猪β-防御素-2在黄曲霉毒素B1致小鼠肠道炎症损伤中的作用

旨在探究猪β-防御素-2(pBD-2)在黄曲霉毒素B1(AFB1)致鼠肠道损伤中的作用。本试验以4周龄KM小鼠为研究对象,将体重相近的30只健康小鼠随机均分为5组,分别为空白对照组(不做任何处理)、DMSO组(1%DMSO灌胃)、AFB1组(0.3 mg/kg AFB1灌胃)、pBD-2组(0.03 mg/kg pBD-2灌胃)和AFB1+pBD-2组(0.3 mg/kg AFB1灌胃28 d后再用0.03 mg/kg pBD-2灌胃28 d),试验持续56 d,通过观察小鼠肠道结构的变化以及采用qPCR和免疫荧光的方法检测炎症相关因子的表达水平。结果:与对照组相比,AFB1组小鼠的平均日增重(ADG)和平均日采食量(ADFI)均呈现显著下降趋势(P<0.05),料重比(F/G)降低,但差异不显著(P>0.05),而小鼠饲喂pBD-2以后ADG和ADFI均较AFB1组显著增加(P<0.05);HE染色结果显示,AFB1导致小鼠空肠黏膜显著损伤,并伴有严重的肠壁变薄,肠绒毛萎缩、稀疏,肠绒毛高度与隐窝深度之比、相对肠绒毛数量及肠壁厚度均显著降低(P<0.05),而使用pBD-2处理小鼠损伤模型,肠道结构可见显著恢复(P<0.05);qPCR和免疫荧光染色结果表明,AFB1处理小鼠可显著上调白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05),但对白细胞介素-8(IL-8)的表达水平出现了下调趋势,而用pBD-2处理小鼠损伤模型后可显著下调炎症因子的表达水平,说明pBD-2对AFB1造成的肠黏膜炎症具有缓解作用。本研究结果为AFB1中毒的防控及pBD-2在畜牧生产中的应用提供了科学依据。

猪β-防御素-2基因在大肠杆菌中的融合表达及抑菌活性检测

将猪β-防御素-2基因(pBD-2)片段正确连接到pET32a载体上,从而得到稳定表达pBD-2的大肠杆菌表达株。根据已报道的pBD-2基因序列,按大肠杆菌密码子优化原则合成了5条pBD-2基因片段,通过重叠延伸PCR(SOE PCR)方法将这5段延伸成完整的pBD-2基因序列,将该基因定向插入原核表达质粒pET32a的多克隆位点上,成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出TrxA-pBD2融合蛋白。结果显示,表达的融合蛋白用肠激酶切掉TrxA后做琼脂孔穴扩散法检测,pBD-2对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性,表明试验获得表达pBD-2的大肠杆菌菌株。

猪防御素基因pBD-2在大肠杆菌中的重组和融合表达

哺乳动物防御素是动物机体在抵御病原微生物的防御反应中产生的一类重要的抗菌肽物质,具有十分广泛的抗菌谱,在先天免疫上起重要作用。本研究根据已报道的pBD-2基因cDNA序列,合成了3条基因片段(1、2、3)。片段1、2和片段2、3各有15个碱基互补配对,PCR扩增延伸得到pBD-2基因,将pBD-2基因克隆至原核表达载体pGEX-KG,成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出pBD-2融合蛋白。pBD-2基因的成功表达为进一步研究其抗菌活性打下了基础。

猪β-防御素-2在黄曲霉毒素B1致仔猪空肠上皮细胞炎症反应中的作用

以仔猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)为模型,探究猪β-防御素-2(porcineβ-defensin 2,pBD-2)在黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)致细胞炎症反应中的作用。使用CCK-8法确认不同质量浓度(20,40,60,80,100 mg/L)AFB1及不同质量浓度(2,4,6,8,10 mg/L)pBD-2的细胞毒性,筛选两者的可用质量浓度,再通过qPCR确认不同质量浓度(10,20,30,40,50 mg/L)的AFB1对IPEC-J2细胞TNF-αmRNA及IL-1βmRNA表达的影响,建立AFB1致细胞损伤模型。然后分别以2,4,6,8 mg/L pBD-2处理细胞损伤模型作为试验组,同时分别以单独使用AFB1和pBD-2处理的细胞作为阳性对照组和阴性对照组,未经任何处理的细胞作为空白对照组,所有细胞处理均进行12 h。处理结束后提取所有组细胞总RNA和总蛋白,使用qPCR及Western blot检测TNF-α及IL-1β的表达变化。细胞存活率检测结果显示,与空白对照组相比,60 mg/L及更高剂量AFB1组细胞存活率显著降低(P<0.05);pBD-2在10 mg/L出现细胞毒性,细胞存活率显著低于空白对照组(P<0.05)。细胞损伤模型建立结果显示,与空白对照组相比,AFB1在30 mg/L时显著上调了TNF-αmRNA和IL-1βmRNA的表达(P<0.05)。使用pBD-2处理细胞损伤模型,qPCR结果显示,4,6 mg/LpBD-2可显著下调AFB1所致TNF-αmRNA及IL-1βmRNA的过量表达至空白对照组水平(P<0.05);Western blot结果显示,AFB1显著上调TNF-α及IL-1β的表达后(P<0.05),8 mg/L pBD-2可下调TNF-α的表达至显著低于空白对照组水平(P<0.05),6,8 mg/L pBD-2可显著下调IL-1β的表达至空白对照组水平(P<0.05)。结果表明,pBD-2可通过调控细胞炎性因子的表达来缓解AFB1对小肠上皮细胞造成的炎症反应。

pBD-2对热应激致小鼠小肠形态结构损伤及紧密连接蛋白表达的修复作用

为了研究猪β-防御素-2(porcinβ-defensin2,pBD-2)对热应激致小鼠小肠形态结构损伤及紧密连接蛋白表达的修复作用,试验将36只1月龄昆明小鼠随机分为空白对照组、热应激组和热应激+pBD-2组,每组12只。空白对照组和热应激组每天每只小鼠按体重10μL/g以灌胃的方式给予生理盐水,热应激+pBD-2组每天每只小鼠按体重0.01μg/g以灌胃的方式给予pBD-2。灌胃后将热应激组和热应激+pBD-2组放入40℃温箱热应激处理1 h,取出后与空白对照组一起放置于室温下进行饲养。按照相同的方式共处理28 d,并于第28天处理后断颈处死。每天灌胃前观察各组的行为,记录采食量并称重,试验结束后计算各组平均日采食量和平均日增重,并对小鼠进行剖检,分别取十二指肠、空肠、回肠组织进行石蜡切片制作和H.E.染色,比较各组肠绒毛高度与隐窝深度比值和单位面积内杯状细胞数目,并采用免疫组织化学技术对紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-3和Occludin进行检测与相对表达量分析。结果表明:试验期间,空白对照组无异样行为;热应激组探索行为增加,焦虑好动;热应激+pBD-2组比热应激组安静。热应激组平均日采食量显著高于热应激+pBD-2组和空白对照组(P<0.05),而热应激+pBD-2组和空白对照组间差异不显著(P>0.05)。空白对照组和热应激+pBD-2组平均日增重显著高于热应激组(P<0.05),空白对照组和热应激+pBD-2组平均日增重差异不显著(P>0.05)。空白对照组肠道健康、无红肿,肠道内容物适中;热应激组肠道表面充血、红肿,肠道内容物较多;热应激+pBD-2组肠道无红肿现象,肠道内容物较少。热应激组十二指肠、空肠、回肠绒毛高度与隐窝深度比值均显著低于空白对照组和热应激+pBD-2组(P<0.05),空白对照组和热应激+pBD-2组间差异不显著(P>0.05)。热应激+pBD-2组十二指肠和空肠单位面积内杯状细胞数量显著高于空白对照组和热应激组(P<0.05),空白对照组显著高于热应激组(P<0.05);热应激+pBD-2组回肠单位面积内杯状细胞数量显著高于热应激组(P<0.05)且与空白对照组间差异不显著(P>0.05),热应激组与空白对照组间差异不显著(P>0.05)。空白对照组和热应激+pBD-2组十二指肠、空肠和回肠中ZO-1蛋白的相对表达量显著高于热应激组(P<0.05),空白对照组和热应激+pBD-2组间差异不显著(P>0.05)。空白对照组十二指肠和空肠中Claudin-3蛋白的相对表达量显著高于热应激组和热应激+pBD-2组(P<0.05),热应激+pBD-2组显著高于热应激组(P<0.05);各组回肠中Claudin-3蛋白的相对表达量差异不显著(P>0.05)。空白对照组十二指肠中Occludin蛋白的相对表达量显著高于热应激组,但热应激+pBD-2组与空白对照组、热应激组均差异不显著(P>0.05);空白对照组和热应激+pBD-2组空肠和回肠中Occludin蛋白的相对表达量显著高于热应激组(P<0.05),但空白对照组和热应激+pBD-2组间差异不显著(P>0.05)。说明热应激处理会影响小鼠的消化吸收功能和小肠形态结构,降低小鼠小肠中紧密连接蛋白的表达量,而pBD-2对热应激造成的上述影响具有较好的修复作用。