猪流行性腹泻病毒基因组和诊断方法研究进展

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED),是一种急性、高度接触性、高发病率和高致死率的猪肠道传染病,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。深入了解PEDV的基因组结构和功能是研制高效安全疫苗的关键。通过解析PEDV的基因组结构、编码的蛋白质以及其与宿主细胞的相互作用,研究人员可以设计出更具针对性的疫苗候选物。诊断技术的进步对于PED的早期诊断及免疫后应答水平监测和评估至关重要。因此,综述了PEDV的基因组结构与功能(包括S、E、M、N、辅助蛋白和非结构蛋白)、血清学以及分子诊断方法[如酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增(LAMP)、病毒中和(VN)和间接免疫荧光测定(IFA)、免疫层析试验(ICA)、荧光微球免疫测定(FMIA)、序列测定和聚类规则间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(Cas)]的最新进展,旨在为建立快速有效的PEDV检测方法提供思路,并为临床上有效防控PED提供参考。

猪流行性腹泻病毒实时荧光RT-RAA检测方法的建立及应用

为了建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的方法,试验基于PEDV N基因保守区域设计3对特异性引物和1个探针,通过引物的筛选和反应温度的优化建立PEDV实时荧光逆转录重组酶介导等温扩增(reverse-transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)检测方法,对该方法进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验,并分别采用该方法和实时荧光定量RT-PCR检测方法对72份猪淋巴结、肝脏等组织临床样品进行检测,计算两种方法的符合率。结果表明:建立的实时荧光RT-RAA方法在41℃条件下反应20 min即可完成检测,对PEDV的最低检测限为1×10~1拷贝/μL;且仅能检测出PEDV,与传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PRoV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV-3)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4,PCV-4)、伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)均无交叉反应;相同拷贝浓度的质粒标准品3次重复的扩增曲线几乎重合,起峰时间与荧光值没有明显差异。对72份临床样品进行检测,该方法与实时荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。说明建立的实时荧光RT-RAA方法敏感性高,特异性和重复性良好,同时耗时短、操作简单,可用于PEDV的临床检测。

2022年湖北地区猪流行性腹泻流行病学调查

1材料所有病猪材料均来自湖北地区猪场送检的猪腹泻样本。全自动PCR分析系统(Gentier 48R),购自天隆科技有限公司。核酸提取仪(VNP-32P)购自南京诺维赞医疗科技有限公司。核酸提取试剂盒(Fastpure Viral DNA/RNA Mini Kit V2),购自南京诺维赞医疗科技有限公司,细菌核酸提取试剂盒(Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒),购自杭州博日科技股份有限公司。

猪流行性腹泻病毒变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法的建立及临床应用

为了建立一种快速鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的病原学方法和掌握洛阳市PEDV变异毒株的流行规律,试验根据GenBank中PEDV变异毒株的特异性序列设计引物,通过优化退火温度、模板添加量、引物添加量建立PEDV变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法,并分析了该方法的特异性、敏感性和重复性;同时应用该方法检测采集自洛阳市的251份临床样品,并对不同地区、不同年份、不同养殖模式的检测结果进行比较分析。结果表明:优化后的退火温度为51℃,模板添加量为5μL,引物添加量为0.5μL;该方法对PEDV变异毒株能够扩增出550 bp特异性条带,而检测的PEDV经典毒株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均为阴性;对PEDV变异毒株RNA的最低检测限达到0.74 ng,对3份PEDV变异毒株阳性病料和3份PEDV变异毒株阴性病料重复检测3次的结果完全一致;检测采集于洛阳市251份临床样品的平均阳性率为29.48%,其中不同地区阳性率介于13.33%~44.44%之间,2018—2022年阳性率介于28.30%~31.58%之间,散养户和规模化猪场的阳性率分别为38.24%和19.13%。说明试验建立的PEDV变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法特异、敏感、稳定、准确,洛阳市PEDV变异毒株的流行特点为个别地区较严重的情况、近几年流行率基本持平、散养户流行情况较规模化猪场严重。

猪流行性腹泻病毒微芯片荧光定量RT-qPCR检测方法的建立

为了建立简便快速的猪流行性腹泻病毒(PEDV)荧光定量RT-qPCR检测方法,根据GenBank数据库公布的猪流行性腹泻病毒囊膜蛋白E基因,设计特异性引物和探针结合微芯片技术,建立微芯片荧光定量RT-qPCR检测方法。该方法除对PEDV检测为阳性外,对与其同源性较近的致病病毒的检测均为阴性;最低检测限为1 copies/μL,常规荧光RT-qPCR检测限为10 copies/μL。批内、批间重复性试验表明,Ct值变异系数均在2%以内,可对PEDV临床样本进行检测。建立的检测方法特异性好、敏感性高、检测时间短且重复性好,适用于临床检测。

CD44通过影响猪流行性腹泻病毒复制调节钠氢交换体3活性

本研究旨在研究CD44(cluster of differentiation 44)对感染猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)中钠氢交换体3(NHE3)表达及膜转移的影响。以IPEC-J2为细胞模型,采用RT-qPCR和Western blot检测感染PEDV后不同时间点IPEC-J2细胞中NHE3和PEDV N表达量变化;转染质粒调控IPEC-J2中CD44表达后,采用TCID50和Western blot检测PEDV感染后不同时间点PEDV复制水平和NHE3蛋白表达变化,采用火焰原子吸收法检测IPEC-J2细胞内外Na^(+)浓度变化。转录组数据和细胞试验结果显示,与对照组相比,PEDV感染后IPEC-J2细胞中CD44蛋白表达水平和mRNA表达量均呈上调趋势,24~48 h内上升显著(P<0.05),而PEDV N蛋白表达水平在12~48 h内则呈显著下降趋势(P<0.05)。此外,CD44重组质粒转染试验结果显示,与PEDV感染组相比,过表达CD44后感染PEDV组细胞中病毒滴度和PEDV N蛋白表达水平显著降低(P<0.05),而干扰CD44后感染PEDV组细胞中病毒滴度和PEDV N蛋白表达水平则显著上升(P<0.05)。以上结果表明,高表达CD44具有抑制PEDV复制的作用,干扰CD44后PEDV复制增多。同时,为研究PEDV感染情况下,CD44是否参与了IPEC-J2细胞中NHE3表达的调节,采用Western blot和火焰原子吸收法检测了调节CD44后膜NHE3蛋白的表达水平和细胞内外Na^(+)浓度。结果表明,过表达CD44显著促进了膜NHE3蛋白的表达和活性(P<0.05),细胞内外Na^(+)浓度逐渐恢复正常水平。相反,干扰CD44显著降低了膜NHE3蛋白的表达和活性(P<0.05),细胞内外Na^(+)浓度呈现失衡状态。结果提示,CD44可能是缓解PEDV引发仔猪腹泻的潜在治疗靶点,它通过抑制IPEC-J2细胞中PEDV的复制来增加转移至质膜上的NHE3数量,从而维持细胞内外Na^(+)运转平衡。

猪流行性腹泻病毒检测技术研究进展

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epi⁃demic diarrhea virus,PEDV)引起的一种高度接触性肠道传染病,以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征,给养猪业带来严重的经济损失。及时准确地诊断PEDV感染对于预防和控制PED至关重要,目前已经开发了许多用于PEDV、病毒蛋白及核酸的检测方法,包括病毒分离、酶联免疫吸附试验、直接免疫荧光检测、免疫组织化学技术、免疫层析技术等免疫学方法;RT⁃PCR、实时定量RT⁃PCR、核酸等温扩增技术、CRISPR⁃Cas系统检测技术等分子生物学方法。本文针对PEDV的抗原检测技术和方法进行综述,以期为PEDV的临床监测和PED的防控提供参考。

猪流行性腹泻疫苗研究进展

近年来,随着中国养猪事业的高速发展,猪流行性腹泻(PED)已成为猪群的重要传染病,PED是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的,以腹泻、呕吐、脱水为特征的急性病毒性传染病。PED主要通过呼吸道和消化道传播,哺乳仔猪最易感,死亡率可高达100%,给养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV是单股正链RNA病毒,具有4个主要结构蛋白、16个非结构蛋白和1个辅助蛋白ORF3。自2010年以来,该病毒变异株传播范围不断扩大,流行趋势日益复杂,经典毒株(CV777)相关疫苗已无法提供有效保护。因此,开发更加安全、有效的疫苗已迫在眉睫。灭活疫苗安全性高,但需多次接种且保护效果不佳;弱毒疫苗免疫原性良好,但存在毒力返祖风险;亚单位疫苗不携带病毒其他蛋白结构,使用安全、价格便宜,但其免疫原性差;重组病毒活载体疫苗可诱导产生特异性免疫反应,但安全性不足;重组细菌活载体疫苗能口服刺激机体黏膜免疫,并且载体具有佐剂作用,但其免疫效率不高;转基因植物疫苗安全稳定,但表达量低且研发周期长;核酸疫苗研发周期短、灵活性高,但安全性不高、外源基因易与宿主基因重组。随着相关研究的深入,各类疫苗研究已取得重要研究成果。笔者就PED灭活疫苗、弱毒疫苗、亚单位疫苗、重组病毒活载体疫苗、重组细菌活载体疫苗、转基因植物疫苗、核酸疫苗进行综述,以期为PED的防治和新型疫苗研发提供参考。

猪流行性腹泻的流行特点、诊断方法与防控策略

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的各年龄段猪均易感染的肠道传染性疾病,尤其对哺乳仔猪的致死率很高,对我国的养猪行业造成了严重的危害。治疗该病缺乏特效药物,且由于新变异毒株的出现,增加了防控难度和成本。本文介绍了该病的病原学特征、流行病学特征、发病机理、诊断方法,提出了科学防控的措施,为防控猪流行性腹泻拓展了思路。

几种中药体外抗猪流行性腹泻病毒活性的研究

为探究蒲公英、板蓝根、泽泻、葛根、黄芩5种中药水提物体外抑制猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染的效果,本研究先将不同浓度中药液分别2倍倍比稀释后加入非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)中,观察各药物对细胞生长状态的影响来确定各药物的最大安全浓度。结果显示,蒲公英、板蓝根、泽泻、葛根、黄芩的最大安全浓度分别为3.91 mg/m L、1.95 mg/m L、1.95 mg/m L、0.98 mg/m L、0.98 mg/m L。以药物最大安全浓度为初始浓度,2倍倍比稀释各药物,共6个浓度,采用先加药物后加病毒(阻断作用),先加病毒后加药物(抑制作用)、药物和病毒同时加入(杀灭作用)3种不同加药的方式,加入已铺满单层Vero细胞的96孔细胞培养板中,72 h后加入CCK-8溶液1 h后测定各孔的OD_(450nm)值,评估阻断作用、抑制作用、杀灭作用下各药物对PEDV抑制率最高的浓度。结果显示,5种药物在阻断作用、抑制作用、杀灭作用下对PEDV抑制率最高的浓度分别为3.91 mg/m L、1.95 mg/m L、1.95 mg/m L、0.98 mg/m L以及0.98 mg/m L。以上述对PEDV抑制率最高的药物浓度为试验浓度,重复上述3种加药方式,72 h后加入CCK-8溶液1 h后测定各孔的OD_(450nm)值,计算3种作用方式下各药物对PEDV的抑制率,筛选出对PEDV抑制率最高的药物。结果显示,各中药均可在体外抑制PEDV的感染,阻断作用下黄芩对PEDV的抑制率最高达138.10%,抑制作用下蒲公英对PEDV的抑制率最高达149.90%,杀灭作用下葛根对PEDV的抑制率最高达102.90%,且蒲公英和黄芩在3种作用方式下对PEDV的抑制率均高于80%。以上结果表明蒲公英和黄芩体外抗PEDV感染的效果最好,本研究首次证实5种中药对体外抗PEDV感染的效果,为中药治疗PED提供了参考依据。

猪流行性腹泻病毒微滴式数字PCR定量检测方法的建立及初步应用

旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法。本研究根据GenBank登录的PEDV(MK862249.1)M基因序列保守区设计合成特异性引物对和探针;通过对反应体系和反应条件的优化,成功建立了可用于检测PEDV的荧光定量PCR(fluorescent quantitative real-time PCR,FQ-PCR)方法,将自行建立的FQ-PCR方法的引物对/探针用来确定ddPCR方法;对ddPCR方法进行敏感性、特异性、重复性和初步应用试验。结果显示:自行建立的FQ-PCR方法在敏感性、重复性等方面均优于行标FQ-PCR方法;根据自行设计的FQ-PCR方法建立的ddPCR方法最低检测极限为0.15 copies·μL^(-1),敏感性高于行业标准(SN/T 1699—2017)FQ-PCR方法(1.0×10^(1)copies·μL^(-1));模板浓度为1.0×10^(0)~1.0×10^(4)copies·μL^(-1)时,具有良好的线性关系(R 2>0.99);批内、批间变异系数(CV%)为1.52%~7.40%;对猪丁型冠状病毒、猪伪狂犬病毒等11种对照病毒核酸检测结果均为阴性;分别用建立的ddPCR方法、行业标准FQ-PCR方法对150份临床样品进行PEDV核酸检测,ddPCR方法对行业标准FQ-PCR方法检测阳性样品的检测符合率为10^(0)%。本研究成功建立的PEDV ddPCR检测方法可用于临床上PEDV感染的早期检测和定量检测,为PEDV核酸标准物质的研制提供了定量手段。

猪流行性腹泻病毒nsp1、nsp5和N蛋白的重组腺病毒载体的构建及免疫原性比较

为研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)nsp1、nsp5和N蛋白的免疫原性,试验以复制缺陷型人腺病毒5型(AdMax系统)为载体,利用PEDV-GDgh毒株(登录号为MG983755),通过PCR方法扩增出GDgh毒株nsp1、nsp5、N基因,并将其连接到腺病毒穿梭载体上,构建重组穿梭质粒。将3个重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体共转染至HEK-293A细胞中获得第1代重组腺病毒,分别命名为rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N。用第1代3株重组腺病毒接种HEK-293A细胞,连续传代,通过RT-PCR和Western-blot方法鉴定第3代重组腺病毒,并采用Reed-Muench法计算病毒半数组织培养感染剂量(TCID_(50))。以3株重组腺病毒的第3代病毒液免疫小鼠,收集血清并检测特异性IgG抗体水平。结果表明:试验成功构建出带有nsp1、nsp5、N基因的重组穿梭质粒;分别用重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N感染正常HEK-293A细胞,可产生典型的细胞病变并观察到荧光信号;目的基因正常转录后得到的目的蛋白可正确表达;3株重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N的TCID_(50)依次为1×10^(-8.35)/mL、1×10^(-8.50)/mL、1×10^(-7.66)/mL;免疫小鼠后均可产生针对目的蛋白的特异性抗体。说明试验成功构建的3株正常表达目的蛋白的重组腺病毒均具有免疫原性。

益生菌防治猪流行性腹泻探讨

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的一种急性、接触性肠道传染病,具有病程短,年龄越小,症状越重,传播速度快,死亡率高,容易出现暴发流行,药物治疗效果不佳等特点。益生菌是属于对猪有益的活性微生物,能够调节猪黏膜与系统免疫功能,实现肠道内菌群平衡,并发挥其免疫屏障。本文基于猪流行性腹泻的概述和益生菌的功能、作用,从而探讨益生菌在猪流行性腹泻防治中的应用。

猪流行性腹泻病毒分子特征、基因分型及流行现状

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是引起仔猪严重肠道疾病的病原之一,新生仔猪感染后常引起致死性水样腹泻、呕吐、出血性肠炎,死亡率高达100%,给全球养猪业带来了巨大的经济损失。2010年,高致病性PEDV变异毒株的出现与流行造成猪流行性腹泻(PED)在全球的再次暴发,以经典毒株为抗原的流行性腹泻疫苗无法有效控制高致病性变异毒株的流行。文章综述了PEDV基因组结构与蛋白功能、基因分型与流行现状,以期为PEDV新型疫苗的研究提供参考。

仔猪流行性腹泻的临床症状及防治措施

仔猪流行性腹泻是一种由猪流行性腹泻病毒引起的高度传染性疾病,主要表现为仔猪呕吐、急性腹泻和脱水等症状。及时采取有效的防治措施,控制仔猪流行性腹泻的传播,对确保养猪业的稳定发展具有重要意义。本文对仔猪流行性腹泻病原、临床症状、致病机理以及预防和治疗措施等方面进行综述,深入了解仔猪流行性腹泻的临床症状有助于及早诊断和采取相应的防治措施,从而减少疾病的传播和流行,旨在为仔猪健康养殖提供有效的防治措施,从而帮助养殖业提高生产效益,减少经济损失。

基于生物反应器的猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)悬浮培养工艺研究

为了优化生物反应器全悬浮培养技术制备猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的工艺,试验首先通过摇瓶培养对病毒接种时的细胞密度、胰酶浓度、接毒剂量和收毒时间等培养条件进行优化;之后按照摇瓶培养确认的工艺进行生物反应器全悬浮培养工艺验证,同时对pH值、溶氧值(DO)、转速等培养参数进行优化,以病毒含量(TCID_(50))为指标,最终筛选出在15L生物反应器中培养猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的最优条件,并进一步在50L生物反应器中进行工艺验证,将病毒液灭活后稀释至1×10^(7).0TCID_(50)/mL免疫怀孕75~90d的健康易感初怀母猪,在分娩当日,采集母猪和仔猪血清,并对分娩的3日龄仔猪攻毒进行免疫原性试验。结果表明:猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)在摇瓶上的最适培养条件为当细胞密度达到6×10^(6)个/mL以上时,用含胰酶(终浓度为20μg/mL)的无血清培养基将细胞密度稀释至2×10^(6)个/mL,按感染复数(MOI)=0.1接毒,130 r/min摇床振荡培养36h可收获病毒液,病毒含量可稳定达到1×10^(7.5)TCID_(50)/mL以上;猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)在15L生物反应器上的最适培养条件为pH值7.0~7.2、DO值50%、转速80~100 r/min,培养36h收获的病毒液含量可稳定在1×10^(7.5)TCID_(50)/mL以上;在50L生物反应器上放大培养收获的病毒液含量为1×10^(7).8TCID_(50)/mL。母猪和仔猪中和抗体效价均≥1∶32,免疫保护力为100%。说明本试验条件下成功建立并优化了生物反应器全悬浮培养制备猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的工艺,生产的猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的免疫原性较好。

不同猪源受体菌表达猪流行性腹泻病毒保护性抗原S1诱导免疫应答的比较研究

旨在比较猪源副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)、罗伊氏黏液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)作为口服疫苗载体,表达外源蛋白刺激仔猪产生免疫能力的强弱,以期选取合适乳酸菌作为受体菌载体。本研究首先体外鉴定表达PEDV S1蛋白的重组猪源副干酪乳酪杆菌(pPG-T7g10-S1/L.paracasei 27-2)、猪源罗伊氏黏液乳杆菌(pPG-T7g10-S1/L.reuteri J31)、猪源约氏乳酸杆菌(pPG-T7g10-S1/L.johnsonii 6332)的耐酸耐胆盐能力,考察3株重组菌的抗逆性。结果表明,3株重组菌均能够耐受酸和胆盐环境,且与其野生型菌株没有显著差异。接下来为比较3株重组菌的免疫效果,口服免疫初生仔猪后,利用间接ELISA和中和试验检测仔猪产生的特异性抗体水平及其中和活性;并测定免疫后仔猪血清和肠黏膜中各细胞因子水平。结果显示,口服免疫后,与对照组相比,3株免疫组仔猪血清IgG抗体和鼻拭子、肛拭子、肠黏液中SIgA抗体水平均显著升高,且可持续至第28天左右,其中pPG-T7g10-S1/L.paracasei 27-2组诱导产生的抗体水平显著高于其他两组免疫组(P<0.05);仔猪产生特异性的IgG和SIgA对PEDV均具有中和活性。仔猪血清中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平和对照组相比显著升高(P<0.05),但3株重组菌组间细胞因子水平未见明显差异;仔猪空肠黏膜中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-17、IL-21、TGF-β、APRIL和BALL水平与对照组相比有所升高,且pPG-T7g10-S1/L.paracasei 27-2组IL-4、IL-5、IL-6、TGF-β、IL-17、IL-21和BALL相比其他组显著升高(P<0.05)。综上所述,本研究分别将质粒组成型表达PEDV主要保护性抗原S1的重组猪源副干酪乳酪杆菌、猪源罗伊氏黏液乳杆菌和猪源约氏乳酸杆菌口服免疫仔猪,结果显示能够刺激机体产生针对PEDV的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫,且相较于其他2株重组菌,重组猪源副干酪乳酪杆菌pPG-T7g10-S1/L.paracasei 27-2的口服免疫效果最好。该试验结果为构建更为有效的乳酸菌口服疫苗提供了科学数据。

C8orf4基因编码蛋白对猪流行性腹泻病毒体外复制的抑制效应

C8orf4,也称为甲状腺癌1(thyroid carcinoma 1,TC1),最初是从甲状腺癌及其周围正常甲状腺组织克隆而来,在脊椎动物中普遍表达,具有跨物种的序列保守性。研究表明,C8orf4在肿瘤中高表达,参与各种癌细胞间信息通讯,是一种与癌症和炎症有关的新型调节因子,并通过调节NF-κB的转录增强炎症反应,但对病毒的影响知之甚少。为研究C8orf4编码蛋白对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)复制的影响,将PEDV接种于Vero细胞,通过qRT-PCR和Western blot检测不同时间点PEDV对C8orf4表达的影响;设计并合成表达C8orf4基因的真核表达载体pcDNA3.1-C8orf44-His和特异性siRNA,通过过表达和抑制C8orf4表达,利用qRT-PCR和Western blot检测C8orf4对PEDV复制的影响;进一步,通过过表达C8orf4编码蛋白,明确C8orf4编码蛋白对PEDV复制周期各阶段的增殖变化。随着PEDV感染时间的增长,细胞中C8orf4表达呈上升趋势;过表达C8orf4显著抑制PEDV复制,而干扰C8orf4表达促进PEDV复制,并且C8orf4编码蛋白主要作用于PEDV复制周期的生物合成阶段。本研究表明C8orf4编码蛋白具有抑制PEDV复制的作用,为C8orf4的功能研究提供参考,为抗PEDV复制机制研究提供基础。

2016年~2022年福建地区猪流行性腹泻病毒S基因的遗传变异分析

为了解2016年~2022年福建地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行现状及遗传变异情况,本研究对从福建地区采集的231份疑似猪流行性腹泻(PED)发病仔猪病料样品经RT-PCR进行PEDV的检测,选取不同地区22份PEDV阳性样品经PCR扩增S基因并测序,采用MegAlign分析PEDV S基因及其编码氨基酸序列的相似性,采用MEGA7.0软件构建其系统发育树,采用MegAlign分析S基因编码氨基酸序列的分子特征,分别利用RDP4、SimPlot、MEGA7.0软件进行S基因的重组分析,并利用BEAST软件进行该基因分歧时间估算。结果显示,福建地区PEDV总阳性率为51.51%(119/231),福建5个不同地区PEDV阳性率为40.00%~63.16%。从22份PEDV阳性样品中获得19条PEDV S基因序列,全长4149 bp~4161 bp,共编码1382 aa~1386 aa,19株PEDV S基因序列及其编码氨基酸序列之间相似性分别为94.4%~100%和93.8%~100%。19株PEDV S基因系统发育分析结果显示,其中18株PEDV属于GIIb亚型,1株属于GIb亚型。S蛋白氨基酸序列分析结果显示,与经典疫苗株CV777相比,18株GIIb亚型PEDV S蛋白的氨基酸序列在aa55~aa56、aa135~aa136和aa155~aa156处存在插入与缺失,具有典型的PEDV变异株的分子特征;其中14株还出现了独特的aa1193缺失。与GII型疫苗株AJ1102相比,19株PEDV S1区氨基酸突变率为60.00%~83.82%,其中18株GIIb亚型PEDV S1区氨基酸突变位点中有10个位于S蛋白重要结构域;基因重组分析结果显示,有3株PEDV S基因存在重组事件,其中FJLY01-2018株由GD-B株和CH-S株重组而来,FJLY02-2018株由CH/HNPJ/2017株和PEDV4-S-3株重组而来,FJLY03-2022株由PEDV-1931-1-Valladolid-Molpeceres株和HUA-M17株重组而来;S基因分歧时间估算结果显示,福建地区GIIa亚型、GIIb亚型、GIa亚型及GIb亚型PEDV的最早分歧时间约为1995年、2009年、2010年和2011年。上述结果表明福建地区PEDV流行率较高,田间流行株基因型具有多样性,且存在重组现象,临床上应予以高度重视。本研究为福建地区PED的流行病学调查及免疫防控提供了参考。

猪流行性腹泻病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,本研究从GenBank数据库中获取PEDV N基因序列,扩增出PEDV N基因标准质粒,并在N基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物,成功建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。经过一系列试验表明,该检测方法线性关系良好,R^(2)值为0.99;特异性强,敏感性高,最低可检测至2.23 copies/μL,比普通PCR灵敏约100倍;重复性好,组内变异系数为0.25%~0.43%,组间变异系数为0.67%~0.97%;对于各地区96份临床样品检测出PEDV阳性率为25%。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法为PEDV的临床诊断、流行病学调查以及定量研究提供了有效的检测工具。