用SMART技术构建猪蛔虫雌虫cDNA文库

为克隆出与猪蛔虫产卵或发育相关基因的全长序列,本研究根据SMART(Switching mechanism at5'end of RNA transcript)技术,采用Clontech公司的CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit构建了猪蛔虫雌虫的全长cDNA文库。用TriPure Isolation Reagent和Poly(A)PuristTM试剂盒提取mRNA后,以逆转录酶PowerScriptTM反转录合成第一链cDNA,然后通过LD-PCR合成并扩增ds cDNA。扩增产物经纯化、SfiⅠ酶切、过CHROMA SPIN-400TM柱去除小片段后,连接到SfiⅠ消化过的pDNR-LIB(带有SfiⅠA和B两个位点)质粒载体中,最后用电转化法将重组质粒转化到E.coli DH5α内得到原始文库,扩增后的文库保存在96孔细胞培养板中。经测定,构建的cDNA文库约含有1.6×106个重组子,重组效率达100%,插入片段多在0.4kb～2kb之间,平均插入片段长度约1.2kb,扩增后文库滴度为3×109CFU/mL。结果表明猪蛔虫雌虫的全长cDNA文库已构建成功,从而为筛选猪蛔虫雌虫的功能基因全长序列奠定了基础。

应用cDNA微阵列芯片技术筛选猪蛔虫性别差异表达基因的研究

采用cDNA微阵列芯片技术,从所构建的猪蛔虫雌、雄成虫cDNA消减文库分别挑取1 044和1 119个克隆,PCR扩增其插入片段,经纯化后点样于预先处理好的基片上(双点杂交),制备成cDNA微阵列芯片。将分别标记荧光素Cy3-dUTP和Cy5-dUTP的雌虫和雄虫cDNA探针,与制备好的cDNA芯片杂交(平行进行反标杂交试验)。根据每个点杂交后的Ratio值,筛选出双点杂交和正反标中都同时具有表达差异的基因克隆共1 559个。将表达差异最明显的前831个克隆进行测序,获得720个有效序列,经生物信息学分析发现,雄虫特异表达的主要精子蛋白和雌虫特异表达的卵巢信息蛋白的基因序列多数与新杆属线虫存在同源性,有31个可能是新的ESTs。性别差异表达基因及其相关生物信息的获得为下一步研究基因功能奠定了基础。

猪蛔虫性别特异基因在第三、四期幼虫的表达谱研究

为研究猪蛔虫性别特异基因在第三期、第四期幼虫的表达情况,本研究采用表达谱基因芯片技术,从所构建的猪蛔虫雌、雄成虫cDNA消减文库中分别挑取克隆,制备成cDNA微阵列芯片。标记有荧光素Cy5-dUTP和Cy3-dUTP的各组探针(L3+♀;L3+♂;L4+♀;L4+♂)分别与制备好的芯片进行杂交、扫描,原始信号值经均一化处理后,获取每个点的Ratio值(Ratio=Cy5/Cy3)。根据该值筛选出表达差异最明显的841个克隆,进行测序分析,在获得的707个有效序列中有61个是猪蛔虫新的ESTs。将在第三、四期幼虫以及成虫中显著表达的克隆进行排列组合比较,获得各期特有和各期之间共有的表达克隆。在第三期幼虫中,雌、雄性别特异基因分别有21和9个,编码的主要蛋白有卵黄原前导蛋白、睾丸幼胚蛋白等;在第四期幼虫中特异表达的雌、雄性别基因分别有22和6个,其中免疫抑制卵巢信息蛋白、主要精子纤维蛋白(MFP)等表达明显。本项研究结果不仅初步阐明了猪蛔虫性别特异基因在第三、四期幼虫的表达情况,而且亦为筛选控制猪蛔虫病的“关键”基因并阐明其功能奠定了基础。

应用蛋清甘油涂片技术对猪蛔虫子宫细胞HE染色观察

猪蛔虫子宫的形态学描述是人体寄生虫学教学和科研的内容之一,本文介绍利用蛋清甘油涂片技术将猪蛔虫子宫组织粘固在载玻片上,HE染色,光学显微镜观察的方法。

猪蛔虫不同发育期幼虫的收集方法研究

目的研究猪蛔虫不同发育期幼虫的收集方法。方法采用7.5%次氯酸钠氧化感染期蛔虫卵,37℃过夜后,用灭菌生理盐水离心数次,充分洗去次氯酸钠,将沉淀用玻璃珠在振荡器上振荡至全部卵壳破裂,幼虫孵出。用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法将幼虫与卵壳分离,最后收集底层的脱鞘第三期(L3)幼虫。在贝尔曼原理的基础上,在漏斗中加入低浓度(0.4%)琼脂凝胶,分别将绞碎的含幼虫的猪肝、肺和小肠内容物及其肠粘膜平均分装在数个漏斗中,放入40℃温箱中孵育3h,待大部分幼虫游离到管底,最后用400目分样筛过滤分离肝中的L3,用300目分样筛过滤分离肺中的L3,用200目分样筛过滤分离肠内容物及其粘膜上的第四期幼虫(L4)。结果次氯酸钠氧化加玻璃珠震荡法能够使感染期蛔虫卵几乎完全脱壳,配合淋巴细胞分离液的密度梯度离心法能收集到纯度较高且活力较强的体外脱鞘幼虫。与传统贝尔曼氏分离法相比,采用低浓度琼脂糖凝胶液能获得杂质少、高纯度的猪内脏中的不同发育期幼虫。结论次氯酸钠氧化加玻璃珠震荡法是体外脱鞘分离感染期幼虫的一种较为理想的方法,通过在漏斗内加低浓度的琼脂凝胶的方法是从猪内脏中获得高纯度的不同发育期幼虫的一种有效的方法。本方法不仅适用于猪蛔虫,而且对其它动物和人的寄生线虫幼虫的收集也有参考价值。

猪蛔虫雄虫cDNA文库的构建

采用Tripure Isolation Reagent抽提猪蛔虫雄虫成虫的总RNA,用poly(A)PuristTM纯化试剂盒分离mR-NA。分离mRNA后,用Clontech公司的CreatorTMSMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建了猪蛔虫雄虫成虫的cDNA文库。结果获得了7.26×105独立克隆,重组率达96.7%,插入片段的平均长度约为1 kb。猪蛔虫雄虫cDNA文库的成功构建为利用文库筛选雄虫差异表达基因提供了材料来源,为研究猪蛔虫性别发育的分子机制奠定了基础。

应用RNA干扰技术对猪蛔虫性别相关基因功能的初步研究

针对编码猪蛔虫雌虫卵巢蛋白基因的EST序列设计了1对特异引物及连接T7启动子的引物，经PCR扩增，获得5’端连有T7启动子的双链DNA，在RNA聚合酶的作用下，转录合成dsRNA。通过浸泡的方式将dsRNA导入秀丽新杆线虫中，在浸泡后的5个不同的时间点，采用RT—PCR检测虫体浸泡后靶基因被干扰的效果。试验结果表明，在浸泡后的8～29h能检测到同源靶标的存在；而在浸泡后的43～57h不能检测到靶标RNA。另外，试验组没有观测到虫体明显的表型变化，而对照组在浸泡28h后，发现部分线虫体内有发育成形的虫卵。初步认为导入虫体的dsRNA发生了干扰效应。

两种生态卫生厕所对猪蛔虫卵的灭活效果比较

目的 :了解粪尿分集式厕所及水压式双管道自动排渣沼气池两种生态卫生厕所对猪蛔卵的灭活效果并进行比较。方法 :采用 Tea袋法定期定量进行虫卵存活率观察。在监测点观察 5个粪尿分集式厕所和 5个沼气池 ,每厕粪坑放入 2 4个 Tea袋 ,每月对监测厕所采样一次 ,每次 (月 )抽取两袋进行虫卵存活率观察。采集回来的虫卵在实验室常温下培养 3周后再进行检查 ,并设对照组虫卵进行对比观察。结果 :存放于 5个粪尿分集式厕所粪坑内的猪蛔虫卵 ,1、2和 3个月后平均虫卵存活率分别为 89.6 6 %、6 3.5 7%和 19.4 2 % ,6个月后存活率仅为 1.4 9% ,11个月后虫卵存活率为 0 ;存放于沼气池发酵池内的猪蛔虫卵 ,1、2和 3个月后虫卵存活率分别为 10 0 %、84 .89%和 70 .6 4 % ,6个月后存活率为 5 7.4 9% ,活卵数量逐月减少 ,11个月后虫卵存活率为 0 ;而对照组的虫卵 1年后存活率为 85 .39%。结论 :两种生态卫生厕所对寄生虫卵均有较好的杀灭作用 。

猪蛔虫感染期幼虫抑制消减cDNA文库的构建

为筛选与线虫感染性相关的基因,本研究以猪蛔虫为对象,构建猪蛔虫感染期幼虫差异表达消减cDNA文库,为研究线虫期特异性发育的分子机制奠定基础。分别提取感染期幼虫和其它各期幼虫及成虫的总RNA,纯化mRNA后,采用Clontech公司PCR-selectTM试剂盒进行反转录合成cDNA并进行抑制消减杂交(SSH),构建猪蛔虫感染期幼虫差异表达的消减cDNA文库,并采用Southern斑点杂交进行消减效率的检测。随机从文库中抽取45个克隆进行测序及在线BLAST分析。试验结果表明,感染期幼虫差异表达的消减cDNA文库具有较强的特异性;在得到的41个表达序列标签(ESTs)中,有40个ESTs与已报道的基因有较高的相似性,主要代表猪蛔虫第三期幼虫基因和成虫头部基因,有1个cDNA片段可能代表新基因。猪蛔虫感染期幼虫差异表达消减cDNA文库的成功构建,为进一步研究幼虫发育差异表达基因的功能奠定了基础。

MiR-36f对猪蛔虫幼虫感染力和发育的影响（英文）

目的探讨猪蛔虫虫卵和幼虫期特异表达的miR-36f的是否与猪蛔虫幼虫的感染性和发育有关。方法将合成的miR-36f的模拟物,抑制剂以及模拟物对照和抑制剂对照通过浸泡的方法被猪蛔虫三期幼虫吸收后,分别将这四组幼虫通过灌胃的方式感染小鼠,以不作任何处理的幼虫感染小鼠作为空白对照组,四天后采用贝尔曼法收集各组小鼠肺和肝的幼虫。对各组回收幼虫的数量以及幼虫的长度和宽度进行测量,并采用qRT-PCR方法对miR-36f的两个靶基因OST48和cytochrome b进行定量分析。结果抑制miR-36f以后,miR-36f的两个靶基因OST48和cytochrome b均被下调,幼虫发育和感染力受到抑制。结论提示猪蛔虫的miR-36f与幼虫个体发育和感染力有关。

粪尿分集式厕所对猪蛔虫卵灭活效果的观察

目的 了解新型厕所—粪尿分集式厕所对猪蛔虫卵的灭活效果。 方法 采用Tea袋法定期定量进行虫卵存活率检查。在监测点观察 10个户厕和 1个公厕 ,每厕粪坑放入 2 4个Tea袋 ,每月对监测厕所采样 1次 ,抽取 2袋虫卵在实验室常温下培养 3周后再进行虫卵存活率观察 ,并与对照组虫卵进行对比观察。同时测量粪渣的 pH值和水分 ,观察与虫卵存活率的关系。 结果 存放于 10个户厕粪坑内的猪蛔虫卵 ,1、2和 3个月后平均虫卵存活率分别为 96.5 7%、5 7.5 1%和 10 .67% ,6个月后存活率仅为 1.5 3 % ,11个月后虫卵存活率为 0 ;存放于公厕 (粪尿分集式厕所 +太阳能板 )粪坑内的猪蛔虫卵 ,1、2和 3个月后虫卵存活率分别为 92 .5 1%、1.0 1%和 0 ,而对照组虫卵 1年后存活率为 85 .3 9%。虫卵存活率与粪渣中的pH值及水分有直接关系 ,即 pH值越大 (>9)灭活虫卵效果越好 ,水分越高 (>3 0 % )灭活虫卵效果越差。 结论 粪尿分集式厕所对寄生虫卵有较好的杀灭作用 ,加有太阳能板的厕所效果更佳。

人蛔虫和猪蛔虫差异的比较研究

人蛔虫和猪蛔虫的分类地位一直存在争议。本文就人蛔虫和猪蛔虫的形态学、宿主感染特异性、免疫学、生化学和核型进行比较研究,对近年来分子遗传学方面的有关进展进行了综述。

不同来源家蝇幼虫分泌物对猪蛔虫卵发育影响

目的分别从饲养家蝇幼虫的饲料残渣及幼虫浸液中提取家蝇幼虫分泌物,初步纯化后观察对猪蛔虫卵发育的影响。方法将家蝇幼虫饲料残渣或3龄幼虫浸泡于适量蒸馏水中4 h,吸取浸液用硫酸胺盐析或透析的方法分离分泌物,所得分泌物分别制成虫卵培养液,观察培养液中猪蛔虫卵发育情况。同时,设立不含家蝇幼虫分泌物的培养液为阴性对照。结果从饲料残渣和幼虫浸液中提取的分泌物0～30%,30%～50%的盐析蛋白液、盐析上清液对虫卵发育均无影响;50%～80%的盐析蛋白液、透析外液可明显阻碍虫卵的发育。结论家蝇幼虫饲料残渣和幼虫浸液中提取的幼虫分泌物均可阻碍猪蛔虫卵的发育,活性物质主要集中在50%～80%的盐析沉淀部分,其分子量〈14KD。

使君子提取物对感染猪蛔虫小鼠的驱虫试验

选择50只昆明种(km)小白鼠,分成5组,其中3组因使君子提取物浓度不同而分,其余一个为对照组,一个为空白组,为了探究使君子提取物的驱虫效果,进行了为期1个月的试验。结果表明,使君子提取物具有较好的驱除猪蛔虫的效果。

苏云金芽胞杆菌伴胞晶体毒素对小鼠体内猪蛔虫三期幼虫的作用及其免疫组织化学定位

将培养好的感染性猪蛔虫卵以每只5×103个虫卵感染小鼠,于次日以不同方式(灌胃、肌肉注射、静脉注射和腹腔注射)注入苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白(insecticidal crystal proteins,Icps),对照组静脉注射BSA(小牛血清白蛋白),每只0.5mL,连续3d。小鼠于第6天剖杀,肝脏分离幼虫,计算减虫率。取肝脏,以4%多聚甲醛固定48h,制作石蜡切片,应用免疫组织化学SABC法定位蛔虫幼虫体内的Icps。研究结果显示,静脉注射晶体蛋白毒素效果最好,减虫率达到72.7%;肌肉注射、灌胃、腹腔注射效果次之,分别为19.1%、14.6%、14.36%。免疫组织化学研究显示,Icps结合到虫体的体表及肠道。

应用间接血凝试验(IHA)诊断猪蛔虫病

以猪蛔虫抗原致敏绵羊红细胞制备检测猪蛔虫特异性抗体的间接血凝诊断试剂,与猪蛔虫抗体发生特异性凝集反应。结果表明,用间接血凝诊断试剂对3 000份猪血清进行现场检测,阳性率为30.00%;而琼脂扩散试验(AGP)的阳性率为13.00%,表明,间接血凝试验(IHA)比GAP敏感,间接血凝诊断试剂可用于猪蛔虫病的快速诊断。

复方阿苯达唑对离体猪蛔虫的作用观察

复方阿苯达唑对离体猪蛔虫的作用观察四川省寄生虫病防治研究所成都６１００４１陈闯，唐中玖，张德洪，张孝蓉，陈亚伟华西医科大学成都６１００４１童荣生，叶松柏１材料和方法１．１药物复方阿苯达唑系阿苯达唑与噻嘧啶按一定比例的混合原粉，由四川省寄生虫病防治研究...

96孔板-PCR排除法筛选猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因

为了从猪蛔虫雌虫cDNA文库中筛选出猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因,本研究根据猪蛔虫雌虫卵黄蛋白原基因的EST序列为模板设计引物,采用96孔板-PCR排除法对猪蛔虫雌虫cDNA文库进行筛选,并筛选出阳性克隆F993-G10-A10。测序结果表明,该基因序列长621bp,有完整的3'端。经BLAST分析,其推导的氨基酸序列与秀丽隐杆线虫(C.elegans)的卵黄蛋白原基因(Vit1、Vit2、Vit3、Vit4和Vit5)的氨基酸序列的一致性分别为35%、35%、34%、34%和35%,核苷酸序列相似性分别为55%、57%、54%、54%和53%。该阳性克隆的获得为该基因的深入研究奠定了基础。同时也证明了96孔-PCR排除法是一种高效、简便、低成本的筛选文库方法。