,记录釉牙骨质界到骨缺陷底及釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离;治疗前后,实验检测所有受试者血清抗Pg抗体亲和力水平。亲和力通过二乙醇胺分离ELISA测定。结果结合四环素的机械性牙周治疗后,牙周附着水平有显著改善(P<0．01);釉牙骨质界到骨缺陷底的影像改变显著(P<0．05);其血清抗Pg表面抗原脂多糖抗体亲和力水平亦明显下降(P<0．01)。结论结合四环素的机械性牙周治疗对AP患者可获得满意的疗效。

牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K催化结构域的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 :克隆牙龈卟啉菌蛋白酶K催化结构域 (kgpcd)基因 ,并使其在大肠杆菌中获得表达。方法 :利用PCR方法克隆kgpcd ,并用基因重组融合表达技术获得在大肠杆菌中的表达。结果 :克隆基因测序结果与GeneBank数据库中的序列一致 ,经诱导表达见Mr为 5 6× 1 0 3 的融合蛋白。结论 :成功克隆了kgpcd的基因 ,并在大肠杆菌中表达了KGPcd蛋白 。

五倍子、黄芩提取物对牙龈卟啉菌超微结构的影响

目的:观察五倍子、黄芩提取物对牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis Pg)超微结构的影响。方法:采用透射电镜进行观察。结果:黑色的细菌经20g/L的五倍子提取物液处理后变为淡褐色,可使Pg大部分胞壁不完整,破裂呈不连续状态或消失,胞浆内可见较多空泡,有的胞浆内可见黑色沉淀颗粒。20g/L的黄芩液处理后细菌仍为黑色,电镜下可见其细胞变形,胞壁变薄或破裂,胞浆消化呈空泡,有的胞浆内可见黑色沉淀颗粒。结论:20g/L的五倍子、黄芩提取物可明显破坏Pg的细胞结构。

牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB的基因克隆、原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:克隆牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB基因、原核表达并制备牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB多克隆抗体。方法:根据牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB的DNA序列,设计特异性引物并经PCR扩增其基因。扩增产物经鉴定和测序分析后,与质粒pET-32a(+)重组形成pET-32a-ragB,继而转化大肠埃希菌。IPTG诱导重组蛋白的表达,再通过Ni-NTA亲和层析柱纯化后,用SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定;获得的重组蛋白行常规家兔免疫,以制备多克隆抗体,并应用ELISA测定抗体效价。结果:PCR扩增获得编码区全长为1506bp可编码501个氨基酸的RagB基因,测序结果与GenBank公布的序列(AJ130872)完全一致;构建了pET-32a-ragB原核表达载体,获得了高表达的融合蛋白,SDS-PAGE电泳和Western blot表明具有较高的纯度;ELISA结果显示,特异性兔抗RagB的多克隆抗体效价为1×105。结论:在成功构建牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB原核表达载体的基础上,高效表达及纯化了RagB融合蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体。为进一步开展牙龈卟啉菌疫苗研究、建立牙龈卟啉菌感染的实验室诊断方法奠定了基础。

牙龈卟啉菌相关疫苗防治牙周炎的现状研究

众所周知,牙周炎是发生在牙齿周围支持组织的细菌感染性疾病,以牙龈炎症和出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收和牙松动、移位以致脱落为主要症状。牙周炎主要发生在成人,是导致成人牙齿丧失的主要原因,在世界范围内均有较高的发病率。不仅如此,牙周炎还与许多系统性疾病（如心血管疾病、中风、冠状动脉粥样疾病及糖尿病）相关。

牙龈卟啉菌特异基因片段的体外扩增和鉴定

Ｐｇ与口腔感染性疾病关系密切．现根据Ｐｇ特异的菌毛亚单位蛋白结构基因设计寡聚核苷酸引物，采用ＰＣＲ技术扩增了其中长５４２ｂｐ的片段并对其进行了特异性鉴定。结果表明：所设计的引物能从５株Ｐｇ菌中扩增出大小一致的特异ＤＮＡ片段，但不能从其它１８株异种菌中扩增出产物，故具有高度的种特异性．其检测的敏感性为０．ｌｎｇ，为ＰＣＲ应用于口腔致病菌的检测奠定了基础。

牙龈卟啉菌、中间普氏菌的分离、培养和鉴定

目的 :采用厌氧培养和鉴定技术 ,分离牙周炎患者龈下菌斑中的牙龈卟啉菌和中间普氏菌。方法 :采集牙周炎患者的龈下菌斑 ,厌氧培养 ,分离产黑色素菌。经长波长紫外灯观察、各种生化分析和间接免疫荧光染色 ,分离和鉴定牙龈卟啉菌、中间普氏菌。结果 :在受检的 33例牙周炎患者中 ,2 4例患者检出了牙龈卟啉菌 ,总检出率为 72 .72 % ,共分离了 79株。 18例患者检出了中间普氏菌 ,总检出率为 5 4 .5 4 % ,共分离了32株。结论 :厌氧培养、生化反应鉴定技术的发展 ,使牙龈卟啉菌和中间普氏菌的分离与培养准确可靠 。

牙龈卟啉菌基因文库的建立

目的 通过构建牙龈卟啉菌 47A- 1的基因文库 ,为进一步深入研究牙龈卟菌的基因结构奠定基础。方法 选择 Sau3AI对牙龈卟啉菌 47A- 1染色体 DNA作酶切 ,获得的 DNA片段与 Bam HI酶解的质粒 p U C18作体外连接并转化大肠杆菌 JM10 9,在含有 IPTG、X- gal和氨苄青霉素的 L B琼脂平板上 ,用蓝、白筛选法选出含重组质粒的大肠杆菌扩增并分析。结果 得到的重组质粒经酶切、电泳分析 ,证实包含牙龈卟啉菌 47A- 1的插入片段。结论 牙龈卟啉菌 47A-

五倍子水提取物对牙龈卟啉菌膜泡抑制牙周膜成纤维细胞生物活性的影响

目的:探讨五倍子水提取物对牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalisPg)膜泡(extracellular vesicles ECV)抑制牙周膜成纤维细胞生物活性的影响。方法:采用体外培养的人牙周膜成纤维细胞,用3H-TdR掺入方法,检测ECV对人牙周膜成纤维细胞DNA合成的影响,以及中药五倍子提取物对ECV这一生物活性的阻断作用。结果:细胞培养物中加入50μg/mLECV时,人牙周膜成纤维细胞DNA的合成受到明显抑制,与空白对照组相比P<0.01。当同时加入各浓度五倍子水提取物时其DNA合成量明显增加,与ECV组相比均(P<0.05),且随五倍子水提取物浓度升高,DNA的合成量也随之增高,并呈一定浓度依赖性。结论:适宜浓度的五倍子提取物可有效地阻断ECV的这种生物活性作用,从而可推测其对牙周病的发生、发展能起到一定的阻断作用。

牙龈卟啉菌菌毛FimA基因高效植物表达载体的构建

目的:构建果实特异启动子驱动的含牙龈卟啉单胞菌菌毛FimA基因的高效植物表达载体,并进一步提高抗原基因的表达量和免疫原性,为研制有效的转基因植物牙周炎疫苗打下基础。方法:以提取的番茄基因组DNA为模板扩增番茄果实特异表达启动子E8的核心序列(约1.11kb),同时合成通过接头连接的霍乱毒素B亚基和FimA(266～337)(约600bp),并通过SOE PCR,即重叠区扩增基因拼接法(genesplicing by overlap extension)将两者拼接,拼接后的序列为EF。用EcoR I和Pst I分别双酶切EF序列及表达载体pCAMBIA1302,连接转化,得到的重组质粒pCAMBIA1302-EF用电击法转化根癌农杆菌GV3103。结果:重组质粒经PCR和酶切鉴定证明已成功转化。结论:本研究成功构建了番茄果实特异性启动子驱动FimA基因,以CTB为黏膜免疫佐剂的高效植物表达载体。

牙龈卟啉菌表面相关物质对多形核白细胞的影响

目的 :将牙龈卟啉菌表面相关物质和外周血中多形核白细胞共同培养 ,观察多形核白细胞的凋亡情况。方法 :通过流式细胞仪对 2 0名健康人外周血中多形核白细胞培养组 (对照组 )与牙龈卟啉菌表面相关物质和多形核白细胞共同培养组 (实验组 )进行比较研究 ,观察多形核白细胞的凋亡情况。结果 :实验组和对照组相比 ,多形核白细胞凋亡数明显减少 (P <0 .0 5 )。结论 :牙龈卟啉菌表面相关物质以浓度依赖的形式延缓多形核白细胞的凋亡 ,细菌延缓细胞凋亡在牙周可疑致病菌的致病机制中可能具有重要的作用。

牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K基因真核表达载体的构建和体外表达

目的 :构建牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K基因的真核表达载体 ,并检测其在体外真核细胞中的表达情况。方法 :利用基因重组技术构建牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K基因重组质粒pcDNA3.1( + ) -KGPcd ,然后通过脂质体将 pcDNA3.1( + ) -KGPcd瞬时转染COS7细胞 ,以RT -PCR和间接免疫荧光法检测重组质粒的转录水平和蛋白表达情况。结果 :成功构建了牙龈蛋白酶K真核表达载体 ;转染的COS7细胞中可检测到目的蛋白的转录和表达。结论 :成功构建了 pcDNA3.1( + ) -KGPcd真核表达载体并在哺乳动物细胞中能够正确转录和表达 ,为下一步作为基因疫苗免疫动物提供了依据。

牙龈卟啉菌和牙垢密螺旋体在不同深度牙周袋内的分布

目的：建立检测牙龈卟啉菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）和牙垢密螺旋体（Treponema denticola，Td）的实时荧光定量PCR方法，探讨尸窖和喇的定植量与牙周状况的关系。方法：建立SYBRGreenI荧光实时定量PCR法检测Pg和Td细菌数量的方法。采集43例慢性牙周炎患者的龈下菌斑并检测Pg和Td的检出率和细菌量，同时记录取样位点的牙周探诊深度。结果：在10^2-10^7范围内细菌数与Ct值有良好的线性关系，最低检测到Pg和蹦的DNA模板为100拷贝。尸窖和刚在慢性牙周炎患者中的阳性检出率、共同检出率和两种细菌数量均随着牙周探诊深度的增加而升高，多组探诊深度间有统计学差异。结论：慢性牙周炎的牙周状况与欢和刚的细菌数量密切相关。

牙龈卟啉菌核酸探针的制备、鉴定

根据Pg的特异的fimA基因设计一对引物,采用PCR技术扩增其中542bp长的DNA片段,用^(32)P标记作为探针与25株细菌DNA进行杂交鉴定.结果显示该探针能识别5株同种菌,而与其它20株异种菌DNA无阳性信号出现,探针的敏感性达到微微克级.提示该探针具有特异、敏感、快速、简便的特性.适用于对Pg的检测.

牙龈卟啉菌表面相关物质诱导外周血中淋巴细胞凋亡的体外研究

目的 :将牙龈卟啉菌表面相关物质和外周血中淋巴细胞共同培养 ,观察淋巴细胞的凋亡情况。方法 :通过流式细胞仪对 2 0名健康人外周血中淋巴细胞培养组 (对照组 )与牙龈卟啉菌表面相关物质和淋巴细胞共同培养组 (实验组 )进行比较研究 ,观察淋巴细胞的凋亡情况。结果 :实验组与对照组相比 ,淋巴细胞凋亡数明显增多 (P <0 .0 5 )。结论 :牙龈卟啉菌表面相关物质诱导外周血中淋巴细胞凋亡 ,细菌诱导细胞凋亡在牙周可疑致病菌的致病机制中可能具有作用。

牙龈卟啉菌核酸探针在临床牙周炎检测中的应用

随机选择门诊牙周炎患者１００人；无口腔感染性疾病者１００人。采用无菌纸捻从牙周袋（或龈沟）内吸取标本，用核酸探针杂交检测。结果表明：牙周炎中Ｐｇ的阳性率为８１％，而正常对照组中Ｐｇ阳性率仅为２８％，两组之间Ｐｇ阳性率相差非常显著（Ｐ〈０．０１０；有序分组资料的线性趋势检验分析显示：牙周炎中Ｐｇ随牙齿松动度的增大、牙周袋的加深、患者年龄的增高呈线性递增趋势（Ｐ〈０．０１）。