影响牛胚胎干细胞分离克隆因素的研究

采用与同源胎儿成纤维细胞共同培养及传统饲养层培养方式 ,以高糖DMEM ,添加 0 .1mM2 -巯基乙醇、犊牛血清、细胞因子为培养基 ,以 4～ 13周龄屠宰牛胎儿为实验材料 ,探讨影响牛原始生殖细胞分离克隆胚胎干细胞的相关因素。结果发现 :当犊牛血清为 15 %时效果最好 ;细胞因子添加与否对胚胎干细胞的分离及同源牛胎儿成纤维细胞的贴壁与生长影响并不显著 ,而在传代过程中有一定影响 ;以 0 .2 %胰酶 +0 .0 4 %EDTA为细胞消化液效果最佳 ;以同源胎儿成纤维细胞共培养的方式分离克隆牛胚胎干细胞 。

体外受精生产犏牛胚胎与移植试验研究

旨在探讨牦牛和黄牛种间体外受精和胚胎发育效果。通过研究黄牛和牦牛卵母细胞体外成熟时间、卵母细胞质量、精子处理方式、受精卵培养体系及冷冻—解冻后胚胎活力。结果表明:随着体外培养时间的延长,卵母细胞第一极体排出率增加,A级卵母细胞培养24h第一极体的排出率显著高于B级和C级卵母细胞,但相同体外成熟时间和相同分级的黄牛和牦牛卵母细胞第一极体的排出率差异不显著。用Percoll液梯度离心法和BO液洗涤法分别处理牦牛精液和黄牛精液后通过种间体外受精,BO液洗涤法处理的精液受精后的卵裂率显著高于Per-coll液梯度离心法处理精液受精后的卵裂率,而2种方法处理精液受精后其囊胚率差异不显著。2种方法(黄牛♀×牦牛♂vs.牦牛♀×黄牛♂)生产的早期犏牛胚胎用输卵管上皮细胞共培养和卵丘细胞共培养其囊胚率和孵化囊胚率都显著高于SOF液培养,而3种培养方法培养的早期犏牛胚胎的卵裂率差异不显著。2种IVF胚胎冷冻解冻后形态正常胚(90.52%±5.94%vs.91.53%±7.34%)、24h的存活率(61.45%±8.44%vs.64.72%±11.82%)和48h的存活率(44.81%±6.21%vs.48.47%±10.04%)均差异不显著。将黄牛♀×牦牛♂IVF犏牛胚胎移植到自然发情4头受体黄牛和3头受体犏牛,4头牛怀孕并产犊,妊娠率为57.14%,平均妊娠期258d。

巢式PCR扩增SRY基因序列鉴定牛胚胎性别的研究

源于牛X和Y染色体同源区的1对外引物P1、P2及其各自特异区的2对内引物P3、P4和P5、P6进行巢式PCR反应,对中国荷斯坦公、母牛静脉血样及牛胚胎样进行特异性条带鉴定。结果表明,中国荷斯坦公牛出现178bp和262bp2条带,而母牛仅出现262bp1条带;静脉血样与实际性别相符率为100%;巢式PCR胚胎性别鉴定技术方法准确、简便,具有很高的灵敏性及稳定性。

牛胚胎生殖细胞的分离与培养

胚胎生殖细胞 (Embryonicgermcells,EG)是由生殖嵴原始生殖细胞 (Primordialgermcells,PGCs)中分离得到的一种未分化而多潜能的干细胞。牛EG细胞的研究在EG细胞核移植、转基因及建立生物反应器方面具有广阔的应用前景。本研究从 2 9- 70日龄牛胎儿PGCs分离得到EG细胞 ,经过抑制分化培养 ,其中一个细胞系传至 6代。所分离得到的EG细胞具有典型的EG细胞形态 ,AP及PAS染色呈阳性 ,核型正常 ,同时观察到这些细胞在体外进行自发性分化 ,可形成类胚体。

牛胚胎在BRL/mTCM199和HECM-6/mTCM199培养体系中发育潜能的探讨

在两种培养体系下对牛胚胎早期发育进行了比较研究。把屠宰场收集的牛卵体外培养至成熟 ,然后进行体外受精。将受精卵置于下列两种培养体系中进行体外培养 :①Buffaloratliver细胞与改进的TCM199培养液共同培养系统 (BRL/mTCM199) ;②半确定培养液两步培养系统 [无血清的金黄地鼠培养液与改进的TCM 199培养液 (HECM - 6 /mTCM 199) ]。结果表明 :后者的囊胚率 (5 0 % )明显高于前者的囊胚率 (4 1% ,P<0 0 1)。表明牛胚胎早期分裂可在无蛋白培养条件下进行 ,并且在此培养条件下有良好的后续发育能力。这可能与两步培养体系中葡萄糖和氨基酸浓度不同有关。

不同饲养层对牛胚胎干细胞培养的影响

本研究建立牛胚胎干细胞(Bovine Embryonic Stem Cells ESCs)的分离培养体系,摸索牛ESCs的培养条件。对牛运用FSH减量注射法进行超数排卵获取胚胎。从获得的胚胎中分离ESCs,在不同的饲养层(牛骨髓间充质干细胞、牛成纤维细胞、牛乳腺干细胞)上培养,对牛ESCs进行形态学观察及鉴定。牛MSCs做饲养层与牛SFCs、牛MaSCs相比差异显著,牛MSCs的效果最佳(P<0.05)。牛ESCs在牛MSCs做饲养层的条件下更易生长。分析了不同饲养层对牛ESCs分离培养的影响,建立了一种分离培养牛ESCs的饲养层体系,为进一步深入研究ESCs的诱导分化和应用打下基础。

体外受精后不同时间收集的牛胚胎的冷冻效果

比较了体外受精后不同时间收集的牛囊胚期胚胎冷冻后的存活率。试验一收集受精后第６，７，８和９天出现的胚胎，分３步加入０．７５ｍｏｌ／Ｌ甘油和０．５ｍｏｌ／Ｌ丙二醇，将胚胎装入０．２５ｍＬ细管后，放入已降温至５℃的冷冻机内，立即以２℃／ｍｉｎ的速率降温至－７℃，停留５ｍｉｎ后植冰。植冰后５ｍｉｎ，以０．３℃／ｍｉｎ的速率降温至－２５℃，取出胚胎，并立即投入液氮中保存。解冻时，先让细管在空气中暴露１０ｓ，然后投入２０℃水中。在０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖溶液中１０ｍｉｎ稀释防冻剂。经体外培养９６ｈ后，第７天胚胎的存活率最高（７２．７％），显著高于第８天胚胎的存活率（５４．３％，Ｐ＜０．０１）。第６天、第９天胚胎的存活率分别为１８．８％和１８．２％，均显著低于第７天、第８天胚胎的存活率（Ｐ＜０．０１）。试验二用非手术法将２枚第７天或第８天的冷冻胚胎移入处于发情周期第７天的育成母牛子宫内，移植第７天一、二级胚胎的妊娠率分别为２８．１％（９／３２）和２１．６％（８／３７）；移植第８天一、二级胚胎的则分别为３３．３％（７／２１）、１７．６％（６／３４），４组间无显著差异（Ｐ＞０．０５）。４个组的双胚胎率分别为１１．１％（１／９?

影响本地杂交黄牛胚胎移植妊娠率的因素分析

本试验选用本地杂交黄牛作为受体,在同一饲养条件下,利用自然发情的方法,移植黑白花奶牛提供的胚胎,移植结果显示:胚胎发育日龄和受体发情日期同步移植,受胎率44.2%,8天受体移植7天桑葚胚,受胎率38.9%,7天受体移植8天囊胚,受胎率35.5%,三者比较差异不显著(P>0.05)。冻胚分别移植A、B、C级黄体的受体,其受胎率分别为40.4%、37.2%、33.3%,三者差异不显著(P>0.05);而鲜胚移植A、B、C级黄体,受胎率分别为48.6%,40.3%,25.8%,A、B级黄体移植受胎率差异不显著(P>0.05),A、C级黄体差异极显著(P<0.01),B、C级黄体差异显著(P<0.05)。不同胚胎质量比较:一、二、三级胚胎移植受胎率分别为50.5%、42.6、25.2%,三者比较,一级、二级胚胎受胎率差异不显著(P>0.05),但二级和三级差异显著(P<0.05),一级和三级差异极显著(P<0.01)。移植单胚和双胚的受胎率分别为25.2%,40.2%,二者差异显著(P<0.05)。

影响奶牛胚胎移植效果的主要因素分析

本研究分析了不同移植地点、受体牛来源、受体牛黄体位置、移植季节以及对受体牛实施尾椎硬膜外麻醉等对胚胎移植受胎率的影响。2013年9月～2015年3月,在内蒙古和北京地区移植奶牛胚胎745枚,平均受胎率为57.2%。内蒙古地区的A牛场胚胎移植受胎率（50.3%）低于北京地区的B牛场（65.5%）和C牛场（61.7%）,且差异显著（P〈0.05）,而同一地区的B牛场和C牛场之间差异不显著（P〉0.05）;不同来源受体牛受胎率比较,新西兰荷斯坦牛受胎率（57.4%）略低于澳大利亚荷斯坦牛（65.4%）和中国荷斯坦牛（65.5%）,但差异不显著（P〉0.05）,而澳大利亚荷斯坦牛与中国荷斯坦牛受胎率差异也不显著（P〉0.05）;受体牛不同黄体位置受胎率比较,左侧黄体受体牛受胎率（60.4%）略高于右侧（54.7%）,但差异不显著（P〉0.05）;移植季节对胚胎移植受胎率影响,以春季受胎率最高（71%）,其次是冬季（63.2%）,最低是秋季（60.6%）,但不同移植季节的胚胎移植受胎率没有显著差异（P〉0.05）;受体牛实施尾椎硬膜外麻醉的受胎率（66.7%）略高于未实施麻醉的受体牛（62.4%）,但差异不显著（P〉0.05）。

牛胚胎移植妊娠率主要影响因素分析

牛胚胎移植妊娠率受许多因素的影响，归结起来主要是由胚胎、受体和两者之间的相互作用的影响。

LIF和IGF-1对牛胚胎干细胞分离的影响

比较了添加 L IF,IGF- 1和 L IF+IGF对牛胚胎干细胞 (ES)分离的影响。结果表明 :1添加10 ng/m L L IF能提高胚胎贴壁率 ,促进内细胞团 (ICM)和 ES细胞的增殖并抑制其分化 ;2添加 10 ng/m L IGF- 1既能提高胚胎贴壁率 ,又能使 ICM明显增殖的时间和传代后集落出现的时间提前 ;3添加 10 ng/m L L IF+10 ng/m L IGF- 1,可以同时发挥两种生长因子的作用效果 ,更有利于牛胚胎干细胞的分离。

纯种和牛胚胎引进与繁育试验

日本和牛是当今世界公认的优秀肉牛品种之一。其肉大理石花纹明显，又称“雪花肉”。由于其肉质细嫩多汁，肌肉脂肪中饱和脂肪酸含量很低，风味独特，肉用价值极高，在日本被视为“国宝”，全球市场售价极其昂贵。本试验旨在借助日本和牛的优良肉用遗传基因，利用胚胎生物工程技术，进行纯种和牛良种繁育。

提高牛胚胎移植成功率的关键措施

自1951年Willett等获得牛胚胎移植成功以来．一些国家投入了大量人力、物力和财力进行研究与开发。到上世纪80年代，牛胚胎移植技术在发达国家开始进入商业化阶段．并得到迅猛发展。

牛胚胎干细胞分离克隆的研究

目的从牛原始生殖细胞中分离克隆牛胚胎干细胞。方法采用与同源胎儿成纤维细胞共同培养的方法,以高糖DMEM添加0.1 mM2-巯基乙醇、犊牛血清为培养基,以4-13周龄牛胎儿为实验材料,从牛原始生殖细胞中分离克隆牛胚胎干细胞。结果参与胚胎干细胞分离克隆的40例牛胎儿中,一体长6.5 cm的雌性胎儿胚胎干细胞传到15代;分离得到的牛胚胎干细胞,经碱性磷酸酶染色,体外分化实验,核型分析证明其具有胚胎干细胞的诸多特性。结论可以从4-13周龄牛胎儿的原始生殖细胞中分离克隆胚胎干细胞。

添加不同发情时期山羊血清对牛胚胎体外发育的影响

为了提高牛体外胚胎囊胚发育率 ,添加不同发情时期山羊血清对牛胚胎进行体外培养。分别采集发情周期 D0、D2、D4和 D7山羊血清 (发情当天为 D0 ) ,灭活除菌备用。结果表明不同发情时期羊血清对孤雌激活胚胎卵裂率影响差异不显著 ,囊胚发育率分别为 2 9.5 %、32 .4%、33.9%和41 .3% ,D7血清能显著提高囊胚发育率 ( P<0 .0 5 ) ,且扩张和孵化胚出现较早。添加 D0血清体外受精胚胎卵裂率较高 ,但对囊胚发育率影响差异不显著。说明孤雌激活和体外受精胚胎发育有差异 ,D7血清对胚胎后期发育有利。受精胚无血清培养 3d后添加 D7血清 ,囊胚发育率为 42 .9% ,是较为理想的培养方法。

奶牛胚胎移植技术研究报告

1986—1988年,我们共超排处理采集胚胎供体黑白花奶牛21头,获卵总数为196个,其中可用胚胎141个,每头平均6.71个。1987年超排成绩最好,每头平均获9.5个可用胚胎(全国每头平均3.8个),在国内居领先地位;其中有两头母牛先后获得21个(364号母牛)和32个(263号母牛)可用胚胎,连续两次创当时国内最高记录。第一批移植试验(1986.4—1987.10),将奶牛胚胎移植给30头受体牛(其中奶牛9头,黄牛21头),90天妊娠率为43.3％(13/30)。13头受体牛(奶牛5头,黄牛8头)先后产下了黑白花牛犊。

牛胚胎体外生产质量控制

牛胚胎体外生产质量控制就是在常规实验的基础上 ,避免额外因素对胚胎体外生产造成影响。本文从实验记录、卵母细胞、精液、培养条件。