猪2型圆环病毒核酸疫苗免疫效应研究

PCR扩增PCV2 ORF2和BVP22基因。将ORF2基因克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+),构建了pCORF2作为核酸疫苗免疫小白鼠。同时将具有蛋白转导功能的BVP22基因分别克隆到ORF2基因的上游和下游,使二者融合表达,命名为pCORF2BVP22和pCBVP22ORF2。分4组肌肉免疫BALB/c小白鼠,分别注射pCD-NA3.1(+)、pCORF2、pCORF2BVP22和pCBVP22ORF2,共免疫2次,间隔2周,分别于首免后2周和二免后4周采血,ELISA法检测体液抗体。同时为在体外验证ORF2和BVP22基因的真核表达,将ORF2和BVP22基因分别克隆入pEGFP-N1载体,构建了pNORF2和pNBVP22,转染Hela细胞后在荧光显微镜下观察到了ORF2和BVP22在体外的瞬时高效表达。结果显示,通过两次免疫后,各疫苗组均产生了针对ORF2的体液抗体,同时证明BVP22可增强核酸疫苗的免疫效果,其中以BVP22在ORF2上游效果更好。本研究为防制猪2型圆环病毒感染提供了较为理想的侯选疫苗。

猪2型圆环病毒ORF1基因的克隆及表达

根据GenBank中猪圆环病毒 2型 (PCV 2 )的ORF1基因序列 ,设计合成了 1对引物 ,对PCV 2广东株 (GD)ORF1基因进行PCR扩增 ,将扩增的ORF1基因克隆入 pMD 18 T载体 ,获得的重组质粒命名为 pMD ORF1。将ORF1的KpnⅠ和XbaⅠ双酶切产物插入原核表达载体pBAD/ gⅢC得到重组子 ,命名为 pBAD/ gⅢ ORF1。序列分析表明 ,克隆的ORF1与德国分离株AF2 0 1897核苷酸序列的同源性高达 99.5 % ;与其他PCV 2株的核苷酸序列同源性为 92 .1%～99.9% ,推导的氨基酸序列同源性为 90 .2 %～ 99.5 %。同时 ,测序结果表明 ,克隆的ORF1准确插入了 pBAD/ gⅢC的多克隆位点 ,未改变读码框。用L 阿拉伯糖诱导表达 ,收集菌液进行SDS PAGE和Western blotting分析 ,结果表明PCV 2ORF1在pBAD/ gⅢC中获得了高效融合表达 ,其表达蛋白的分子质量约为 4 1ku。

猪2型圆环病毒核酸疫苗的接种Balb/c小鼠实验免疫研究

为了筛选得到较理想的核酸疫苗,用pVAX1真核表达载体,以猪白介素18基因、猪2型圆环病毒内蒙株的衣壳蛋白和与复制相关蛋白基因为目的基因,构建了4个重组质粒,分别是pVAX1-ORF2、pVAX1-UL18ORF2、pVAX1-ORF2ORF1和pVAX1-IL18ORF2ORF1。用它们免疫6-8周龄Balb/c小鼠,进小鼠后一周首免,每隔19d免1次,共免3次;每10d采血1次,三免后10d杀鼠取脾。用ELISA方法检测小鼠血清抗体效价,流式细胞仪检测脾T淋巴细胞亚类CD4+、CD8+数量。统计学分析发现:4个核酸疫苗实验免疫组均是从最后一次采集的小鼠血清中,获得最高的抗体效价,与对照组PBS和空载体pVAX1相比都能产生一定的体液免疫反应,且以pVAx1-IL18ORF2ORF1核酸疫苗免疫小鼠产生的血清抗体效价最高;脾T淋巴细胞亚类数量测定发现,免疫实验组的CD4+与CD8+的T细胞亚类总数显著高于对照组(P<0.05),并以pVAX-1-IL18ORF2ORF1数值较高。结论是核酸疫苗pVAX1-IL18ORF2ORF1既能较好地刺激细胞免疫又能产生一定的体液免疫反应,相对较好,将作为候选核酸疫苗进行下一步本体动物免疫实验研究。

猪2型圆环病毒核酸疫苗的构建、鉴定和表达

以pVAX1为真核表达载体,以猪白介素18基因、猪2型圆环病毒内蒙古株的衣壳蛋白和复制蛋白基因为目的基因,构建了pVAX1-ORF2、pVAX1-IL18-ORF2、pVAX1-ORF2-ORF1和pVAX1-IL18-ORF2-ORF1等4个重组质粒作为核酸疫苗。将这4个重组核酸质粒分别酶切鉴定后,转染BHK-21和PK-15细胞进行RT-PCR、间接免疫荧光和Western blotting检测。结果表明,重组核酸质粒构建正确,并能进行表达。

表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

目的以伪狂犬病病毒为载体,构建表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组病毒,并研究其生物学特性。方法将猪2型圆环病毒ORF2基因插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体中,构建猪2型圆环病毒-伪狂犬病病毒重组中间转移质粒,然后将该质粒与伪狂犬病病毒TK-/gG-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行重组病毒的筛选及生物学特性测定。结果利用检测PCV2ORF2基因和LacZ基因的PCR方法筛选到重组病毒TK-/gG-/ORF2+,同时用Southernblotting证实外源基因PCV2ORF2已成功插入到TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组中。间接免疫荧光试验(IFA)和Westernblotting结果显示重组病毒中PCV2ORF2基因获得了成功表达。对重组病毒的生物学特性研究表明,重组病毒与其亲本株在不同细胞上的增殖滴度相当,且重组病毒对小鼠无致病性,免疫小鼠后可诱导机体产生抗ORF2蛋白的特异性抗体。结论重组伪狂犬病毒构建成功,且表达的ORF2蛋白具有免疫原性。

猪2型圆环病毒核酸疫苗的研制及其对小白鼠的免疫效果

为研制猪2型圆环病毒(PCV2)新型核酸疫苗,以pcDNA3为载体,与PCV2的ORF2及其高变区V1、V2、V3、V1-V2连接,分别成功构建了真核表达质粒pcDNA3-ORF2、pcDNA3-V1、pcDNA3-V2、pcDNA3-V3和pcDNA3-V1-V2。对阳性真核表达质粒大量生产并纯化后,以每只小白鼠0.2 mg免疫5周龄左右的雌性小白鼠,然后用ELISA检测免疫小白鼠血清中抗体的产生情况。结果显示,这5种真核表达质粒均能刺激小白鼠产生特异性抗体,但相比之下,真核表达质粒pcDNA3-V1-V2诱导小白鼠产生的抗体水平更高,维持的时间更久。表明质粒pcDNA3-V1-V2的免疫效果较好,有望成为防制猪2型圆环病毒的候选疫苗。

猪2型圆环病毒SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立

通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了一种检测PCV2的SYBR Green荧光定量PCR方法。试验结果表明,该方法特异性强,与猪1型圆环病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等均无交叉反应。该方法最低可检测到10拷贝/μL的DNA,比PCR检测方法敏感性高1 000倍;其标准曲线线性范围是6.84×102～6.84×107拷贝,且具有良好的重复性。

猪2型圆环病毒Cap蛋白在伪狂犬病病毒中的表达

用EcoR酶切伪狂犬病病毒疫苗株Tk-/gE-/LacZ+基因组,与含有猪2型圆环病毒(PCV2)ORF2基因的重组转移载体pIEORF2共转染IBRS-2细胞。收集病变细胞,经空斑纯化和PCR鉴定,获得了新的重组病毒Tk-/gE-/ORF2+。用Southern blot杂交证明该重组病毒构建正确,用间接免疫荧光法和Western blot证明该重组病毒可表达PCV2的主要免疫原性蛋白Cap蛋白。重组病毒在IBRS-2细胞上连续传15代后,遗传稳定。该重组病毒在IBRS-2细胞上增殖滴度为10-7.1TCID50/0.1mL,在鸡胚成纤维细胞上增殖滴度为10-4.8TCID50/0.1mL,在Marc-145细胞上增殖滴度为10-6.8TCID50/0.1mL。

猪2型圆环病毒ORF1与ORF2基因和伪狂犬病毒基因的重组与表达的研究

根据GenBank发布的猪2型圆环病毒(PCV2 )序列(AY0 35 82 0 ) ,设计两对特异性引物,采用PCR方法,分别扩增了猪2型圆环病毒ORF1和ORF2基因。将ORF1和ORF2基因的PCR产物回收并酶切后,依次插入到伪狂犬病毒gE gI双缺失通用转移载体pIECMV中,构建了猪2型圆环病毒_伪狂犬病毒重组中间转移质粒pIEORF1_ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移质粒pIEORF1_ORF2与伪狂犬病毒TK- gE- LacZ+ 基因组共转染IBRS_2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行空斑纯化,利用检测PCV2ORF1基因和ORF2基因的PCR方法筛选重组病毒TK- gE- gI- ORF1-ORF2 + ,用Southernblotting鉴定重组病毒,并用Westernblotting检测ORF1_ORF2融合蛋白的表达情况,在此基础上也测定了重组病毒在不同细胞上的增殖滴度。结果表明,外源基因ORF1和ORF2已成功插入到TK- gE- LacZ+ 亲本株的基因组中,并获得了表达,表达的蛋白可与PCV2阳性血清发生反应。同时发现ORF1和ORF2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当。

16株猪2型圆环病毒全基因组克隆及序列分析

采用猪2型圆环病毒(PCV2)型特异性引物,通过PCR方法直接从疑似PMWS病猪肺、淋巴结病料中扩增出16株PCV2的全基因组序列,将扩增产物回收连接到pMD19-T,转化到DH5α后进行克隆测序。结果显示:16株PCV2中,有12株基因组全长为1767bp,1株全长为1766bp,3株PCV2的基因组全长为1778bp。同源性分析结果表明,16株PCV2之间的核苷酸同源性为95.7%～100%,与GenBank已发表的9株PCV2分离株基因组同源性为94.3%～99.9%,与2株PCV1分离株基因组的同源性为76.6%～77.3%;遗传进化树显示16株PCV2主要分为2种基因型,其中134-ZF1、134-ZF2、134-ZF3、141-ZF1、141-ZF2、141-ZF3、142-TL1、142-TL2、142-TL3、142-TL4、142-TL5和148-ZF3这12株与AF055394(法国株)同属于PCV2b亚型,亲缘关系较近;133-ZF1、143-2-15、148-ZF1和WJQ001与AY181946(中国株)同属于PCV2d亚型,组成一个分支。所得的16株PCV2的ORF2核苷酸及其所推导的氨基酸序列与参考株同源性分别为90.2%～99.9%和92.1%～100.0%,存在较大的变异。

猪2型圆环病毒ORF2基因在塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的新型真核表达载体中的表达

猪 2型圆环病毒 (porcinecircovirus 2 ,PCV2 )是断乳仔猪多系统衰竭综合征 (postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)的原发性病原。PCV2的ORF2编码病毒唯一的结构蛋白Cap。根据GenBank中公布的PCV2JXL株的序列设计一对引物 ,应用PCR方法从该毒株感染的PK 15细胞中扩增出完整的ORF2基因 ,将此基因克隆于本实验室此前构建的塞姆利基森林病毒 (SemlikiForestvirus,SFV)RNA复制子衍生的新型真核表达载体pSFV1CS中的BamHⅠ位点 ,获得重组质粒pSFV1CS Cap。用pSFV1CS Cap分别转染BHK 2 1细胞和 2 93T细胞 ,经间接免疫荧光试验检测表明 ,PCV2ORF2基因在转染细胞中得到表达。小鼠接种试验表明 。

三株猪2型圆环病毒甘肃分离株的全基因组序列分析

根据GenBank中发表的猪2型圆环病毒（PCV2）全基因组序列,设计合成了2对引物,采用PCR方法对来自甘肃不同猪场的3份病料中的PCV2进行基因的扩增、克隆和测序,得到全基因组长度为1 768 bp的PCV2Ww株（登录号DQ322701）以及全基因组长度为1 767 bp的PCV2 LZ株和TS株（登录号DQ363860和DQ355153）.应用DNAstar软件序列分析可得,3个分离株全基因组与国内外参考毒株核苷酸序列同源性在94.8%~99.4%,3个分离株之间的核苷酸序列同源性为96.4%~99.4%;PCV2分离株与PCV1分离株核苷酸序列同源性为69.0%~70.0%;ORF1和ORF2所编码的氨基酸序列与国内外PCV2毒株比较,同源性也很高,分别为99.0%~99.4%和92.7%~98.7%.进化树分析表明,PCV2分离毒株在进化上存在地域上的相关性.

猪2型圆环病毒石河子流行株全基因组的克隆和序列分析

根据已发表的猪2型圆环病毒(Porcine circovirus type 2,PCV-2)全基因组序列设计2对引物,用PCR的方法分2段克隆圆环病毒的基因,测序后拼接得到该圆环病毒的基因组。序列分析结果表明,PCV-SHZ基因组全长为1767bp(Genbank登录号:JF718784),基因型为PCV-2a。用DNAMAN软件将此株病毒基因组与国内其它12个省市PCV-2参考株的基因组核苷酸序列进行同源性比较,同源率为95.25%～99.55%。用MEGA软件分别对该病毒和参考株的全基因组、ORF1和ORF2进行进化树分析,结果表明PCV-2流行株在进化上存在地域上的相关性。

四种常用化学消毒剂对猪2型圆环病毒杀灭效果研究

试验应用复合碘制剂、2%戊二醛消毒液、优氯净消毒粉(二氯异氰尿酸钠)、苯扎溴铵四种常用的化学消毒剂对猪2型圆环病毒杀灭效果进行研究,采用病毒滴定、中和剂鉴定及病毒灭活试验进行检测。结果表明,二氯异氰尿酸钠的杀灭效果最好,其次是戊二醛,复合碘制剂也有一定的杀毒作用,苯扎溴铵消毒液的杀灭效果最差,建议将二氯异氰尿酸钠和戊二醛作为控制猪2型圆环病毒的消毒剂,可有效防止猪2型圆环病毒的传播。

猪2型圆环病毒新疆株全基因组的克隆与序列分析

根据GenBank中猪2型圆环病毒(PCV2)的核苷酸序列,设计了一对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出一株PCV2全基因组,将其克隆到pMD simple18-T载体上,筛选获得了重组质粒pMD18-T-PCV2。对此重组质粒进行序列测定及同源性分析,结果表明,该PCV2新疆株的全基因组大小为1 767bp,与其它PCV2核苷酸序列同源性为95.0%～99.6%,而与PCV1的同源性仅为76.8%～76.9%。

猪2型圆环病毒ORF2基因片段的克隆与序列分析

利用ArrayDesigner2.0软件设计PCV2引物直接从PDNS病料肺组织中PCR扩增获得PCVCQB7基因片段,用pMD18-T载体连接、克隆获得PCVCQB7重组质粒。序列测定和与标准毒株对位比对分析PCVCQB7核苷酸序列全长624bp,系PCV2ORF2基因片段,与PCV2分离株的核苷酸序列相似性在80%以上,与PCV1在66%以下,采用最大似然法构建的系统发生树分析发现PCVCQB7位于PCV2主枝上,并与国内和欧洲分离株Imp.1147、304、375、QD、GD-TS、SH、24657_NL毒株亲缘关系较近形成一小分枝,表明PCVCQB7为引起PDNS的PCV2扩增产物。

猪2型圆环病毒病病原学研究

对猪2型圆环病毒(Porcine circovirusII,PCV-2)的病原特性、基因组结构以及分子生物学特征等方面的研究做了较为详细的介绍。

某猪场猪2型圆环病毒感染的诊断

猪2型圆环病毒（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原，此外，PCV2还可能与猪皮炎肾病综合征、猪呼吸系统综合征、仔猪先天性震颤等疾病有关。PMWS临床症状主要表现为进行性消瘦，生长发育受阻，皮肤苍白或有黄疸，体表淋巴结肿大，腹泻，贫血和呼吸道症状等。自2000年朗洪武等首次报道我国有PMWS发生以来，PCV2在我国快速传播。2008年6月，沈阳市某养猪场猪群出现精神沉郁、苍白消瘦、咳嗽等症状，结合流行病学、

某规模化猪场猪2型圆环病毒病流行病学调查

为了弄清猪2型圆环病毒感染在该猪场的感染状况、流行特点及优势基因型等情况.采用ELISA检测技术和PCR技术,对新疆某规模化猪场的不同生产阶段猪群进行猪2型圆环病毒（PCV2）抗体检测和基因型检测.结果猪圆环病毒病（PCVD）在该猪场猪群中的平均抗体阳性率为72.41％,不同生长阶段的猪群感染情况分别为哺乳仔猪69.74％、断奶仔猪62.75％、育肥猪77.88％、母猪81.67％以及种公猪83.33％;对采集的11份抗体阳性的断奶猪只的脏器病料PCR检测,其中5份为PCR阳性（45.45％）,经克隆测序分析发现,该猪场5株PCV2毒株序列之间的相似性在99.3％～99.9％之间,且均属于PCV2b这一亚型.结果表明,该猪场的PCV2感染流行已非常严重,整体流行特征表现为猪只日龄越大,感染情况越严重,且流行的优势基因型为PCV2b亚型,应该引起养殖户的高度重视,需要立即采取针对有效的防治净化措施.