猪流感病毒的演化

猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)是感染猪的一种。呼吸道病毒,可对公共卫生产生重要影响。以往研究通过全基因组测序以及分子生物学、流行病学等多方面的手段,全面揭示了SIV的演化进程。为了更好地理解和应对SIV演化,对其演化历程进行了简要回顾,系统梳理了其分类、基本特征、演化及流行。通过对SIV演化的深入分析,发现其基因变异频率较高,不断发生基因重配和突变,推动病毒不断演化。此外,在猪群中发现了多种亚型SIV,而且不同地区的SIV演化存在显著差异,其中一些地区的SIV可能存在感染人的潜在风险。总体而言,SIV演化是一个复杂而动态的过程,其演化趋势可能对人类和动物健康构成潜在威胁。因此,加强对SIV演化的研究,提高对其监测和控制的能力,对于维护畜牧业健康发展和公共卫生安全具有极为重要的意义。

1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

【目的】了解广东地区猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)的流行情况并探究其分子生物学特征。【方法】采集广东某猪场疑似猪流感病毒感染猪的鼻拭子和肺脏组织样品进行病毒分离鉴定、遗传进化和关键氨基酸位点分析。【结果】样品经实时荧光定量RT-PCR检测为猪流感病毒核酸阳性;在红细胞凝集试验中,该病毒对鸡红细胞有凝集作用,血凝效价为1∶128;8个基因片段序列结果经BLAST比对和进化树分析显示,HA、NA基因属于欧亚类禽猪流感病毒(H1N1)分支,PA、PB 1、PB 2、NP和M基因属pdm/09分支,NS基因属于北美三源重组分支,因此,本试验分离株属于G4基因型欧亚类禽猪流感病毒,将其命名为A/swine/Guangdong/CJM2/2022(H1N1)。关键氨基酸位点分析显示,分离株HA蛋白裂解位点序列为PSIQSR/GL,具有典型低致病性流感病毒的分子特征。HA基因在受体结合位点处的190、225、226位氨基酸分别为D、E、Q,表明其既具有结合人型唾液酸受体的潜能又具有结合禽型唾液酸受体的潜能。NA基因关键氨基酸残基均未发生突变,提示分离株对奥司他韦和扎那米韦等神经氨酸酶抑制剂的敏感性较高,而M基因3处氨基酸位点突变为V27A、A30T、D44A,提示对金刚烷胺类药物耐药性增加。【结论】本研究分离鉴定的毒株为G4基因型欧亚类禽猪流感病毒,关键氨基酸位点分析提示该毒株具有适应在哺乳动物中复制和毒力增强的特征。本研究结果为广东地区猪流感的防控提供了参考数据。

猪流感病毒通用型微滴式数字RT-PCR绝对定量检测方法的建立

为建立灵敏且可绝对定量检测猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的微滴式数字RT-PCR(ddRT-PCR)方法,以SIV M基因的保守序列为靶基因,设计并合成一套特异性引物和TaqMan探针,建立了可对主要流行的H1N1、H1N2和H3N2亚型SIV绝对定量检测的通用型ddRT-PCR方法。随后,对该方法的敏感性、特异性和重复性进行评价,并利用临床猪鼻咽拭子样品进行检测验证。结果显示:建立的ddRT-PCR方法检测限达到1.6 copies/µL,灵敏度极高;能特异性检出H1N1、H1N2和H3N2亚型SIV,与猪瘟病毒等其他常见猪病病原均无交叉反应;重复检测结果的批内和批间变异系数(CV)分别为0.75%、3.17%,重复性良好;经临床样品检测验证,建立的ddRT-PCR和荧光RT-qPCR方法分别检出阳性样品72、66份,提示前者在检测低病毒拷贝样品时较荧光RT-qPCR更优。结果表明,本研究建立的SIV通用型ddRT-PCR方法灵敏度高,特异性和重复性均良好,且在检测低病毒含量临床样本时更具优势,可作为一种对SIV感染进行早期诊断和绝对定量检测的有效方法。

1株H1N1亚型猪流感病毒的进化分析及分子特征研究

【目的】鉴定贵州省猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)的流行株及其分子生物学特征,为猪流感的病原学研究和流行病学调查提供重要参考。【方法】从贵州省部分养殖场采集猪鼻腔拭子70份,采用RT-PCR和接种犬肾上皮细胞(MDCK)对疑似猪流感的阳性样品进行病毒分离鉴定,对分离株进行克隆测序获得全基因组序列,运用生物信息学在线软件分析毒株的遗传重组情况和关键氨基酸分子特征。【结果】试验分离到1株H1N1亚型SIV,命名为A/swine/Guizhou/ZY/2022(H1N1)。经全基因组测序和遗传进化分析结果显示,该毒株属于G4型欧亚类禽H1N1 SIV。生物信息学在线预测发现,分离株的HA和NA基因属于欧亚类禽H1N1分支,NS基因属于北美重组分支,其余基因片段属于2009年大流行H1N1分支。分离株的HA蛋白裂解位点为PSIQSR↓GL,存在4个潜在糖基化位点,其受体结合位点和抗原位点与欧亚类禽H1N1 SIV高度一致;NA蛋白结构完整,存在5个潜在糖基化位点;分离株PB2蛋白发生了Q ^(591) R、R ^(251 )K突变,PB1蛋白和M2蛋白分别发生了N^( 375) S、L^( 473 )V和S^( 31) N突变。【结论】从贵州省分离到1株三源重排H1N1亚型SIV,属于G4型欧亚类禽H1N1病毒,其与人源唾液酸α2,6-Gal受体的结合能力可能有所增强,提示需加强对猪流感的流行监测。

一株H1N1亚型猪流感病毒的遗传演化分析及在雪貂体内复制和飞沫传播能力评估

本实验室于2016年在天津分离到一株猪流感病毒(SIV),命名为A/swine/Tianjin/312/2016(H1N1)(简称为TJ312株)。为了解该株病毒的生物学特性及遗传演化特征,本研究对经PCR分段扩增该病毒全基因组并测序,采用SeqMan软件拼接成全基因组序列经BLAST比对,得到与该SIV各基因节段序列同源性最高的病毒株,采用mafft分析其各基因节段编码氨基酸序列的分子特征,利用MEGA5.1软件分别构建该病毒8个基因节段的进化树。结果显示,SIV TJ312株各基因节段与2016年分离自天津的H1N1 SIV相应各基因节段的同源性在99%~100%。进化树结果显示该病毒株HA、NA和M基因均来自欧亚类禽H1N1(EA H1N1)SIV谱系;PB2、PB1、PA和NP基因来自2009/H1N1流感病毒谱系;NS基因来自北美三重配H1N2 SIV谱系。蛋白分子特征分析结果显示,HA蛋白碱性氨基酸裂解位点序列为PSIQSR↓G,符合低致病性流感病毒分子特征;受体结合位点符合人源唾液酸受体(α-2,6唾液酸受体)的分子特性;NA蛋白aa275为H、aa295为N,且该蛋白头部区域未缺失,表明该病毒对奥司他韦类药物敏感;PA蛋白^(356)R为病毒复制增强和对哺乳动物致病性增强的分子特征;NP蛋白存在^(41)I以及^(210)E病毒聚合酶活性增强的分子特征;M2蛋白的^(31)N表示该SIV对金刚烷胺类药物耐药。将该病毒以10^(6) EID_(50)/只经鼻腔感染2只雪貂,感染后96 h剖杀,采集各脏器组织观察其剖检病变并对出现病变的肺脏制备病理切片观察其组织病变,采用免疫组化试验检测肺脏组织中的病毒抗原。将采集的所有脏器处理后接种鸡胚检测脏器内的病毒滴度评估该病毒在雪貂体内的复制能力;将该株病毒以上述剂量经鼻腔感染3只雪貂分别放入3个铁笼内作为感染组,24 h后在相邻3个铁笼内分别放入1只未感染雪貂作为传播组。所有雪貂自感染组接种病毒后2 d起,隔天采集鼻洗液至第14 d,通过检测雪貂鼻洗液内的病毒滴度与感染后21 d血清HI抗体效价评估病毒在雪貂间的飞沫传播能力。结果显示,TJ312株感染后引起雪貂肺脏明显的剖检病变,其余脏器均无肉眼可见病变。肺脏病理切片及免疫组化结果显示,肺脏组织出现了一定的病理损伤,且支气管上皮细胞中出现大量棕黄色和深棕色颗粒,即检测到了病毒抗原。病毒滴定结果显示,TJ312株在雪貂呼吸道内复制良好,在其鼻甲中复制能力最强,平均病毒滴度6.13 log_(10)EID_(50)/mL,在其肺右下叶中的复制能力次之,平均病毒滴度可达6 log_(10)EID_(50)/mL。在脾脏、肾脏、肝脏中均未检出病毒。但在1只雪貂的脑中检出微量病毒,滴度为0.63 log_(10)EID_(50)/mL。飞沫传播试验中,感染组3只雪貂的鼻洗液中均检测到高滴度的病毒,病毒滴度最高达5.50 Log_(10)EID_(50)/mL,血清中均检测到了高水平的HI抗体效价(1∶1280、1∶1280、1∶2560);传播组3只雪貂中有1只鼻洗液病毒滴定结果呈阳性(最高达5.75 Log_(10)EID_(50)/mL)且其血清中检出较高的HI抗体效价(1∶2560)。上述结果表明,TJ312株可能是由2016年天津其他H1N1 SIV间的基因节段重组而来,且该株病毒存在部分耐药性及对哺乳动物致病性增强的氨基酸分子特征。病毒在雪貂的呼吸道中复制水平较高并对其肺脏造成损害,且可以通过飞沫在雪貂间传播。本研究为进一步了解EA H1N1 SIV的生物学特性及探究其感染机制提供一定的参考依据。

猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪流感病毒四重PCR检测方法的建立

为了快速、准确检测4种猪呼吸道病毒,根据NCBI GenBank数据库中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪流感病毒(SIV)的基因序列,设计4对特异性引物,建立一种能通过扩增片段大小来同时鉴别检测PRRSV(111 bp)、PRV(173 bp)、PCV2(273 bp)、SIV(445 bp)的四重PCR检测方法。特异性试验结果显示,扩增PRRSV、PRV、PCV2、SIV模板均能得到预期特异条带,而扩增灭菌水(阴性对照)、CSFV、JEV不产生任何条带。敏感性试验结果显示,该方法最低病毒核酸检出量分别为PRRSV(6.5×10^(4)copies/μL)、SIV(2.68×10^(5)copies/μL)、PCV2(7.16×10~5copies/μL)、PRV(2.37×10^(4)copies/μL)。用所建立的四重和各单一PCR方法检测45份临床样品,四重PCR的阳性检出率分别为PCV2 22.2%(10/45)、PRRSV 17.7%(8/45)、PRV 4.4%(2/45)、PRRSV+PCV2 13.3%(6/45),四重PCR方法与单一PCR方法的阳性符合率为100%。表明建立的病毒四重PCR检测方法特异性强、敏感性高,可用于上述4种呼吸道病毒的鉴别检测。

欧亚类禽H1N1猪流感病毒抗原性变异关键氨基酸的鉴定与分析

【背景】流感病毒的抗原性主要是由病毒的表面糖蛋白HA决定的,前期利用欧亚类禽型H1N1猪流感病毒(EA H1N1 SIV)HA蛋白单克隆抗体(mAb)筛选抗原逃逸株发现,HA蛋白190、230和269位(H3编码)氨基酸的改变能够导致病毒发生抗原逃逸,并发现在新近分离的EA H1N1 SIV HA蛋白广泛存在这3个氨基酸的变异。【目的】进一步探索哪些氨基酸对病毒的抗原性具有关键作用,为流感的防控提供科学依据。【方法】选取一株病毒A/swine/Liaoning/SY72/2018(H1N1)SY72为模式病毒,建立该病毒的反向遗传系统(RGS),又以SY72为骨架,拯救含有HA基因190、230和269单点突变重组病毒;利用rSY72病毒制备灭活疫苗,分别免疫SPF鸡和非免疫猪制备其相应的血清,通过中和试验和血凝抑制(HI)试验分析病毒的抗原性,确定影响病毒抗原性的关键氨基酸位点;继而评估HA蛋白不同位点氨基酸的改变对病毒复制特性及受体结合特性等的影响。【结果】分析SY72病毒的HA氨基酸序列发现,该病毒HA蛋白分别含有190D、230M和269R。利用反向遗传技术,分别拯救了病毒rSY72及单点突变病毒rSY72HA/D190N、rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M;中和试验结果表明,与rSY72相比较,3株突变病毒均能够与两株mAbs发生一定反应;HI试验结果显示,与rSY72相比较,突变病毒rSY72HA/D190N与rSY72免疫鸡血清和猪血清的反应减弱,HI抗体效价分别出现了4倍和8倍的差异,而病毒rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M与两种血清的反应差异不明显,表明HA蛋白190位氨基酸改变对病毒的抗原性影响最为明显;病毒蚀斑测定及复制动力学研究结果发现D190N的氨基酸替换导致病毒rSY72HA/D190N在MDCK细胞上形成的蚀斑减小,而R269M的氨基酸替换导致病毒rSY72HA/R269M在MDCK细胞上的复制能力下降;3个位点的氨基酸替换均未影响病毒的受体结合特性。【结论】HA蛋白190位氨基酸对EA H1N1 SIV抗原性具有决定作用,269位氨基酸突变使得病毒在MDCK细胞上的复制能力降低。这提示在后续开展的病原学监测中要密切关注这些氨基酸的变异情况,提高对动物流感的预警预报。

2017—2020年我国中南地区猪流感病毒感染情况的血清学调查研究

为了调查猪流感病毒(swine Influenza virus, SIV)在我国中南地区猪场的流行情况,试验采用血凝抑制(HI)试验对2017年7月份—2020年9月份采集的5 514份猪血清样品进行抗体阳性率的测定,并通过GraphPad Prism 8软件对抗体阳性结果进行了不同季节、猪群、地区的统计分析。结果表明:血清抗体总阳性率为56.31%,其中欧亚类禽H1N1亚型猪流感病毒(EA1 H1N1 SIV)的抗体阳性率最高,为31.19%,H3N2、EA2 H1N1、pdm09 H1N1、CS H1N1、H9N2和H4N8 SIV的抗体阳性率分别为19.15%、11.72%、13.78%、7.22%、1.31%和0.16%,未检测到H5N1、H6N6、H7N9亚型抗体,在猪群中不同亚型和不同分支的SIV混合感染情况较为普遍。EA1 H1N1 SIV在春冬季节较为流行,pdm09 H1N1 SIV在春夏季节较为流行,EA2 H1N1和H3N2 SIV无明显的季节性变化。公猪的EA1 H1N1 SIV抗体阳性率显著高于仔猪及保育猪和母猪(P<0.05),母猪的pdm09 H1N1 SIV抗体阳性率显著高于仔猪及保育猪和公猪(P<0.05),仔猪及保育猪的H3N2 SIV抗体阳性率极显著高于母猪(P<0.01)。福建省的EA1 H1N1 SIV抗体阳性率最高,河南省的pdm09 H1N1 SIV抗体阳性率最高。说明SIV普遍存在于中南地区各猪场中。

一株欧亚类禽H1N1亚型猪流感病毒的遗传进化分析及其对小鼠的致病力研究

猪流感病毒(SIV)是一种重要的人兽共患病毒,不仅对养猪业造成重大的经济损失,也对其他哺乳动物和人类有潜在感染风险。本研究团队前期对山东猪群常规流行病学调查时分离到一株H1N1亚型SIV,简称SW/SD/260/2021株,为了解该SIV的生物学特征和其对小鼠的致病性,本研究利用鸡胚对病毒纯化传代后,采用Reed-Muench方法测定SIV SW/SD/260/2021株EID50、TCID50,对其全基因组测序并分析其同源性。采用MEGA7.0中的邻接法构建HA和NA基因的进化树。进一步将该SIV以106 EID50/只滴鼻感染小鼠,于感染后3 d剖杀各组小鼠,采集各脏器组织,检测其体内病毒的复制情况,剩余小鼠在14 d内观察临床症状、记录体质量等,评价该SIV对哺乳动物的致病性。结果显示,该病毒株经纯化后EID50为107.25/0.1 mL,TCID50为105.67/0.1 mL;全基因组序列的BLAST比对结果显示,该病毒株的8个节段与来自辽宁、天津、Oman(阿曼苏丹)、江苏等多地不同年份的H1N1猪或人流感病毒高度同源。小鼠致病性试验结果显示,该病毒在小鼠的鼻甲和肺中呈高水平复制,病毒滴度均达104 EID50以上;感染组小鼠出现精神沉郁、被毛凌乱、食欲减退、体质量快速下降等症状,并于感染后第4 d全部死亡。本研究对欧亚类禽H1N1亚型SIV的序列进行分析,阐明了该病毒的基因遗传演化、分子特征和致病性,并揭示了欧亚类禽H1N1亚型SIV的跨种传播风险,为我国SIV的监测和SI的防控提供参考依据。

一株H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定及小鼠致病性的研究

为了初步了解从江苏某屠宰场分离鉴定出的一株猪源H1N1亚型猪流感病毒(SIV)A/Swine/Jiangsu/1070/2019(H1N1)的6致病性,对该分离株纯化后进行全基因序列分析,测定其生物学特性,并以10 EID50病毒感染BALB/c小鼠。序列分析结果显示,该病毒HA基因的裂解位点为339PSIQSR↓G347,符合低致病性SIV的分子特征,与A/Swine/Jiangsu/J006/2018(H1N1)同源性最高达到98.94%,NA基因与A/Swine/Shandong/LY142/2017(H1N1)同源性最高达到98.79%,内部基因PB2、PB1、PA、M、NP和NS分别与2018年出现的不同猪源H1N1亚型具有高同源性,因此该病毒是一株在猪体内重组的病毒;病毒在鸡胚上的半数感染量(EID50)为10-8.5/0.1 mL,在MDCK细胞上的半数感染量(TCID50)为10-5.22/0.1 mL;小鼠致病性结果显示,该病毒除可导致小鼠体重下降外,还具有致死小鼠的能力,小鼠的致死率约为33.3%,其能够在小鼠的肺脏和心脏中复制,滴度分布达到2.91±0.19 lg EID50/mL和2.37±0.29 lg EID50/mL,感染后可造成小鼠肺部组织发生严重炎性反应,并导致炎性相关细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α的表达水平明显上调(P<0.01)。综上表明该毒株为新型重组病毒,对小鼠具有一定致病性,为H1N1亚型猪流感的预警和防控提供一定的参考依据。

一株H1N1亚型猪流感病毒全基因组特征分析

旨在了解吉林地区猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的流行情况并探究其分子生物学特征,本研究采集吉林某猪场疑似SIV感染猪的鼻拭子样品接种鸡胚分离病毒并对该分离株进行全基因组扩增、遗传进化分析、功能性氨基酸位点分析及选择压力分析。结果显示:病毒分离鉴定表明,分离株为H1N1亚型SIV,遗传进化分析显示,分离株全基因组的8个基因节段均属于经典猪流感病毒谱系,未出现流感病毒不同基因型之间的基因重排。功能性氨基酸位点分析显示,毒株出现SIV致病性、毒力及复制能力增强的相关位点突变,NA基因具有神经氨酸酶抑制剂耐药性相关位点突变。选择压力分析显示,SIV HA和NA基因在吉林省的自主变异进化明显,NA的突变率高于HA。本研究获得的H1N1亚型SIV分离株全基因组序列分析结果对SIV流行病学调查及后续疫苗研发具有一定意义。

影响猪流感病毒致病性和传播性的关键氨基酸位点的研究进展

猪流感病毒(SIV)在猪群中广泛传播,给养猪业造成重大的经济影响。流感病毒主要是通过病毒基因组的突变和不同来源流感病毒基因组的重新组合来完成自身的进化。通过以上两种方式产生的流感病毒对动物的致病性和传播性会出现显著改变。在这篇综述中,我们对影响SIV致病性和传播性的关键氨基酸位点的突变进行了归纳和分析,为进一步研究SIV的致病机制等方面奠定了基础。

山东省H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定及其致病性评价

本试验从山东省某集团养猪场采集疑似猪流感(swine influenza, SI)病猪的鼻拭子样品25份,将样品处理后接种10日龄SPF鸡胚,培养72 h后收集鸡胚尿囊液进行血凝试验和RT-PCR分型鉴定,并对分离到的病毒进行基因测序以及对仔猪致病性研究。结果显示,成功从鼻拭子样品中分离到一株猪流感病毒(swine influenza virus, SIV),经RT-PCR分型鉴定为H1N1亚型SIV,命名为A/swine/Shandong/12/2023(H1N1),简称SIV H1N1 SD12株。序列比对分析显示,SIV H1N1SD12株HA基因与GenBank中的A/swine/Shandong/LY059/2019(H1N1)的同源性最高为97.82%,HA蛋白的裂解位点为PSIQSRGL,具备低致病性SIV的分子特征,蛋白具有6个潜在糖基化位点;NA基因与A/swine/Beijing/0301/2018(H1N1)的同源性最高为97.80%,NA蛋白具有7个潜在糖基化位点,与NA抑制剂类药物敏感性相关的氨基酸位点未发生改变。致病性实验结果显示,感染组的仔猪出现猪流感典型症状(发热、流涕、喷嚏等),鼻拭子样品均检测到SIV排毒,剖检后仔猪肺脏出现实变,表明SIV H1N1 SD12株对仔猪具致病力。综上,本研究成功从山东省分离到1株H1N1亚型SIV,遗传进化分析显示SIV H1N1 SD12株属于欧亚类禽分支,对仔猪具有致病性,这为H1N1亚型SIV流行情况监测和猪流感防控提供参考。

辽宁地区5株H_(1)N_(1)亚型猪流感病毒分子特征与遗传进化分析

研究旨在了解辽宁地区猪群中猪流感病毒(SIV)的分子特征及遗传进化规律,探究其特异性分子靶标,为猪流感的防控提供参考。试验收集辽宁不同地区分离到的5株SIV,对其进行全基因组测序分析。利用DNAStar、MEGA6.0等软件对测序基因片段进行开放阅读框(ORF)核苷酸同源性分析,并构建遗传系统进化树。结果显示,5个分离株属于类禽型H_(1)N_(1)SIV株,各基因同源性分别为HA 95.4%~99.7%、NA 97.3%~99.8%、M92.6%~99.8%、NP 97.3%~99.1%、NS 96.1%~98.1%、PA 97.7%~99.3%、PB1 97.1%~99.8%和PB2 96.8%~99.2%。在8个基因片段中,HA、NA和NS基因均属类禽型H_(1)N_(1)进化分支,PB2、PB1、PA、NP基因属于人H_(1)N_(1)流感进化分支,M基因分属类禽H_(1)N_(1)SIV分支和人H_(1)N_(1)流感分支,而NS基因属于经典型H_(1)N_(1)SIV分支。研究表明,流行于辽宁地区SIV毒株中出现不同基因型流感病毒片段之间的重组情况,分离株HA蛋白裂解位点序列为PSIQSR↓G,具有典型低致病性流感病毒的分子特征。

SLC35A1对猪流感病毒复制的影响

猪流感(Swine influenza,SI)是由猪流感病毒(SIV)引起的猪的一种常见呼吸道疾病,在冬季、气温变化较大的季节多发,而且往往诱发猪蓝耳病、支原体病等其他疾病。SLC35A1是一种重要的宿主因子,本文研究结果显示,SLC35A1能显著影响猪流感病毒的复制,为研发有效防控猪流感新药,提供了新思路。

猪流感病毒的分离鉴定

用SPF鸡胚从我国东北地区猪群中分离出 3株H3 N2 猪流感病毒 (SIV) ,分别命名为A/Swine/Heilongjiang/ 1/ 2 0 0 0、A/Swine/Heilogjiang/ 2 / 2 0 0 0和A/Swine/Heilogjiang/ 3/ 2 0 0 0。SIV分离株第 8代病毒液对 0 .5 %豚鼠红血球的血凝价分别为2 0 48log2 、2 0 48log2 、40 96log2 ;将其制成琼扩 (AGP)抗原与禽流感标准阳性血清均出现清晰白色沉淀线 ;与流感病毒H3 亚型标准阳性血清的血凝抑制 (HI)价分别为 8log2 、7log2 、7log2 ,但不能被鸡新城疫阳性血清抑制。这 3株SIV都为热不稳定型 ;均能凝集驴、绵羊、鸡、兔、豚鼠、小鼠、大鼠、人O型血红血球 ,对马、牛红血球均不凝集 ;感染一个病毒最小致死量的鸡胚平均死亡时间分别为 86 .4、12 9.6和 91.2小时 ;每 0 .2ml病毒液鸡胚半数感染量分别为 4.75lg、4.5lg、和 6 .0lg ;对鸡的静脉内接种致病指数和脑内接种致病指数各为 0 .5 6、0 .32、0 .5 2和 0 .77、0 .38、0 .5 2 ;对小鼠的半数致死量分别为 2 .6lg、2 .0lg和 2 .5lg ;试验感染小鼠、豚鼠和猪均可发病并出现死亡。存活动物接种后第 6天和第 14天的血清 ,其HI价均在 8log2 以上 ,而AGP均为阴性。

猪流感病毒核蛋白基因的原核表达及其在诊断中的初步应用

根据GenBank中A/Swine/HongKong/126/82(H3N2)株猪流感病毒(SIV)NP基因核苷酸序列设计合成一对引物,经RT＿PCR扩增了我国SIV分离株A/Swine/Heilongjiang/3/2000(H3N2)的核蛋白(NP)基因。将扩增所得NP基因克隆于pMD18＿T载体,酶切鉴定后对其序列分析表明NP基因与香港分离株同源性高达93.8%,然后定向亚克隆NP基因于原核表达载体pET30(a)的多克隆位点中,经酶切鉴定后,将含有NP基因的重组质粒命名为pET＿NP。用pET＿NP转化受体菌BL21,用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导,并在不同诱导时间收集样品。经SDS＿PAGE电泳分析证实NP基因获得了表达,并在终浓度为1mM的IPTG诱导下,6h其表达量达到高峰,经Westernblot分析证实表达的重组核蛋白具有反应活性,大小约为60kD。用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与SIV抗血清可形成清晰的反应沉淀线,而与其它9种猪病原阳性血清不发生反应。正常菌体蛋白与SIV阳性血清也不发生反应。通过对40份送检血清样品的检测结果显示其与HI试验的相符率高达95%以上。试验证明利用原核表达系统制备的重组核蛋白作为诊断用抗原,不仅制备过程简单而且所建立的琼扩诊断方法特异、快速、简便,其灵敏度也能满足现地的使用要求。目前正在进行现地的中试试验。

H1N1亚型猪流感病毒中国分离株血凝素基因分子演化的研究

对 2 0 0 1年中国华南及东北地区的 15株H1N1亚型猪流感病毒 (SIV)分离株的血凝素 (HA)基因进行了序列测定和分析 ,并绘制了进化树。研究结果表明 ,15株H1N1SIV和HA基因核苷酸全长为 1778bp ,共编码 5 6 6个氨基酸 ;而且 ,15株H1N1亚型SIV的HAI蛋白在 10、11、2 3、87、2 87位都存在高度保守的糖基化位点 ,此外 ,在 2 76位多了一个“_NTT_”糖基化位点 ,与参考毒株SW /IW / 93/ 0 1一致 ,这可能是近期H1N1亚型SIV的一个分子特征。本研究进一步发现 ,15株H1N1亚型SIV的HA基因切割位点氨基酸组成为IPSIQSR↓G ,具有非高致病力毒株分子特征 ;而其受体结合位点在HA蛋白上第 2 2 6位是Q ,第 2 2 8位是G ,可能具有感染禽的潜力。经同源性比较 ,15株H1N1亚型SIV的HA基因与古典型H1N1猪谱系中的WIS/ 4 75 4 / 94的同源性相对最高 ,核苷酸和氨基酸序列同源性分别达到 95 7%～ 96 1%和96 5 %～ 97 2 %。由同源性比较结果和进化树分析可见 。

中国“人-猪-禽”基因重排H1N2亚型猪流感病毒全基因克隆及遗传进化的研究

【目的】为了研究2006年从广西病猪肺组织中分离的H1N2亚型猪流感病毒(SIV)A/Swine/Guangxi/13/2006(H1N2)(Sw/GX/13/06)的遗传学特性和8个基因的来源。【方法】运用RT-PCR方法对其全基因进行了克隆并运用分子生物学软件对其基因序列进行了遗传进化分析。【结果】血凝素(HA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)基因来源于猪古典H1N1亚型流感病毒;神经氨酸酶(NA)和聚合酶蛋白(PB1)基因来源于人的H3N2亚型流感病毒;聚合酶蛋白(PA)和聚合酶蛋白(PB2)基因来自于禽流感病毒。【结论】可见Sw/GX/13/06是一株"人-猪-禽"三源基因重排H1N2亚型SIV,且与美国(1999?2001年)和韩国(2002年)分离到该型病毒的有明显的亲缘关系。据我们所知,这是中国首次报道含有禽流感病毒基因片段的重排H1N2SIV,该病毒是否对养猪业和人类公共卫生健康具有潜在的威胁,有待于进一步研究。

H1N1亚型猪流感病毒广东分离株全基因克隆及其遗传演化分析

为了研究H1N1亚型SIV遗传演化与变异的特性,采用RT-PCR技术分别扩增A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)的8个基因片段,分别将其克隆到pMD18-T载体,进行全基因组序列测定。核苷酸序列测定结果显示:LM株SIV各基因片段均未发现核苷酸插入或缺失现象。HA切割位点处的氨基酸序列序列为IPSIQSR↓G,与高致病性SIV的H1N1亚型毒株的分子特征不符合。HA基因含有6个潜在的N-糖基化位点,4个在HA1的第11、23、87、和276位,增加2个分别在HA2的154和213位点;NA基因不仅在58、63、68、88和146位含有高度保守的N-糖基化位点,而且在44和235位增加2个潜在的N-糖基化位点,这可能是近期H1N1亚型SIV的一个分子特征。核苷酸同源性结果:HA基因与类人谱系的流感病毒分离株有很高的同源性(99%),而其他基因均与古典猪谱系的流感病毒分离株同源性较高(87%～98%)。从绘制的各个片段进化树和核苷酸同源性分析结果,可以推测该毒株HA基因可能来源于类人谱系的流感病毒;而其他基因来源于古典猪谱系的流感病毒。