应用甲基化特异性聚合酶链反应分析P15基因对成人急性白血病微小残留病灶的检测价值

目的 :评价由甲基化特异性聚合酶链反应分析P15基因甲基化对成人急性白血病微小残留病灶的检测价值。方法 :运用甲基化特异性聚合酶链反应 ,分析了 38例各种类型的急性白血病在初诊时和缓解后的不同阶段P15基因的甲基化状态。结果 :①甲基化特异性聚合酶链反应检测P15基因甲基化的敏感性为 2 .0× 10 -4。② 38例急性白血病初诊时的P15基因甲基化的出现率为 6 8.4 % ,正常对照组无甲基化。③P15基因甲基化可能与疾病的预后有关。经治疗后P15基因甲基化消失的病人与P15基因甲基化持续存在的病人复发率之间的差异有显著性 (0 %比 6 8.8% ,P <0 .0 1)。结论 :P15基因甲基化状态在急性白血病中有较高的检出率 (达 6 8.4 % )。应用甲基化特异性聚合酶链反应分析急性白血病P15基因甲基化状态的特异性和敏感性高。该指标可监测急性白血病微小残留病灶相关的情况 ,值得在临床上推广。

检测HBV基因组nt551A→G突变特异性聚合酶链反应的建立与初步验证

目的：建立一种特异而敏感的检测乙型肝炎病毒(HBV)基因组nt551位A→G变异株的方法。方法：根据已知的HBV基因组序列，结合国内主要流行亚型adr和adw的特点，合成在nt55l位分别为A或G两对引物，建立了突变特异性聚合酶链反应方法。结果：利用该方法对由16份乙型肝炎患者血清扩增的HBVS基因片段进行了初步检测。结果14份样本nt55l为A，l份为G，l份nt55l非A非G。经核苷酸序列分析表明结果正确。结论：该法是鉴定HBV基因组nt55l位A→G变异株的特异而敏感的方法。

巢式甲基化特异性聚合酶链反应在p16基因启动子过甲基化检测中的应用

目的 介绍巢式甲基化特异性聚合酶链反应 (nMSP)法 ,探讨了最佳PCR扩增条件 ,并用该法分析新鲜癌组织、石蜡包埋组织及肿瘤患者血清中p16基因启动子的甲基化状态。方法 将基因组DNA变性成为单链 ,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA ,将所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶 ,而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因特异引物 ,进行巢式聚合酶链反应扩增 ,最后经凝胶电泳检测目的片段。结果 在 3种类型的标本中都检测出了p16基因启动子甲基化。用甲基化特异性聚合酶链反应法 (MSP)和nMSP法分别检测 34例非小细胞肺癌 (NSCLC)患者血清 ,p16基因启动子甲基化阳性率分别为 5 3% (18/34)和 74 % (2 5 /34) ,nMSP法具有更高的灵敏度。结论 筑巢式甲基化特异性聚合酶链反应是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法 ,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化分析。

半巢式甲基化特异性聚合酶链反应在胃癌p16基因甲基化检测中的应用

目的 改进甲基化特异性聚合酶链反应 (MSP) ,采用半巢式MSP检测胃癌组织p16基因启动子区CpG岛的甲基化状态。方法 用亚硫酸氢盐修饰被测DNA后 ,采用半巢式MSP(引物分别为MS ,M1A和MS ,M2A) ,分析了 6 0例胃癌组织及相应正常组织中p16基因的甲基化状态。结果 单独用MSP ,胃癌组织中p16基因甲基化的发生率为 80 %。采用半巢式MSP ,甲基化发生率为86 7% ,比单独采用MSP提高了几个百分点 ,并提示胃癌病例的p16基因启动子区存在甲基化发生的不同模式。结论 半巢式MSP能够有效地提高灵敏度和减少假阳性。同时 ,免疫组化的结果也说明了p16基因异常甲基化与胃癌组织P16蛋白的表达密切相关。

等位基因特异性聚合酶链反应检验多药耐药基因的多态性

目的:建立分析MDR1基因-3435C/T多态性等位基因特异聚合酶链反应(AS-PCR)的方法,并分析中国汉族人群中这个位点的基因型和等位基因频率。方法:对202例中国汉族健康男性采用等位基因特异聚合酶链反应和核苷酸序列测定技术分析其MDR1基因-3435C/T多态性的基因型和等位基因频率。结果:MDR1基因-3435多态性位点有CC、CT、TT3种基因型,频率分别为32.2%,54.4%,13.4%。C和T等位基因频率为59.4%和40.6%。结论:等位基因特异聚合酶链反应(AS-PCR)简便、准确、快速,适合于MDR1-C/T基因多态性检测。

巢式甲基化特异性PCR检测肺癌病人WIF-1基因启动子区异常甲基化

为了检测肺癌患者血浆中WIF-1基因启动子区的甲基化状态,收集肺癌患者及健康对照者的血浆标本,采用巢式甲基化特异性PCR(nMSP)法检测WIF-1基因启动子区甲基化状态,并与普通甲基化特异性PCR(MSP)法进行了比较,结果在58例肺癌患者血浆样品中经nMSP法发现20例WIF-1基因启动子的过甲基化,用MSP法只检出10例,有吸烟史组WIF-1基因的甲基化率高于无吸烟史组(P<0.05).而20例正常对照血浆中都未检测到WIF-1基因启动子的过甲基化;表明利用巢式MSP(nMSP)法检测外周血血浆中WIF-1基因启动子的甲基化,可为非损伤性筛选和早期诊断肺癌提供有价值的信息.

等位基因特异性PCR方法检测炭疽芽胞杆菌致死因子基因点突变的评价

目的建立并评价等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)在筛选炭疽芽胞杆菌致死基因点突变中的作用。方法等位基因特异性PCR方法。结果等位基因特异性PCR扩增的筛选方法假阳性率较高,其特异性与引物3′端的碱基类型关系不大,与退火温度、模板浓度等均有关系。高保真Taq DNA聚合酶不能改善这种假阳性。结论等位基因特异性PCR筛选方法影响因素较多,假阳性率高,不适于直接作为点突变的筛选方法。

巢式甲基化特异性PCR检测肝细胞癌患者血清中RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化

为了检测肝细胞癌患者血清中RASSF1A和CDH13基因启动子的甲基化状态,收集肝细胞癌患者及健康对照者的血清标本,采用巢式甲基化特异性PCR(nMSP)法检测RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化状态.结果肝细胞癌患者血清样品中RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化率为53.12%和31.25%,68.75%的患者血清可以检测到异常甲基化,正常对照血清中未检测到RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化,RASSF1A和CDH13基因甲基化与患者的临床病理资料无明显相关性(P>0.05);表明nMSP法检测血清中RASSF1A和CDH13基因启动子区甲基化具有较高的敏感性,可为肝细胞癌的筛查、早期诊断和预后判断提供有价值的信息.

等位基因特异性多重聚合酶链反应技术对载脂蛋白E基因多态性检测的评价

载脂蛋白E（apolipoproteinE、apoE）是血浆主要载脂蛋白之一，具有明显的遗传多态性，3种常见的等位基因（ε2、ε3、ε4）分别编码3种主要异构体（E2、E3、E4），产生6种不同的基因型（ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4）。apoE基因多态性不仅是心血管疾病的一种重要易患因素，而且与Alzheimer病密切相关。

等位基因特异性多重聚合酶链反应方法用于快速检测结核分枝杆菌利福平耐药株

目的建立检测耐利福平(RFP)结核分枝杆菌的等位基因特异性多重聚合酶链反应(multiplex allele specific polymerase chain reaction,MAS-PCR)方法,快速、特异地检测rpoB基因核心突变区的主要突变,用于快速诊断结核分枝杆菌对利福平的耐药性。方法根据结核分枝杆菌的rpoB序列,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物,采用MAS-PCR技术,分别检测rpoB基因上531、526、516这3个最常见的突变位点的突变。结果对临床分离的利福平敏感株(15株)及利福平突变株(81株)进行检测,以直接测序结果为参照,对利福平耐药株的总检出率为81.5%(66/81)。结论MAS-PCR方法敏感、特异,可快速、简便地检测结核分枝杆菌rpoB基因突变,有利于耐药结核分枝杆菌的快速检测。

等位基因特异性多重PCR快速检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药性的初步研究

目的建立等位基因特异性多重聚合酶链反应(multiplex allele-specific PCR,MAS-PCR)技术,以快速检测结核分枝杆菌对喹诺酮的耐药性。方法根据结核分枝杆菌gyrA基因序列,分别设计4条特异性寡聚核苷酸引物,优化PCR条件,建立针对gyrA基因90和94位点突变进行检测的MAS-PCR技术,对临床分离菌株进行喹诺酮耐药性检测,同时以比例法和DNA直接测序法做对照。结果共对144株喹诺酮敏感株和56株喹诺酮耐药株进行了MAS-PCR检测。MAS-PCR与比例法比较,敏感性为53.57%(30/56);与DNA测序比较,敏感性为71.43%(30/42),特异性均为100%(144/144)。结论 MAS-PCR技术检测结核分枝杆菌对喹诺酮耐药性简便、快速、特异性高,但敏感性需进一步提高。

两种型特异性引物聚合酶链反应法检测乙型肝炎病毒基因型和亚型的评价

目的比较并评价本室创建的方法和日本Naito等建立的乙型肝炎病毒（HBV）型特异性引物聚合酶链反应（PCR）基因分型法。方法分别用新方法和Naito法检测系列稀释的含有A、D基因型和B1、C2亚型HBV基因组的质粒及不同浓度比例的B1／C2亚型混合质粒，评价两种方法的灵敏度和特异度。此外，用该两种方法分别对深圳市、河北邯郸市、新疆乌鲁木齐市送检的113份HBV DNA阳性慢性乙型肝炎患者的血清标本进行HBV基因分型，并对该两种分型方法检测结果不一致的血清样本，用PCR产物直接测序法分析。结果两种方法对单一型别的质粒样本灵敏度无差异，但新方法对B／C混合型质粒样本的灵敏度及对各型别质粒样本的特异度明显优于Naito法。该两种方法检测单一基因型血清标本的灵敏度无差异，但新方法对B／C混合型血清样本的检出率更高。该两种方法检测结果总符合率为83．2％（94／113），不一致率为16．8％（19／113）。从两法分型不一致的19份血清标本中，选取15份以PCR产物直接测序法进行分析，结果与新方法检测结果完全一致，而与Naito法不一致。结论本室建立的HBV型特异性引物-PCR基因分型法具有较高灵敏度，其特异度也明显优于目前临床上常用的Naito法，适用于HBV基因型和基因亚型的临床及流行病学研究。

血小板特异性抗原HPA-17bw基因分型及基因频率调查

目的对HPA-17bw基因分型并调查其在部分汉族人群中的分布。方法采用PCR-SSP方法对无亲缘关系的健康无偿献血者HPA-17bw进行基因分型,采用基因计数法进行基因频率、基因型频率的计算。结果259名正常人的HPA-17bw基因频率为0.000;HPA-17bw/bw的基因型频率为0.000。结论HPA-17bw为低频抗原,259份汉族样本中尚检测不出HPA-17bw。

子宫内膜癌中DKK-1基因启动子低甲基化改变与其临床病理特征的关系

目的探索Dickkopf相关蛋白1(DKK-1)基因启动子区甲基化变化与子宫内膜癌临床病理特征的关系。方法采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)对52例子宫内膜癌、30例子宫内膜不典型增生患者及25例正常子宫内膜受试者进行DNA甲基化状态检测。免疫组织化学[链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(immunohistochemistry,streptomyces antibiotin protein-peroxidase binding,IHC S-P)]法测定雌激素受体、孕激素受体在子宫内膜癌细胞中的表达。结果检测到38例(73.08%)子宫内膜癌组织中DKK-1基因启动子区发生低甲基化改变,而子宫内膜非典型增生组织中为14例(46.67%)及正常子宫内膜组织为9例(36.00%)(χ^(2)=11.289,P=0.030)。DKK-1低甲基化阳性率在子宫内膜癌患者的不同国际妇产科联盟(FIGO)分期、病理类型和分级、雌、孕激素受体表达中差异具有统计学意义(P=0.043)。结论DKK-1基因启动子区低甲基化可能是子宫内膜癌发生中的早期且频发事件,且可能与子宫内膜癌的侵袭、迁移和不良预后密切相关。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症与脓毒症引起的炎症反应有关

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺乏症是人类常见遗传多态现象。-方面此多态性可以减少疟疾发生率，另-方面严重创伤后缺乏G-6-DP会使临床病情恶化。最近美国科研人员用体外和体内实验研究了G-6-PD缺乏症与脂多糖（LPS）／细菌性脓毒症[盲肠结扎穿孔术（CLP）]后细胞因子和死亡率改变之间的关系。实验采用等位基因特异性聚合酶链反应（PCR）法检测了动物的基因型，采用基因序列分析、酶联免疫吸附法（ELISA）和流式细胞术（FACS）测定了巨噬细胞和脾细胞对内毒素的反应性，并观察了不同处理组动物的死亡率。实验用野生型和G-6-PD突变型小鼠进行杂交构建G-6-PD缺乏症动物模型，其G-6-PD缺乏程度类似于非洲人种中的G-6-PD缺乏症患者（正常值的20％）。

用聚合酶链反应技术对脆性X综合征进行筛查与诊断

目的 建立脆性 X综合征大面积快速筛查与诊断的方法。方法 用 7- deza- d GTP的 PCR法扩增脆性位点智力低下 1基因 (fragile X mental retardation gene1,FMR1)的 (CGG) n 的重复区 ,检测CGG重复数的大小 ,对脆性 X综合征进行筛查 ;用甲基化特异性 PCR法直接检测 FMR1基因的 5′端 Cp G岛是否甲基化 ,对脆性 X综合征进行诊断。结果 在一家系 14个成员中 ,我们筛查出 2例脆性 X综合征携带者、5例患者 ;并用甲基化特异性 PCR法对筛查的结果进行了验证。结论 采用 7- deza- d GTP扩增 GC富集区的 PCR法可以对脆性 X综合征男性携带者及患者进行快速鉴定 ;用甲基化特异性 PCR法可以对脆性 X综合征患者进行快速诊断。两种方法也适用于脆性 X综合征的产前筛查与诊断。

谷胱甘肽过氧化物酶3甲基化及蛋白表达在胃癌中的临床意义

目的探讨血浆谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)3基因启动子甲基化及GPX3蛋白表达在胃癌发病中的临床意义。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)方法检测胃癌组和胃炎组血标本中的GPX3甲基化程度;采用免疫组化方法检测胃癌组和癌旁正常组织标本中的GPX3蛋白表达情况,分析其与临床病理特征间的关系。结果 1胃癌组GPX3甲基化程度显著高于胃炎组(P<0.01);胃癌伴有淋巴结转移组GPX3甲基化程度显著高于无淋巴结转移组(P<0.05);胃癌组GPX3甲基化程度与患者年龄、性别和肿瘤分化程度、浸润情况、TNM分期无关(P>0.05);2胃癌组GPX3蛋白表达较癌旁正常组显著降低(P<0.01);胃癌伴有淋巴结转移组GPX3蛋白表达显著低于无淋巴结转移组(P<0.05);胃癌组GPX3蛋白表达与患者年龄、性别和肿瘤分化程度、浸润情况、TNM分期无关(P>0.05);3胃炎组GPX3蛋白表达与癌旁正常组无显著差异(P>0.05)。结论GPX3基因启动子区高甲基化通过下调GPX3蛋白表达,参与胃癌发生和促进淋巴结转移,有潜力成为诊断胃癌、判断预后的预警分子指标和临床治疗中的基因调控靶点。

胃癌环氧化酶-2、hMLH1及hMSH2微卫星不稳定与基因调控的关系

目的检测临床手术切除43例胃癌及相应正常组织COX-2、hMLH1和hMSH2微卫星不稳定状态MSI及三种基因启动子甲基化情况,并进一步探讨它们与胃癌发生的关系。方法采用聚合酶链反应(PCR)技术检测5个位点的MSI状态;甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR,MSP)方法检测胃癌及正常组织COX-2、hMLH1及hMSH2三种基因启动子CpG岛甲基化状态。结果43例胃癌中MSI总检出率为48.84%(21/43),五个位点的MSI检出率无显著差别。COX-2和hMLH1基因启动子CpG岛甲基化在43例胃癌中分别有8例和13例,正常组织中未检测到。hMSH2基因启动子CpG岛在胃癌及正常组织中均未检测到甲基化。在MSI-H组hMLH1基因启动子CpG岛甲基化率显著高于MSS组(P<0.01);而在MSI-H和MSI-L组间以及MSI-L和MSS无差别。MSI-H组中COX-2基因启动子CpG岛甲基化8例,且有7例胃癌同时出现hMLH1和COX-2基因启动子CpG岛甲基化。结论在MSI胃癌(尤其是MSI-H型胃癌)的发生、发展过程中可能同时出现了hMLH1和COX-2基因启动子CpG岛的甲基化(即表型遗传修饰)。MSI胃癌hMLH1基因启动子CpG岛甲基化率高于MSS胃癌,提示检测hMLH1基因启动子CpG岛甲基化对于判断肿瘤类型有一定意义。

卵巢癌HOXA10基因启动子区低甲基化改变与其临床病理特征的关系

目的:探讨HOXA10基因启动子区甲基化与卵巢上皮性癌(卵巢癌)的关系。方法:运用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)法检测29例卵巢癌标本及对照组16例正常卵巢组织中HOXA10基因启动子甲基化状态,并分析HOXA10基因甲基化状态与不同临床病理特征的联系。结果:检测到17例(58.62%)卵巢癌组织HOXA10基因启动子区发生低甲基化改变,另外4例甚至为完全去甲基化改变;而仅有4例(25.00%)正常卵巢组织HOXA10基因启动子区发生低甲基化(P<0.05)。HOXA10低甲基化阳性率随淋巴转移而增高(P<0.05)。不同年龄、瘤体大小、WHO病理分级、FIGO临床分期和HOXA10基因低甲基化未见明显相关性(P>0.05)。结论:HOXA10基因启动子区低甲基化为频发事件,提示与卵巢癌患者的不良预后相关,可作为卵巢癌判断预后的生物学标志物。