猪霍乱沙门氏菌C78-1株Δcrp缺失株的构建及其生物学特性初步研究

通过自杀性质粒介导的等位交换技术构建猪霍乱沙门氏菌C78-1株的crp基因缺失株,并对其生物学特性进行初步研究。首先以猪霍乱沙门氏菌C78-1基因组为模板进行PCR,扩增出crp基因上下游片段(1 048和1 743 bp),并分别将其克隆入自杀性质粒pRE112上,构建含缺失320 bpcrp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp。运用重组自杀性质粒介导的等位交换技术,两步法筛选C78-1的Δcrp缺失株。进一步的生物学特性研究表明,缺失株的血清型与亲本菌株C78-1一致,且能够稳定遗传缺失的crp基因,但其生化特性和生长速度与C78-1相比发生明显改变,小鼠致死性试验结果表明其毒力较C78-1降低约750倍。以上结果均证实,作者成功构建了猪霍乱沙门氏菌C78-1株的crp基因缺失突变株,缺失株遗传稳定,毒力显著降低,为进一步开发猪霍乱沙门氏菌的弱毒疫苗菌株奠定了基础。

猪霍乱沙门氏菌的分离与鉴定以及PCR检测方法的建立

[目的]为了确定四川省某猪场初生仔猪大规模发病的原因。[方法]对发病仔猪进行细菌分离、培养特性及形态结构观察、生化鉴定、药敏试验、动物致病性试验和血清型鉴定,并建立PCR快速检测方法。[结果]从发病仔猪体内分离到1株优势菌,初步鉴定为沙门氏菌。根据沙门氏菌invB基因设计的1对引物进行PCR扩增,得到408bp的特异性条带,PCR产物经T-A克隆测序证实为invB基因,与参比序列具有非常高的同源性,说明该PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性。经血清学试验确定该分离株为猪霍乱沙门氏菌,毒力试验和药敏试验结果表明分离菌致病性很强,对头孢三嗪、氯霉素、氧氟沙星等敏感。[结论]该研究为沙门氏菌病原鉴定与疾病诊断提供了依据。

基于免疫磁分离的荧光微球免疫层析法检测猪霍乱沙门氏菌

建立了基于免疫磁分离的荧光微球免疫层析法,检测猪霍乱沙门氏菌。待检样品经免疫磁分离富集和热洗脱处理后,用荧光微球免疫层析试纸条进行检测。每毫克纳米磁珠标记30μg抗体制备的免疫磁珠,对浓度为10~2~10~6CFU/mL的猪霍乱沙门氏菌的捕获率均大于90%,特异性好;在pH=6时,以300μg/mg猪霍乱沙门氏菌单抗11D8-D4标记荧光微球,制备免疫荧光微球;以2.0 mg/mL猪霍乱沙门氏菌单抗5F11-B11喷涂检测线(T线),以1.0 mg/mL驴抗鼠IgG喷涂质控线(C线),制备免疫层析试纸条。采用建立的基于免疫磁分离的荧光微球免疫层析方法检测猪霍乱沙门氏菌,在PBS缓冲液中检出限为1.5×10~5CFU/mL,牛奶中检出限为7.6×10~5CFU/mL,与直接采用荧光微球免疫层析方法检测相比,检出限分别降低了10倍和200倍。本方法可有效富集牛奶中的沙门氏菌,避免了基质干扰,灵敏度大大提高,具有较好的应用前景。

规模化猪场猪霍乱沙门氏菌的分离鉴定与药敏试验

采集新乡市某规模化猪场疑似猪沙门氏菌病的病料,通过细菌分离培养、生化鉴定、动物试验和药敏试验,分离到1株革兰氏阴性小杆菌,该菌在麦康凯琼脂平板上呈细小、无色半透明、光滑、圆整的菌落,对葡萄糖、木糖醇、赖氨酸、甘露醇、蔗糖、果糖和山梨醇反应阳性,对甘露糖、硫化氢、苯丙氨酸、尿素酶反应呈阴性,可致死小白鼠,确定所分离的细菌为猪霍乱沙门氏菌。该菌对头孢噻呋、左旋氧氟沙星等敏感,对诺氟沙星和新霉素中介,对氟苯尼考、氨苄西林、庆大霉素等耐药。该研究为猪沙门氏菌病的防治提供理论依据。

猪霍乱沙门菌载体介导猪瘟病毒DNA免疫研究

构建了猪瘟病毒(CSFV)主要保护性抗原E2基因的真核表达质粒pVAXE2。将其电转化猪霍乱沙门氏菌C500疫苗株,得到了携带pVAXE2质粒的猪霍乱沙门氏菌工程菌株S.C500pVAXE2,对该菌株的特征、培养特性和生化特性进行了鉴定。分别用1×108CFU、2×109CFUS.C500pVAXE2经口服或肌肉注射免疫小鼠和家兔,间接ELISA检测免疫动物的特异性抗体,在第三次免疫后2周用20ID50猪瘟兔化弱毒和致死量猪霍乱沙门氏菌强毒株对免疫兔进行攻击。结果表明,S.C500pVAXE2保持了猪霍乱沙门氏菌原有形态特征、培养特性和生化特性,免疫鼠和兔都产生了抗CSFV和猪霍乱沙门菌的ELISA抗体,免疫家兔能抵抗猪瘟兔化弱毒株和猪霍乱沙门氏菌强毒株的攻击。显示了以S.C500为DNA运输载体构建二联或多联猪用疫苗的可行性。

绿荧光蛋白基因在猪霍乱沙门氏菌C500株asd^-缺失株平衡致死载体系统中的表达

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱用于预防仔猪副伤寒病的弱毒疫苗株,毒力弱且免疫原性良好。为将猪霍乱沙门氏菌开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体并保持原有免疫原性,构建了以C500为亲本菌,用负向选择的重组自杀性质粒介导接合转移的方法构建了无抗性标记的asd-缺失株。首先构建asd(天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶)基因缺失1408bp的带有蔗糖敏感基因sacB的重组自杀性质粒,与C500接合转移,两步法筛选无抗性的asd-缺失株,通过PCR鉴定。该缺失株在无外源DAP(二氨基庚二酸)条件下溶菌死亡,它的生长必需外源DAP。PCR扩增绿荧光蛋白突变体4基因,克隆到带有asd基因的原核表达载体pYA3493中,电转化C500asd-缺失株,转化子在LB中生长,并激发强的绿荧光。上述结果表明,该asd-缺失株的构建是成功的,并且可以用来作为宿主载体平衡致死系统来高效表达外源基因,为开发C500为载体的口服多价疫苗奠定了基础。

猪霍乱沙门菌SC500运载TGEVS与猪IL-15融合基因疫苗的稳定性及免疫安全性

为研究猪霍乱沙门菌SC500作为TGEV S与IL-15融合基因疫苗pCC-S-IL-15、pCI-S-IL-15运载体的稳定性与免疫安全性,将外源表达质粒pCC-S-IL-15、pCI-S-IL-15及空载体质粒pCC-neo、pCI-neo转化SC500,采用体外增殖试验研究不同质粒在SC500中的稳定性,携带质粒的SC500对ST细胞的黏附率、侵袭力和增殖能力的影响;采用BALB/c小鼠口服免疫试验研究表达质粒在体内的稳定性及SC500对小鼠的安全性。结果显示:外源目的基因影响表达载体在运载体内的稳定性,就载体类型而言,对pCI-neo的影响大于对pCC-neo的影响;携带目的基因的外源质粒影响SC500对ST细胞的黏附率和侵袭率,pCC-neo影响大于pCI-neo;外源质粒影响SC500在小鼠体内的增殖能力,pCC-neo影响大于pCI-neo;SC500在体内的增殖中,其所运载的质粒具有一定的稳定性。结果表明,利用SC500运载基因疫苗pCC-S-IL-15、pCI-S-IL-15免疫小鼠具有相对的稳定性和免疫安全性。

猪霍乱沙门氏菌的快速分离鉴定

猪霍乱沙门氏菌是引起仔猪副伤寒的主要病原菌,给养猪业造成重大危害。本文旨在建立一套细菌快速分离鉴定方法,为该病流行病学调查提供有效手段。从临床初诊为仔猪副伤寒的病猪采集粪便,接种亚硒酸盐亮绿增菌液增菌后,划线于SS琼脂培养基,挑无色透明菌落纯化。纯化菌落用美国B IOLOG自动细菌鉴定仪GN2肠杆菌鉴定板鉴定,同时用常规生化鉴定管鉴定,结果符合猪霍乱沙门氏菌的生化特征。PCR扩增invA基因,测序鉴定PCR产物,结果与猪霍乱沙门氏菌参考序列同源性达99%以上。分离菌株接种小白鼠,证明其对小白鼠有致病性。用沙门氏菌属标准血清检测证实其抗原式为6,7∶c∶1,5,符合猪霍乱沙门氏菌的抗原特征。应用以上方法从全国各地病料中分离鉴定了40多株猪霍乱沙门氏菌,为猪霍乱沙门氏菌病的流行病学调查提供了依据,同时证明该方法切实可行。

猪霍乱沙门氏菌C500株△crp△asd缺失株平衡致死载体系统的构建及鉴定

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法致弱、用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株,虽具有较好的免疫原性,但仍有一定的残余毒力。为了研制更加安全并保持C500株良好免疫原性的弱毒株,及将C500开发为适于粘膜免疫的疫苗活载体,本文构建了猪霍乱沙门氏菌C500株△crp△asd双缺失株平衡致死载体系统。首先构建含缺失320bp的crp(cAMP受体蛋白)基因与蔗糖敏感基因(sacB)的重组自杀性质粒,与C500接合转移,两步法筛选无抗性的△crp缺失株,用PCR证实基因组crp基因的缺失突变。用同样方法在crp缺失株基础上构建asd(天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶)基因缺失株。该缺失株生长必需外源DAP(二氨基庚二酸)。进一步鉴定△crp缺失株的表型、生长特性、毒力等,结果表明△crp△asd缺失株构建成功。△crp△asd缺失株可以用来作为宿主载体平衡致死系统来高效表达外源基因,为深入研究以C500株为载体的口服多价疫苗奠定了基础。

猪霍乱沙门氏菌LAMP检测方法的建立与应用

利用猪霍乱沙门氏菌lac Z基因设计特异性引物,通过优化各种反应条件,建立了检测猪霍乱沙门氏菌的环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法。此方法特异性好,灵敏度高,将细菌DNA稀释到10-8仍可检出,是PCR方法的1000倍。本研究建立的LAMP方法操作简便、灵敏度高、特异性强,为临床检测猪霍乱沙门氏菌和预防人猪霍乱沙门氏菌病提供了技术保障。

两株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪霍乱沙门氏菌的分离及人工共感染猪的致病性试验

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与细菌混合感染的情况,本研究采用RT-PCR方法对不同猪场采集的样品进行PRRSV检测,并进一步对PRRSV阳性样品进行细菌培养分离,经BIOLOG细菌鉴定仪鉴定,分离培养的细菌为猪霍乱沙门氏菌(S.cholersuis)。利用分离获得的2株PRRSV和一株S.cholersuis进行动物回归试验,结果表明所有人工感染猪在感染后的第5 d出现病毒血症;2份PRRSV分离株单独人工感染的发病率均为100%,死亡率分别为55.6%和100%;PRRSV与S.cholersuis共感染的动物死亡率均为100%。与单独的PRRSV感染组相比,PRRSV与S.cholersuis共感染后实验动物的发病和死亡时间大大缩短,进一步表明其混合感染具有协同致病性,导致发病率和死亡率的上升。

樱桃谷鸭感染猪霍乱沙门氏菌的分离鉴定

某地樱桃谷鸭群发生一种高发病率、高死亡率的传染病 ,其临床表现为沉郁、不食、下痢、脚软、发热等 ,病变特征以内脏器官充血、出血为主。本文从鸭体内分离到 2株细菌 ,经鉴定为猪霍乱沙门氏菌 ;并进行了毒力试验和药敏试验 ,结果 2菌致病性均很强 ,对氯霉素、卡那霉素。

TaqMan-rRT-PCR检测猪霍乱沙门菌方法的建立和实验室评价

目的基于猪霍乱沙门菌血清型特异性基因,建立TaqMan逆转录实时聚合酶链反应(TaqMan-rRT-PCR)检测猪霍乱沙门菌的方法。方法利用基因组序列比对筛选到猪霍乱沙门菌特有的基因SC0358,通过普通PCR及利用多种血清型沙门菌及非沙门菌菌株共计145株,评价该方法的菌株特异性,针对该基因设计TaqMan-rRT-PCR检测方法的引物,优化反应条件,建立针对该靶基因的TaqMan-rRT-PCR检测方法,以纯菌及血液模拟标本RNA为模板进行敏感性检测。结果利用该方法检测26株猪霍乱沙门菌均为阳性,其余菌株扩增均阴性,对纯菌RNA检测中,TaqMan-rRT-PCR的最低检测限度为5 fg/反应,约为10个拷贝/反应。对全血液模拟样品分析中,敏感性达25 cfu/mL。结论以猪霍乱沙门菌保守、特异基因SC0358建立的TaqMan-rRT-PCR方法,能够简便快捷区分猪霍乱沙门菌与其他血清型沙门菌,尤其能够区分与其有抗原式相同的丙型副伤寒沙门菌,此方法为猪霍乱沙门菌感染的快速诊断提供了简便的手段,可用于对猪霍乱沙门菌的早期诊断。

猪霍乱沙门菌致感染性腹主动脉瘤1例

腹主动脉瘤是一种严重威胁生命的疾病,随着B超、CT、MRI等无创影像学检查的发展,动脉瘤的发现率逐渐增加,但感染性动脉瘤极少见〔1〕,常于并发菌血症和败血症或动脉瘤破裂时才被发现。

蓝狐猪霍乱沙门氏菌的分离鉴定

某蓝狐场２只成狐于１９９６年１１月先后发病，临床症状为呕吐、腹泻、眼有脓性分泌物，病程分别为７和１２天，病理变化主要为杆脏、脾脏、淋巴结肿大，有小坏死灶。作者从脾脏和淋巴结中分离出２株猪霍乱沙门氏菌，且证明２株菌有较强的致病性。

猪霍乱沙门菌败血症1例报告

患者男,23岁。因发热、尿黄3 d,于2010年1月23日以黄疸待查收入院。3 d前患者无明显诱因出现发热伴畏寒、寒战,体温最高40.5℃,伴头痛、腰痛、恶心、呕吐,呕吐物为胃内容物,非喷射状;每日排尿约200 ml,无尿痛;在本单位卫生室静滴左氧氟沙星、地塞米松,口服布洛芬、清开灵后体温下降，4～6h又升至40℃左右。

猪霍乱沙门菌菌蜕的制备及免疫保护效力研究

为制备猪霍乱沙门菌菌蜕并研究其免疫保护效力,克隆噬菌体phi X174裂解基因E,与p BV220连接,构建温控溶菌表达载体,将该载体转入猪霍乱沙门菌TTB1中,制备菌蜕并对其裂解率、安全性以及对小鼠的免疫保护效力进行了研究。结果显示:成功克隆了裂解基因E、片段大小274 bp,构建了温控溶菌质粒载体p BVE,制备了猪霍乱沙门菌菌蜕,其裂解率最高为99.46%、经冻干灭活残余活菌,安全性试验检测证实其安全后,对小鼠进行了免疫保护试验,其保护率为70%、与弗氏佐剂灭活苗保护率相当、优于甲醛灭活苗。研究为猪霍乱沙门菌感染的防治奠定了基础。

新生儿猪霍乱沙门菌医院感染调查分析

目的防止和减少新生儿病房及监护室感染性疾病暴发流行。方法对本院新生儿室2006年9月8例新生儿猪霍乱沙门菌医院感染进行调查分析。结果猪霍乱沙门菌在免疫功能低下的新生儿中易引起流行,主要为肠炎型及败血症型。结论所有新生儿特别是早产儿均为易感儿。交叉感染是主要的感染途径。早期隔离是预防感染流行的重要因素。