猪生殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的PRRSV保守基因序列设计合成了引物和探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。同时用建立的检测方法对组织病料进行了检测,并与常规RT-PCR做了对比。结果显示,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法灵敏度可达5.0×100拷贝/μL,比常规RT-PCR灵敏度高100倍。用该方法对东莞、增城、湛江等地的猪血清和多种组织样品进行了检测。结果,该方法与常规RT-PCR检测方法的阳性符合率为100%。用该方法对3份不同的组织样品进行了重复检测,结果表明,该方法具有良好的重复性,可满足当前PRRS的诊断需要。

金丝桃素体外抗高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒活性的研究

为研究金丝桃素体外对高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)活性的影响,以Marc-145细胞培养增殖的PRRSV为研究对象,通过噻唑蓝(MTT)比色法和观察细胞病变效应(CPE),测定吸光度值(D490nm)和半数细胞感染量(TCID50),以细胞存活率、病毒抑制率和TCID50为指标,评价不同剂量的金丝桃素体外抑制PRRSV活性的效应,并通过改变加药方式(同时、感染前、感染后给药),探讨其抗PRRSV的作用机制。结果表明,在PRRSV感染的同时加入金丝桃素,其细胞存活率和对PRRSV的抑制率略有升高,与PRRSV对照组和拉米夫定对照组相比,均有显著性差异(P<0.01)。在PRRSV感染前和感染后加入金丝桃素,其细胞存活率和对PRRSV的抑制率明显升高,且随药物浓度的增加而上升,与PRRSV对照组相比,有显著性差异(P<0.01),与拉米夫定对照组相比无统计学意义(P>0.05)。金丝桃素可使PRRSV的TCID50从6.1下降至4.15。证实,金丝桃素具有多环节体外抗PRRSV效应;不同浓度的金丝桃素表现出不同的抗PRRSV活性,并呈现剂量依赖关系。

猪生殖与呼吸综合征病毒HN／XT／07株的分离鉴定及其Nsp2基因的特性分析

从湖南湘潭某发病猪场分离到1株病毒,该病毒可使Marc-145细胞产生CPE,应用猪生殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒从感染细胞培养物中检测到猪生殖与呼吸综合征病毒,并将该分离毒株命名为HN/XT/07。采用RT-PCR方法扩增该分离毒株的Nsp2基因,并进行序列测定,发现在2932～3031 bp之间不连续缺失了87个核苷酸。序列比对结果显示,该分离毒Nsp2基因与PRRSV经典毒株Ch-1a的核苷酸同源性为85.5%,氨基酸同源性为80.1%;与2006～2007年流行的PRRSV高致病性变异毒株NX和SD的核苷酸同源性为95.3%～96.4%,氨基酸同源性为90.9%～95.6%。

高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒间接免疫荧光鉴别方法的建立

应用2株针对猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的单克隆抗体(McAb-A61,McAb-C65)建立了对PRRSV美洲株、欧洲株和高致病性毒株进行鉴别的间接免疫荧光试验(IFA)方法,并与商品化的PRRSV RT-PCR鉴别试剂盒进行比较。结果显示,McAb-C65与PRRSV美洲株和高致病性PRRSV毒株均呈阳性反应;McAb-A61与PRRSV美洲株呈阳性反应,但不与高致病性PRRSV毒株发生反应;2株单抗都不与欧洲株反应;IFA与RT-PCR的符合率为100%。表明,建立的PRRS间接免疫荧光鉴别诊断方法可为临床高致病性PRRS的确诊提供可靠的验证手段。

猪生殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型共感染对猪外周血天然免疫细胞含量的影响

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)单感染和共感染的6周龄仔猪,于感染前和感染后第3、7和10 d,采用血常规法、SWC3a单色流式细胞术以及CD3/CD4/CD8三色流式细胞术分析了感染猪外周血中白细胞、粒细胞、单核细胞、NK细胞、γδT细胞的含量。结果,感染后第3 d和第7 d,PRRSV感染组、PCV2感染组以及PRRSV+PCV2共感染组猪的白细胞、单核细胞、粒细胞、NK细胞、γδT细胞总数显著下降,并且共感染组比单感染组下降更加严重。结果表明,PRRSV+PCV2共感染对仔猪外周血天然免疫细胞的影响具有协同效应,意味着在感染早期可导致更加严重的先天免疫抑制。

高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒NASBA-ELISA检测方法的建立

针对猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF1中编码Nsp2的基因序列设计引物,建立了核酸序列依赖性扩增(NASBA)方法,并结合微孔板中液相杂交和酶标显色反应检测NASBA扩增产物,建立了检测高致病性PRRSV的NASBA-ELISA。琼脂糖凝胶电泳显示,NASBA方法扩增出了特异性的目的条带。将NASBA产物RNA系列稀释后同时进行了ELISA和Northern杂交。结果显示,ELISA和Nor-thern杂交最高可分别检测到1∶50和1∶30稀释的产物RNA。采用建立的NASBA-ELISA可检测到101.83TCID50/mL的HuN4株PRRSV。该方法只对3株高致病性PRRSV的检测结果为阳性,对经典株PRRSV和其他猪源病毒的检测结果均为阴性。结果表明,NASBA-ELISA能够敏感并特异地检测高致病性PRRSV。

广东省猪生殖与呼吸综合征病毒主要结构蛋白基因的变异分析

根据GenBank中猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株(ATCC VR-2332)基因序列分别设计合成了针对PRRSV ORF3、ORF5和ORF6基因的引物,利用RT-PCR从广东省送检的5份病料中均分别扩增得到了大小约787、630和550 bp的片段,将扩增的cDNA片段克隆入pMD 18-T载体并测序.应用DNAStar软件分析,并与国内外已发表毒株和疫苗株(RespPRRS/Repro、RespPRRS MLV)、LV4.2.1株的序列进行比较.结果显示,这5个毒株与CH-1a、HB-1(sh)、BJ-4、ATCC VR-2332、疫苗株等毒株ORF3、ORF5、ORF6的核苷酸同源性分别为87.2%～98.7%、85.4%～96.8%、91.8%～98.9%,推导的氨基酸同源性分别为84.6%～97.6%、84.5%～95.5%、94.8%～98.9%;而与LV4.2.1株的核苷酸同源性分别为56.1%～58.3%、54.4%～57.0%、62.2%～64.4%,推导的氨基酸同源性分别为53.9%～56.7%、54.0%～57.0%、78.0%～80.3%.基因系统发育树表明,广东省流行的PRRSV与HB-1(sh)株的亲缘关系比较近.

猪生殖与呼吸综合征病毒NM1株的分离鉴定及其Nsp2基因的序列分析

从内蒙古某猪场患高热症病猪病料中分离到1株病毒,该病毒能在Marc-145细胞上增殖,产生细胞病变。经RT-PCR法鉴定证明,该病毒为美洲型PRRSV,将其命名为NM1。应用设计的特异性引物扩增NM1株的Nsp2基因,并与国内外PRRSV分离株的Nsp2基因序列进行了比较。结果表明,NM1株Nsp2基因推导的氨基酸序列出现30个不连续的缺失,与PRRSV高致病性毒株HuN4、HuB2、JXA1的核苷酸序列同源性分别为99.1%、99.0%和98.9%。动物回归试验结果显示,人工感染的5头仔猪全部发病,其中3头死亡,说明NM1株为发生变异的PRRSV,其致病力有所增强。

猪生殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞的病毒形态发生和细胞超微结构观察

以猪生殖与呼吸综合征病毒四川分离株PRRSV-SC1株感染体外培养的Marc-145细胞为模型,通过透射电镜对PRRSV的病毒形态发生学和宿主细胞超微结构的动态变化规律进行研究。结果显示,病毒粒子呈球形,有囊膜,大小约45-65nm,内含直径约25-30nm的核衣壳。病毒感染细胞后以细胞内吞方式进入细胞,在胞浆内复制,装配好的病毒以出芽或细胞外分泌释放到细胞外。感染细胞超微结构变化主要表现为:细胞胞浆空泡增多,内质网扩张,线粒体增生、嵴肿胀、脱落,最后空泡化,细胞表面的微绒毛脱落,出现典型的细胞凋亡特征,并观察到凋亡小体,最后整个细胞裂解、破碎。

猪生殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法的建立

针对美洲型猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)保守的N蛋白基因设计了一套RT-LAMP的检测引物,通过优化反应条件,建立了一种检测PRRSV的RT-LAMP诊断方法。特异性和敏感性试验结果显示,该方法能够特异地检测美洲型PRRSV,其最低检测限为10个拷贝,而RT-PCR的最低检出限为1×104个拷贝。分别用建立的RT-LAMP法与RT-PCR法对临床50份样品进行检测,结果二者的符合率在96%以上,呈现很好的一致性。表明,建立的RT-LAMP法可应用于PRRSV的快速检测。

猪生殖与呼吸综合征病毒GP5基因对小鼠的DNA免疫

将表达完整猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5和融合表达泛素与GP5成熟肽的真核重组表达质粒(pCI-GP5和pcDNA-U-GP5)分别肌肉注射免疫BALB/c小鼠,共免疫3次。采用间接ELISA法检测血清中抗GP5的抗体水平,MTT法检测脾淋巴细胞的增殖能力,LDH释放试验检测脾NK细胞的杀伤活性,并通过流式细胞术检测脾淋巴细胞亚群的比例。结果发现,2种DNA重组质粒免疫后均可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫。三免后第5周,pCI-GP5质粒免疫组诱导产生的抗GP5抗体水平及NK活性明显高于pcDNA-U-GP5质粒免疫组;而pcDNA-U-GP5免疫组的淋巴细胞增殖指数及CD4-CD8+T细胞比例明显高于pCI-GP5组。表明,GP5基因可诱导产生较高的免疫反应,泛素与GP5的融合表达可增强PRRSV GP5诱导的细胞免疫反应。

猪生殖与呼吸综合征病毒CH-1a株GP5蛋白基因的表达及其单克隆抗体的制备

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1a株GP5蛋白基因信号肽部分删除后克隆于pGEX-6p-1载体上,并在大肠埃希氏菌中进行表达。经SDS-PAGE电泳分析发现,融合表达的rtGP5蛋白约42 ku,将融合蛋白rtGP5用PRRSV阳性血清进行Western-blotting分析,证实所表达的融合蛋白能被其特异性识别。收获融合表达产物rtGP5,按50μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化,经腹腔免疫BALB/c小鼠3次后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,分别以融合蛋白rtGP5和GST蛋白为抗原,通过间接ELISA方法对融合细胞的上清液进行检测,筛选阳性克隆,结果得到了15株能稳定分泌抗rtGP5蛋白抗体的阳性细胞克隆株。经间接免疫荧光检测发现,获得的15株单克隆抗体都能与PRRSV感染细胞产生特异性荧光。15株单克隆抗体亚型鉴定结果显示均为IgG1型,且轻链均为κ链。

猪生殖与呼吸综合征病毒△Gp5/M/N串联基因的克隆及原核表达

采用RT-PCR方法从猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株VR2332中扩增△Gp5、M和N基因片段,通过重组PCR方法得到串联基因△Gp5/M/N,将其克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,并转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)pLysS,筛选表达PRRSV pET-△Gp5/M/N蛋白的菌株。经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE分析和Western-blotting。结果表明,PRRSV pET-△Gp5/M/N蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,纯化后的蛋白可与PRRSV阳性血清发生特异性反应。证明原核表达系统表达的PRRSV pET-△Gp5/M/N蛋白具有良好的反应原性。

猪生殖与呼吸综合征病毒HN6株ORF5基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

用RT-PCR方法从河南分离的1株(HN6)猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸中扩增缺失N端疏水序列的基因片段dORF5(deleting ORF5),并将其克隆到pMD18-T载体中测序,再亚克隆到原核表达载体pET-32a上。重组质粒转化大肠杆菌BL21,用不同浓度IPTG分别于37℃诱导,经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白的分子质量约31.4 ku,薄层扫描分析显示,表达量占菌体总蛋白含量的28.8%。Western-blotting结果表明,重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。证实,该蛋白可用于PRRSV的诊断。

猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗原表位基因的表达及其表达产物的抗原性

为了确定猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白A、B抗原表位之间的相互关系和对免疫的影响,应用PCR方法扩增出A、B抗原表位基因并分别克隆于原核和真核表达载体中。原核重组质粒表达的重组蛋白经Western-blotting检测证明,该重组蛋白具有良好的抗原性。将重组蛋白和真核表达质粒免疫小鼠,前者可诱导产生针对PRRSV的特异性ELISA抗体,但是此抗体没有中和活性;后者不能诱导免疫小鼠产生PRRSV特异性抗体。结果表明,中和抗体的产生不但与A、B表位的空间构象有很大的关系,如果蛋白质分子质量过小也不能诱导机体产生有效的免疫反应。

宁夏地区猪生殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆及其变异分析

参考GenBank中登录的猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）Jiangxi株和CH—la株的ORF5基N序列，设计并合成了1对引物，对宁夏回族自治区送检的18份PRRS阳性分离毒株进行RT—PCR扩增，获得约750bp的DNA片段，将其分别克隆入pMD18-T载体中，进行测序。应用DNAStar软件分析所测序列，并与ATCCVR-2332，BJ-4，RespPRRSMLV等毒株的ORF5序列进行比较，发现其核苷酸同源性为85．4％～89．0％，与CH—1a之间的核苷酸同源性为90．0％～98．2％，与欧洲代表株LV的核苷酸同源性为55．9％～56．6％。基因系统进化树分析表明，发生于宁夏回族自治区的PRRSV属于美洲型，与CH—1a遗传关系较近，归属同-基因亚型。

人工感染仔猪猪生殖与呼吸综合征病毒的核酸分布规律

根据猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRsV）美洲株ATCCVR-2332保守区ORF6和ORF7的基因序列，设计了1条37bp的寡核苷酸探针，末端用生物素标记。应用原位杂交方法对人工感染PRRSVSC-1株的28日龄仔猪进行了病毒核酸分布规律的研究。结果显示，感染后7～28d于肝、脾、肺、肾、扁桃体、胸腺、肺门淋巴结、肠和大脑检测到阳性杂交信号，其中肺门淋巴结的阳性信号一直较强，脾的阳性信号逐渐增强，肺的阳性信号较弱，心脏未见阳性杂交信号。

猪生殖与呼吸综合征病毒的SYBR Green-Ⅰ荧光定量PCR检测

根据猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白基因核酸序列设计引物,经BLAST比较发现,该引物既可以扩增较早发现的PRRSV毒株,也可以扩增近期发现的在Nsp2基因上有较大变异的PRRSV毒株,以含有该引物扩增序列的重组质粒作为标准品建立了检测PRRSV的SYBR Green-Ⅰ荧光定量PCR方法。结果表明,该方法标准曲线的相关系数大于0.99,敏感性可以达到1×101拷贝/μL,约为普通PCR的100倍;用该方法检测人工感染PRRSV的猪全血,结果阳性检出率为100%。敏感性、特异性和稳定性试验表明,该方法具有很高的敏感性、特异性和稳定性,可以用来快速检测PRRSV。

猪生殖与呼吸综合征病毒宁夏分离株ORF5基因的克隆表达及其表达产物的活性分析

参考已发表的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因序列,设计合成了1对覆盖完整ORF5基因区段的引物,克隆了PRRSV NX/HY株的ORF5基因(登录号为EU600287),并进行了序列比较。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建了融合表达质粒pGEX-6P-1-5并转化BL21,对表达蛋白进行Western-blot分析。结果表明,NX/HY分离株ORF5基因与PRRSV JX1、CH-1a株的核苷酸序列同源性分别为99.2%和95.2%,推导的氨基酸序列的同源性分别为98.5%和92.5%;层析扫描分析显示,目的蛋白的含量约占菌体总蛋白的30%,且具有良好的反应原性。GP5蛋白的表达为建立相应的血清学诊断方法奠定了基础。