犬瘟热病毒和犬腺病毒2型双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

旨在建立犬瘟热病毒(CDV)和犬腺病毒2型(CAdV-2)双重TaqMan荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。本试验针对CDV的N基因和CAdV-2的E3基因设计两对特异性引物与两条标记不同荧光基团的TaqMan-MGB探针,对引物、探针的浓度、反应体系和反应条件进行优化后检测该方法的灵敏度,特异性及重复性。结果:该方法在CDV和CAdV-2阳性参考质粒浓度1×10^(1)~1×10^(7) copies/μL的范围中,R2值为0.997和0.993,表明所建的标准曲线具有良好线性关系,能检测到最低浓度为5 copies/μL,并对其他病原无扩增现象,特异性良好;重复性试验中组内和组间变异系数小于1.54%。综上,建立的双重TaqMan RT-qPCR检测方法具有灵敏度高且特异性好等优点,可用于CDV和CAdV-2临床快速检测和鉴别诊断及流行病学调查等领域。

犬腺病毒2型的分离鉴定和致病性分析

为了解湖北省犬腺病毒2型(CAV-2)的基因遗传变异特征,本试验从武汉市某比格犬养殖场采集免疫过犬四联活疫苗的临床发病犬的眼、鼻和肛拭子,将经PCR检测为CAV-2阳性的病料接种犬肾细胞(MDCK细胞)进行病毒分离,对CAV-2分离株进行电子显微镜观察和间接免疫荧光鉴定,E3、Fiber、Penton和E1b基因PCR扩增和测序分析以及致病性试验。结果显示:经分离和鉴定共获得3株CAV-2,分别命名为HB404株、HB405株和HB078株。3株CAV-2分离株的E3、Fiber、Penton和E1b基因与国外疫苗毒株相似性分别为98.4%~99.6%、99.3%~99.9%、99.8%~99.9%和99.5%~99.7%;3株分离株的E3、Fiber和Penton基因与国内流行毒株相似性分别为96.6%~97.5%、98.5%~99.7%和99.4%~99.9%。且3株CAV-2分离株与国外疫苗毒株在同一分支,与国内流行毒株不在同一分支。HB405株能使犬出现精神不振、食欲减退、眼鼻有分泌物、打喷嚏和咳嗽等临床症状。结果表明,3株分离株的亲缘关系与国外疫苗毒株较近,HB405株为强毒株,能够使犬发病。本试验结果可为CAV-2的诊断和预防提供参考依据。

犬瘟热、猫细小病毒、犬腺病毒弱毒株的理化特性及生物学试验

以鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）、猫肾传代细胞（ＣＲＦＫ）、狗肾传代细胞（ＭＤＣＫ）从引进的疫苗中分别分离到犬瘟热ＣＤＶ－Ａ株、猫细小病毒ＦＰＶ株、犬腺病毒ＣＡＶ１株。对三个弱毒株的细胞病变规律，形态特征，病毒滴度，理化特性，核酸型，血清学交叉反应，本动物的安全性及免疫原性等内容进行了试验。鉴定结果表明。

犬腺病毒、犬细小病毒联合PCR方法的建立与应用

根据GenBank报道的犬腺病毒(CAV)和犬细小病毒(CPV)序列,设计两对联合PCR引物,其中一对为CAV-1和CAV-2通用引物,另一对为CPV引物。在建立单项PCR基础上,通过优化Mg2+离子浓度和循环参数等反应条件建立联合PCR,确定联合PCR条件为:96℃180s,96℃30s,56℃30s,72℃80s,30个循环。联合PCR结果显示:CAV-1扩增片段大小为497bp,CAV-2为1019bp,CPV为719bp;细胞和其它相关病毒对照均无扩增带。上述PCR产物经用限制性内切酶酶切和克隆测序,结果均与相应病毒的应有条带和序列相同。敏感性比较试验结果表明,联合PCR比用细胞培养分离病毒敏感。将联合PCR应用于15份CAV和CPV细胞培养物,5份CAV-1、1份CAV-2和3份CPV人工感染犬病料以及30份临床病料检测,并与电镜负染、HA/HI及病毒分离等方法的结果进行比较,结果显示,联合PCR的检出率和病毒分离结果一致,高于电镜负染和HA/HI试验。以上结果说明:CAV-1/CAV-2和CPV联合PCR不仅具有很好的特异性和敏感性,而且可以在短时间内(2 5h～3h)同时鉴定出上述三种病毒,因此具有良好的实验室诊断和临床应用价值。

冀、京、吉犬群犬腺病毒中和抗体调查

目的为表达狂犬病病毒糖蛋白的犬2型腺病毒(CAV-2)重组狂犬病口服疫苗的投放工作提供流行病学依据。方法通过病毒中和试验对随机采自河北省,北京市,吉林省等地的387份犬血清进行犬腺病毒中和抗体检测,以确定犬群腺病毒感染率。结果河北、吉林农村流浪犬或家养犬腺病毒中和抗体阳性率较低,阳性率为16%(30/192),而北京市犬腺病毒中和抗体阳性率高达69%(135/195),说明城乡犬只犬腺病毒中和抗体存在明显差异。结论农村流浪犬或家养犬腺病毒中和抗体阳性率较低,适用于CAV-2及其重组疫苗首次免疫、尤其是口服免疫。

同时检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、Ⅰ型和Ⅱ型犬腺病毒多重PCR方法的建立

为建立检测多种犬病的多重PCR方法,本研究根据GenBank登录犬瘟热病毒(CDV)的N基因序列、犬细小病毒(CPV)的NS基因序列和犬腺病毒(CAV)的E3基因序列,设计合成3对特异性引物。通过优化反应条件,建立同时扩增CDV(507 bp)、CPV(287 bp)、CAV-Ⅰ(590 bp)和CAV-Ⅱ(1 027 bp)的多重PCR方法。实验结果表明:在同一PCR反应体系中可以同时检测以上4种病毒,而狂犬病病毒检测为阴性;CDV、CPV、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ的最低检出限分别为101.9TCID50、101.7TCID50、101.7TCID50和102.2TCID50。利用该方法对由黑龙江省不同地区所采集的30份犬病料样品进行检测,CDV阳性率为23.33%(7/30)、CPV阳性率为20%(6/30)、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ的阳性率均为3.33%(1/30),证明建立的PCR方法可以用于临床诊断。

犬瘟热病毒和犬腺病毒2型双重PCR方法的建立及应用

根据犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)和犬腺病毒2型(Canineadenovirus type2,CAV-2)GeneBank登陆的基因序列各设计一对引物,经试验条件优化,建立了检测CAV-2的PCR方法和CDV的RT-PCR方法,CAV-2可扩增1108bp片段、CDV可扩增560bp的目的片段,特异性试验表明建立的方法只能特异扩增CAV-2和CDV,不能扩增犬细小病毒、犬冠状病毒、犬副流感病毒、犬钩端螺旋体和犬黄胆出血群、狂犬病病毒。敏感性试验表明,所建立的双重PCR方法可以扩增4.63ng总核酸量。在上述试验基础上继续优化条件建立了能同时检测CAV-2和CDV两种病毒的双重PCR检测方法,并用该方法检测来自辽宁、吉林等15家动物医院134份鼻液和眼眵样品,与商品化试纸条检测结果相比,本方法更加敏感和方便。研究结果表明,本实验建立的方法敏感、特异,适用于动物犬瘟热病毒和犬腺病毒2型的快速检测和鉴别诊断。

犬腺病毒2型载体及其应用的研究进展

犬腺病毒2型也称犬传染性喉气管炎病毒,可诱导宿主产生细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫。将外源基因插入犬腺病毒2型早期转录区后可诱导宿主产生低水平的先天免疫,且能够在宿主体内安全、持续、稳定地表达外源基因,为基因转移提供了条件。犬腺病毒2型载体具有安全性和稳定性高、抗原表达能力强、易于进行各种遗传改造操作和携带大片段的外源基因等特点,是目前作为动物疫苗与基因治疗最有发展前景的非人类腺病毒载体之一。犬腺病毒2型载体已经广泛应用于动物疫苗研制、基因治疗等多个生物医学领域。笔者就犬腺病毒2型的分子生物学特性及犬腺病毒2型载体的发展、构建方式及在动物疫苗研制和基因治疗中的应用进行综述,旨在进一步挖掘犬腺病毒2型载体在基因治疗、动物疫苗研制中的作用,以及为下一代犬腺病毒2型载体平台的建设提供理论基础。

犬腺病毒纤突蛋白基因功能区的比较分析

根据GenBank中已发表的CAV纤突基因序列 ,设计合成 4对 8条引物 ,用已建立的PCR方法 ,对犬 2型腺病毒沈阳分离株第 5代强毒经蚀斑克隆驯化的第 6 0代毒弱毒 (SY_V6 0 )和犬 1型腺病毒长春犬株 (CCC_V6 )的纤突基因进行了扩增 ,PCR产物经纯化后进行基因序列测定 ,测定结果经拼接后得到一个由 16 32和 16 2 9个核苷酸组成的纤突蛋白全基因序列 ,分别编码 5 43和 5 42个氨基酸。犬 2型腺病毒 (SY_V6 0 )与犬 1型腺病毒 (CCC_V6 )的纤突基因的同源性达到 80 .48%。犬 2型腺病毒(SY_V6 0 )与犬 1型腺病毒 (CCC_V6 )纤突基因的同源性达到 80 .48% ;根据犬的腺病毒与人 2型腺病毒纤突蛋白的序列同源性比较结果 ,推测了犬腺病毒纤突蛋白的尾 (tail)、轴 (shaft,)、结 (knob)三个功能区的氨基酸序列 ,2个型之间的尾区同源性为 76 .9% ;轴区同源性为 78.5 9% ;其结区同源性为 83.2 4% ,而同型毒株之间结和尾区同源性较高 。

犬腺病毒DNA疫苗的免疫实验研究

目的研究犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop刺激机体产生免疫应答的效果。方法采用2种不同的免疫途径和免疫方案免疫Balb/c小鼠;免疫后每周断尾采血,分离血清测定血清IgG抗体效价;采用MTT和CCK-8方法检测免疫小鼠的T淋巴细胞增殖活性,EIA试剂盒测定IFN-γ的浓度。结果所有接种DNA疫苗的小鼠均产生了针对抗原病毒的特异性IgG抗体。细胞学试验提示构建的犬腺病毒DNA疫苗也可诱导小鼠产生细胞性免疫应答,重组质粒-蛋白联合的免疫方案在刺激机体细胞免疫应答方面优于单一重组质粒。结论以上结果提示犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop既能诱导小鼠产生特异性的体液免疫应答,也诱导小鼠产生了细胞免疫应答,对于机体具有一定的免疫保护效果。

犬腺病毒Ⅰ型和Ⅱ型Taq Man双重荧光定量PCR方法的建立

为鉴别检测犬腺病毒(CAV)Ⅰ型和Ⅱ型,根据GenBank中CAV-I和CAV-II型参考基因序列,设计合成1对通用引物和2条鉴别探针,建立了可鉴别检测CAV-Ⅰ型和CAV-Ⅱ型的双重荧光定量PCR检测方法。同时,对该方法进行了优化,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了试验,并与普通PCR检测方法进行样品检测符合率分析。特异性试验结果显示;本研究建立方法对犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬冠状病毒均未产生扩增曲线。敏感性试验结果显示,建立方法对CAV-Ⅰ的检测敏感度为100copies/μL,对CAV-Ⅱ的检测敏感度为10copies/μL。重复性试验结果显示,组内和组间变异系数均小于5%。临床样品检测对比结果显示,建立方法与普通PCR方法的符合率为95.12%。结果表明,本研究建立的TaqMan双重荧光定量PCR方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好等优点,可用于临床鉴别检测CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ型。本研究为CAV-I和CAV-II型感染的检测、鉴别以及流行病学调查提供了便捷快速的方法。

不同型犬腺病毒纤突蛋白基因序列的比较分析

根据已发表的ＣＡＶ纤突基因序列，用ＰＣＲ方法，对４个ＣＡＶ－２毒 株和４个ＣＡＶ－１毒株的纤突基因进行了扩增和测序，测定的核苷酸序列经推导得到分别编 码５４３和５４２个氨基酸的ＣＡＶ纤突蛋白全序列。测定的ＣＡＶ－２比较表明：我国流行的ＣＡＶ－２ ＳＹ 强毒株与国外标准强毒株Ｔｏｒｏｎｔｏ Ａ２６／６１株相同，其驯化致弱的毒株与驯化前相比在１１３４位 发生碱基颠换。测定的ＣＡＶ－１比较表明：我国流行的ＣＡＶ－１株与标准强毒ＲＩ２６１株差异相对 较大，而国内ＣＡＶ－１毒株互相之间相对差别较小。ＣＡＶ－２与ＣＡＶ－１纤突基因的同源性为８０．４８％。

应用电镜技术和血凝试验检测犬细小病毒和犬腺病毒

电镜技术和血凝试验是检测犬细小病毒和犬腺病毒快速而简便的方法。本试验结果表明,两种方法检验结果大部分相符,但各具特色。电镜技术的优势在于能够直观地显示目标病毒的生长发育、粒子的完整性以及有无非目标病毒、细菌、支原体等污染情况,这对于动物病毒疫苗种毒质量的检测是十分重要的。

犬腺病毒Ⅰ型流行毒株的分离与鉴定

目的 分离、鉴定犬腺病毒 型流行毒株 .方法 将处理过的病犬肝组织悬液 ,感染原代犬胎肾细胞 .用血凝试验、中和试验、回归试验以及电镜观察等方法 ,分离、鉴定 .结果 分离出一株犬腺病毒 型流行毒株 ,命名为 CAV1 -XN3株 .

狂犬病毒中和线性表位重组犬腺病毒2型载体的构建

本试验成功构建了表达狂犬病病毒糖蛋白膜外区3个中和线性表位的重组犬腺病毒2型两个重组质粒。引用相关文献已报道的狂犬病病毒糖蛋白膜外区的3个中和线性表位基因,通过有柔性氨基酸将其3个表位基因相连。将重叠延伸PCR获得3个串联表位基因片段克隆入含犬腺病毒2型YCA18株纤突头部HI环的中间载体pBluescript II KS(+)中,然后用SalⅠ和PacⅠ将中间载体中含3个串联表位的纤突部分回收,克隆至缺失纤突部分的犬腺病毒2型全基因组重组质粒pPloyII-CAV-2及pPloyII-CAV-2-CGS中。经鉴定成功获得在犬腺病毒2型纤突头部HI环处插有狂犬病毒3个串联表位的两个重组质粒,分别命名为pPoly II-CAV-2-RG和pPoly II-CAV-2-CGS-RG。经软件对犬腺病毒2型纤突蛋白的构象分析表明,在其HI环插入外源抗原表位基因不影响其免疫原性。本试验为进一步研制多抗原表位展示性重组疫苗、新型狂犬病疫苗奠定基础。

重组犬腺病毒2型疫苗的研制现状

犬腺病毒2型引起的传染性喉气管炎是一种常见的动物传染病。犬腺病毒2型可诱导感染的宿主产生细胞、体液和黏膜免疫应答,可通过分子生物学技术改造为理想的疫苗载体,从而表达寄生虫和病毒的多种蛋白。这些病原体包括刚地弓形虫、犬细小病毒、猫瘟病毒、犬瘟热病毒、狂犬病毒、犬冠状病毒、汉城病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒等,本文拟就这方面的研制现状进行阐述。

犬腺病毒Ⅱ型弱毒疫苗株的分离、鉴定与筛选

应用犬肾传代细胞 (MDCK) ,通过人“O”型红细胞吸附和氯仿处理等方法 ,从美国犬四联弱毒疫苗中分离出一株腺病毒 ,经形态、理化及生物学特性等系统鉴定证明 :该毒株是犬Ⅱ型腺病毒 ,命名为CAV2 XN3 株。实验将该病毒复制成弱毒疫苗 ,免疫 8只 2月龄当地幼犬 ,经临床观察证明 ,试验犬未出现不良反应 ;免疫后 14天采血测定血清中和抗体效价达到 1∶12 8,免疫后 2 5天血清中和抗体效价达到 1∶2 5 6 ,免疫后 10个月降至 1∶32 ,但仍能耐受强毒攻击 ,而对照组 4只犬则发病死亡。表明该弱毒疫苗激发免疫快 ,免疫期长 ,安全有效。

不同型犬腺病毒纤突蛋白基因序列的比较分析

根据已发表的CAV纤突基因序列,用PCR方法,对4个CAV-2毒株和4个CAV-1毒株的纤突基因进行了扩增和测序,测定的核甘酸序列经推导得到分别编码543和542个氨基酸CAV纤突蛋白垒序列。测定的CAV-2比较表明:我国流行的CAV-2SY强毒株与国外标准强毒株TorontoA26/61株相同。其驯化致弱的毒株与驯化前相比在1134位发生碱基颇换。测定的CAV-1比较表明:我国流行的CAV-1株与标准强毒RI261株差异相对较大,而国内CAV-1毒株互相之间相对差别较小CAV-2与CAV-1纤突基因的同源性为80.48%。