1株G26P[23]型猪A群轮状病毒的基因组特征

目的分析2021年从福建省发生腹泻的猪场分离到的1株G26P[23]新基因型猪轮状病毒RVA/pig/CHN/FJSH01/2021/G26P[23](简称FJSH01)的分子特征。方法利用MARC-145细胞进行RV分离,采用RT-PCR方法对分离株FJSH01的全基因组进行了测定,利用在线分型工具RotaC v2.0对其基因型进行鉴定,并对其分子遗传特征进行了分析。结果分离株FJSH01的基因型图谱为G26-P[23]-I5-R1-C1-M1-A8-N1-T1-E1-H1,即G26P[23]型。分离株FJSH01的VP3、NSP1、NSP3和NSP5基因分别与人源轮状病毒RVA/Human_wt/VNM/30378/2009/G26P[19]、RVA/Human-wt/VNM/NT0077/2007/G4P[6]、Human/LL4260/China/T1和RVA/Human/Ryukyu-1120的核苷酸同源性最高,为96.01%~98.65%,其余7个片段与猪源轮状病毒(PoRV)的核苷酸同源性最高,为95.12%~97.99%,表明分离株FJSH01可能为人源轮状病毒和猪源轮状病毒重配后的病毒株。结论G26P[23]型PoRV为国内首次鉴定,研究结果丰富了PoRV分子流行病学资料,为PoRV预防控制提供理论参考。

猪A群轮状病毒VP6单克隆抗体的制备和初步鉴定

旨在通过RT-PCR扩增猪A群轮状病毒(group A rotavirus,RVA)VP6基因节段,并克隆至pET28a-SUMO,构建原核表达载体pET28a-SUMO-VP6,将该重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导、镍柱亲和层析纯化以获得重组蛋白SUMO-VP6,Western blot验证该重组蛋白能够与小鼠抗轮状病毒血清反应。将该重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,Western blot和间接免疫荧光验证阳性杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体与RVA的反应性。经3轮亚克隆最终获得一株能稳定分泌针对VP6蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株5G9,其分泌的单抗亚类为IgG1,轻链类型为Kappa,制备的小鼠腹水效价可达1∶4096000,能够与不同基因型的RVA反应,同时不与常见的猪腹泻相关病毒反应,为未来猪RVA相关基础研究、临床血清学检测方法的开发奠定了基础。

2022—2023年我国部分地区猪A群轮状病毒分子流行病学调查分析

【目的】探究我国部分地区猪A群轮状病毒(RVA)的分子流行病学特征,明确当前的优势基因型,为RVA科学防控与疫苗研发提供理论依据。【方法】2022年1月—2023年3月收集江苏、江西、福建、山西和贵州5省36个规模化猪场送检的434份腹泻仔猪粪便样品,采用RT-PCR检测样品RVA阳性情况,对部分RVA阳性样品的VP7和VP4基因进行扩增及测序,与各型参考序列进行多序列比对,使用MegAlign进行核苷酸序列同源比对分析,并采用MEGA 7.0的邻接法构建系统发育进化树。【结果】RT-PCR检测结果显示,434份腹泻仔猪粪便样品中RVA阳性样品为196份,阳性检出率为45.16%。2022年与2023年初的阳性检出率分别为40.37%(132/327)和59.81%(64/107)。根据样品来源地区,RVA阳性检出率最高的是江苏(57.70%),其次是江西(55.71%),福建、贵州和山西的RVA阳性检出率分别是35.66%、30.00%和22.23%。共获得各地区12株RVA的VP4和VP7基因序列信息,遗传进化分析结果表明,G型中G9为优势基因型(占83.4%),G4和G5分别占8.3%;而P型中P7为优势基因型(占75.0%),其次为P13和P23,分别占16.7%和8.3%;12株RVA分属4种基因型组合,分别为G9P[7](占75.0%)、G5P[13](占8.3%)、G9P[13](占8.3%)和G4P[23](占8.3%)。【结论】我国部分省份猪场RVA阳性检出率持续升高,猪群中RVA基因型复杂多样,优势基因型组合为G9P[7]。因此,今后有必要对猪群中RVA的流行情况进行持续监测,结合基因型致病性制定预防措施并开发针对性疫苗。

猪A群轮状病毒的分离与鉴定

目前国内对猪轮状病毒的研究较少,作者旨在对猪A群轮状病毒进行分离与鉴定,为后续猪轮状病毒致病机理和分子生物学特性研究奠定基础。用胰蛋白酶处理RT-PCR检测猪A群轮状病毒病原阳性的临床腹泻粪样,然后接种长成单层的MA-104细胞,进行病毒分离传代。再对分离毒株进行常规RT-PCR鉴定和电镜观察,并对分离毒株的VP6、VP7和VP8基因进行测序及序列分析。结果成功分离猪A群轮状病毒TM-a株,经序列同源性分析发现,与TM-a株VP6、VP7和VP8基因同源性最高的毒株分别为中国北京人源LL3354株、印度人源RMC321株和日本野猪源GUB-71株,其相似性为96.0%、95.1%和97.0%。该TM-a株轮状病毒不同基因表现出与人源轮状病毒和猪源轮状病毒的高度同源性,推测猪A群轮状病毒可能在人畜间传播,发生基因重组现象。

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪A群轮状病毒多重PCR检测方法的建立

为了能够同时快速准确检测出猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Porcinetransmissible gastroenteritis virus,TGEV）及猪A群轮状病毒（Porcine rotavirus,RV）,试验通过设计引物、优化PCR条件构建了一个能同时检测出TGEV、PEDV及RV的多重PCR方法。结果表明：该方法能同时检测到TGEV、PEDV及RV,而对猪瘟病毒（CSFV）、猪呼吸与繁殖综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）、细小病毒（PPV）、日本乙型脑炎病毒（JEV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）等无扩增,TGEV、PEDV及RV的最低检测浓度为1×102拷贝/μL。说明试验设计的多重PCR方法不仅省时、省力,而且具有敏感性高、特异性强等优点。

华东地区猪A群轮状病毒的VP7和VP4基因序列分析

为了掌握华东地区猪轮状病毒(PRV)的流行情况,通过对华东地区猪轮状病毒流行病学的调查,分析临床猪轮状病毒对应的2个抗原序列VP7和VP4的基因型,进而丰富VP7和VP4基因库。采集2017-2018年华东地区包括江苏、浙江、上海、山东、安徽等省(市),部分猪场猪的粪便拭子共201份,PCR检测PRV阳性52份,阳性率25.9%。选择5个阳性样本进行VP7和VP4基因全长扩增并克隆测序,应用DNASTAR、MEGA5等生物学软件对其进行比对分析。结果显示:5个VP7核苷酸序列全长均为1 062 bp,5个VP4序列全长均为2 362 bp。VP7与2008年分离的G9型代表毒株NMTL的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为93.2%~95.2%和97.2%~97.5%。VP4与OSU毒株的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为98.5%~98.7%和99.3%~99.4%。表明这5株猪轮状病毒的基因型鉴定为G9P7。与参考毒株相比,VP7氨基酸第100、122、180、309位有突变,但无插入和缺失现象,VP4氨基酸在第30、137、686、774位有突变,但无插入和缺失。

2017-2019年四川地区猪A群轮状病毒的分子流行病学调查

【目的】通过对四川地区规模化猪场A群轮状病毒(RVA)的分子检测,从而了解RVA流行情况及分子特征,为猪RVA疫苗研制提供理论基础。【方法】2017—2019年从四川省14个地区40个猪场采集303份仔猪腹泻样本,用荧光定量RT-PCR方法调查RVA的分子流行率,用RT-PCR方法对RVA阳性样本进行分型和VP4和VP7全基因组的扩增,用Rota C2.0软件确定相应毒株的基因型,用MegAlign软件进行同源性分析,通过MEGA 7.0软件用邻近法构建系统进化树,用SimPlot和RDP4软件进行重组分析。【结果】303份仔猪腹泻样本检出RVA阳性样本98份,阳性率为32.34%(98/303,95%CI=27.1%—37.9%)。从98份RVA阳性样本中扩增出39个VP7片段,G9为优势基因型(41%),G4、G5、G26和G3各占23%、28.2%、5.1%和2.7%。扩增出的59个P型中以P[13]型为主,占40.7%,其次为P[6]、P[23]和P[1]型,分别占30.5%、23.7%和5.1%。30株毒株成功鉴定出G/P基因型,G9P[23](23.3%)为优势组合基因型。其他基因型为G4P[6](16.7%)、G9P[13](13.3%)、G5P[23](10%)、G5P[13](10%)、G9P[6](6.7%)、G26P[13](6.7%)、G4P[13](6.7%)、G4P[23](3.3%)和G3P[13](3.3%)。基因型G5P[23]、G4P[13]、G9P[6]、G26P[13]和G4P[23]为国内首次鉴定。此外,重组分析表明4株毒株在VP7或VP4基因上存在重组现象。【结论】四川地区腹泻仔猪粪便中RVA的流行率高且基因型复杂,优势组合基因型为G9P[23]。该结果丰富了四川地区RVA的流行病学资料,对四川地区猪RVA的防控提供了重要参考。

一步法多重RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒方法的建立和应用

根椐Gen Bank中登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(PARV)基因序列,分别设计3对引物,在建立各病毒单项一步法RT-PCR技术的基础上,优化多重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的一步法多重RT-PCR检测方法,用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV和PARV核酸模板进行多重RT-PCR扩增,结果可同时扩增PEDV的450 bp、TGEV的609 bp、PARV的241 bp特异性片段,而对其它4种病原的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该多重RT-PCR技术能检出10 pg的PEDV、10 pg的TGEV和1 pg的PARV模板。用67份临床病料对建立的多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的一步法多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。

贵州1株G9P[23]型猪A群轮状病毒的分离鉴定及基因组序列分析

为了解贵州省G9型猪轮状病毒(PoRV)流行毒株的基因组特征和遗传进化关系,本试验对送检腹泻仔猪的肠内容物和粪样进行病原检测,选取G9型PoRV阳性样品通过Vero细胞进行分离培养及病毒鉴定,并对分离毒株进行基因组遗传变异分析。结果显示,阳性样品经胰酶预处理后接种至Vero细胞,盲传至第15代出现稳定CPE,前期细胞变圆后固缩、脱落,后期胞浆界限不清,出现拉网现象,用特异性引物对细胞培养物进行RT-PCR鉴定,成功扩增341 bp的目的条带。细胞培养物的间接免疫荧光鉴定显示有特异性绿色荧光反应,电镜观察下可见晶格状排列的无囊膜病毒粒子,大小约70 nm,表明成功分离到1株PoRV,将之命名为GZZY2021。病毒增殖曲线结果显示,用GZZY2021株感染细胞后,0~12 h病毒含量最低,12~30 h病毒增殖速度最快,30~48 h病毒增殖速度较平缓,48 h病毒滴度达到峰值(10-5.60/0.1 mL),而后进入稳定期。全基因组克隆测序分析结果显示,GZZY2021分离株基因组全长为18 506 bp, 11个基因最相似序列同源性均>95.00%,VP1、VP2、VP4、VP7、NSP1、NSP3、NSP4基因与猪源毒株同源性最高,VP3基因与大熊猫源毒株相似性最高,VP6、NSP2、NSP5基因与人源毒株同源性最高,提示分离株为三元重配毒株,完整的基因型为G9-P[23]-I1-R1-C1-M1-A8-N1-T1-E1-H1。VP4、VP7基因与同型参考毒株相比,分别发生5、3处独有氨基酸位点变异;与NX疫苗株的中和表位分别存在22、4处氨基酸位点差异。重组分析结果显示,GZAS2020株的NSP5基因是以PTR(FJ422141.1)为主要亲本毒株,A411(EF990694.1)为次要亲本毒株重组产生的毒株,重组断点位于121和321 bp。综上所述,本研究应用Vero细胞成功分离到1株G9P[23]型基因重配PoRV,不但可对持续监测贵州省PoRV的流行动态趋势提供研究数据,而且对筛选该领域的候选疫苗株以及该病的深入研究打下基础。

猪轮状病毒G9P[7]型云南株的分离鉴定及VP4和VP7基因测序分析

为确定云南省某猪场仔猪腹泻的病原,对送检腹泻病仔猪小肠组织样品进行猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)RT-PCR检测,将PoRV检测阳性样品处理后接种至MA-104细胞进行PoRV分离;对分离毒株进行间接免疫荧光、电镜观察、胶体金检测和VP4、VP6、VP7基因测序及遗传进化分析。结果显示,仔猪肠道组织样品经终浓度20μg/mL的胰酶在37℃孵育2 h,能在MA-104细胞上增殖传代,第3代出现稳定的细胞病变,盲传20代,每隔5代进行PoRV的检测;间接免疫荧光试验可见特异性荧光,胶体金和RT-PCR检测均为PoRV阳性,电镜观察可见病毒粒子直径约为65 nm,呈车轮状,符合PoRV粒子典型形态特征,将该分离株命名为PoRV YN-A株。基因同源性比较和遗传进化树分析显示,YN-A株的VP6基因序列与国内A群GD株的同源性为99.93%,VP7与中国G9型NJ2012株的同源性为99.12%,VP4与美国P[7]型OSU株的同源性为98.91%,确定该分离株为猪A群轮状病毒G9P[7]型。YN-A株VP7序列在9个氨基酸位点存在点突变,即aa9(I→V)、aa16(V/T→I)、aa44(A→V)、aa100(D/E→N)、aa212(T/A→K)、aa221(N→S)、aa225(V→A)、aa271(I→V)、aa267(D→E)。首次从云南地区的腹泻仔猪小肠组织中成功分离到1株G9P[7]型的新基因型PoRV毒株,为PoRV的致病性、分子生物学特性研究及PoRV G9优势基因型新疫苗研发奠定了基础。

猪A群轮状病毒和C群轮状病毒以及猪星状病毒多重RT-PCR同时检测方法的建立及应用

为建立同时快速检测猪A群轮状病毒(GARV)、猪C群轮状病毒(GCRV)和猪星状病毒(AstV)的三重RT-PCR检测方法,根据GenBank中公布的序列进行病毒基因区同源性分析,然后使用Primer Premier 5.0软件分别设计了GARV、GCRV的VP6基因和AstV的ORF2基因特异性引物,预期扩增片段的大小分别为229、166和410bp。在这3种病毒单项RT-PCR技术的基础上,建立了GARV、GCRV和AstV的多重RT-PCR检测方法,并用该方法检测30份四川省仔猪腹泻粪样。结果显示,GARV、GCRV、AstV的阳性检出率分别为26.7%、13.3%、16.7%,本方法与这3种病毒的单项RT-PCR检测结果的符合率分别为100%、100%、83%,整体符合率达94.3%,特异性为100%。结果表明,本试验建立的多重RTPCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可用于GARV、GCRV和AstV的同时检测。

猪A群轮状病毒一步法RT-PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种快速检测猪A群轮状病毒的检测方法,基于猪A群轮状病毒NSP4基因序列利用Premier 5.0软件设计并合成了一对特异性引物,建立了猪A群轮状病毒一步法RT-PCR检测方法,通过反复试验确定了引物的最佳退火温度为56℃,通过灵敏性试验确定了最低的检测浓度为13.17 pg/μL,通过特异性与稳定性试验表明该方法具有良好的特异性与稳定性,同时应用该方法对临床病料进行了检测,并选取扩增阳性样品进行了序列测定与分析,样品阳性率为90%(27/30),与Gen Bank中其他猪A群轮状病毒NSP4基因序列同源性均在98%以上。结果表明:该方法具有良好的灵敏性、特异性与稳定性,可以为猪A群轮状病毒病的快速检测和流行病学调查提供有效的技术手段。

广西猪A群轮状病毒G9P[7]型的分离与初步鉴定

猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)感染仔猪可引起腹泻、脱水甚至死亡,是引起仔猪腹泻的常见病原,给养猪业造成巨大的经济损失。本研究为确定导致广西贵港某猪场仔猪腹泻的病原,采集腹泻仔猪的肠内容物,采用PCR方法检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)以及PoRV病原,结果显示,仅PoRV为阳性,将其接种至Marc-145细胞,盲传4代后,可产生细胞皱缩、脱落等明显细胞病变。稳定盲传20代,每隔5代进行PoRV的检测,选取第10代的病毒上清液进行VP4、VP6和VP7基因测序及遗传进化分析,确定该分离株为G9 P[7]型。电镜观察,可见到大小约为70 nm的轮状病毒粒子,符合轮状病毒特征,进一步鉴定分离株为PoRV。结果表明,PoRV的分离鉴定为其分子生物学特性研究以及该病的有效防控奠定了基础,也为疫苗的研发提供参考。

猪A群轮状病毒LN-01-2013株的分离与鉴定

将病料与等体积2.5g/L胰酶溶液混合均匀,于37℃恒温培养箱中孵育1h,分别接种于MA-104、Marc-145、ST细胞系以分离病毒并筛选该毒株最适细胞系。通过RT-PCR以及重组质粒构建对其进行分子生物学鉴定以及遗传进化分析。结果显示,成功分离出猪A群轮状病毒LN-01-2013株,MA-104细胞系为其最适细胞系。LN-01-2013株的VP4基因型与P[7]基因型同源性最高,VP7基因型与G[9]基因型同源性最高。根据A群轮状病毒最新分类方法,LN-01-2013分离株属于P[7]G[9]型。

2015～2016年我国东北三省地区猪A、B、C群轮状病毒流行情况调查

为了解我国东北三省地区(黑龙江省、辽宁省、吉林省)规模化猪场新生仔猪的猪A群轮状病毒(GARV)、猪B群轮状病毒(GBRV)和猪C群轮状病毒(GCRV)的流行情况。利用巢式PCR方法对2015年1月至2016年10月从我国东北三省地区多个规模化猪场采集的108份仔猪腹泻病料和15份健康仔猪粪便样品进行分析。结果显示:黑龙江省GARV阳性率为47.4%,GBRV未检出,GCRV阳性率为5.3%;辽宁省GARV阳性率为51.5%,GBRV阳性率为3.03%,GCRV阳性率为6.1%;吉林省GARV的阳性率为21.1%,GBRV阳性率为7.1%,GCRV阳性率7.1%;并且存在GARV/GCRV混合感染的情况,因此,我国东北三省地区猪轮状病毒病的主要病原是GARV,但GBRV和GCRV也是幼龄猪群潜在的重要致病风险。为我国猪轮状病毒病的提前预防和综合防控提供流行病学参考数据。

A群猪轮状病毒VP6结构蛋白在杆状病毒系统中的表达及鉴定

为在杆状病毒表达系统中表达和纯化A群猪轮状病毒(PoRVA)VP6结构蛋白,在PoRVA VP6基因5'端融合添加组氨酸标签(6×His)后,克隆至杆状病毒表达载体pFastBac HTB中,得到重组转移载体pFastBac-VP6,并将其转化至DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将鉴定正确的重组杆状病毒杆粒转染Sf9细胞后收获重组杆状病毒rBac-PoRVA-VP6,经SDS-PAGE和western blot鉴定结果显示,表达的PoRVA重组VP6蛋白约45 ku,并且能够被PoRVA阳性血清识别。上述结果表明,经杆状病毒表达系统表达的重组VP6蛋白具有良好的反应原性,为建立PoRVA抗体检测技术奠定了基础。

A群猪轮状病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

试验旨在制备A群G11血清型猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)VP7蛋白的单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性。将A群G11血清型PoRVVP7基因克隆至pGEX-6P-1载体,然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,IPTG诱导表达GST-VP7融合蛋白。分离纯化融合蛋白GST-VP7并免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,利用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞并进行有限稀释法克隆化筛选。经3次筛选,最终得到1株能与GST-VP7蛋白反应的特异性、稳定分泌抗体的阳性细胞克隆。Western blotting鉴定结果显示该单克隆抗体具有良好的免疫原性及特异性;MTT法中和试验结果显示其具有中和活性;分泌的单克隆抗体亚型为IgG2b。本试验结果表明A群PoRV VP7蛋白在大肠杆菌中成功表达且制备了单克隆抗体,可用于PoRV VP7蛋白结构和功能的研究,也为猪轮状病毒病的预防、诊断和治疗等研究奠定基础。

重组G3P[13]型A群猪轮状病毒全基因组测序分析

为了解引发四川某猪场腹泻疫情的猪轮状病毒(PoRV)基因组特征和遗传变异规律,采用RT-PCR分别扩增PoRV 11个基因节段,并克隆测序,通过生物信息学分析软件研究病毒基因组特征、变异性及遗传进化规律。结果显示,SCMY-1株基因合型为G3-P[13]-I5-R1-C1-M1-A8-N1-T1-E1-H1,即G3P[13]型毒株。该毒株VP2、NSP2和NSP4基因与人源毒株同源性最高,分别与3株人源轮状病毒RVA/Human-wt/LKA/R1207/2009株、RVA/Human-wt/ZAF/UFS-NGS-MRC-DPRU2291/2009和RVA/Human/CU331-NR/08株单独聚为一小支,推测这可能增加SCMY-1株跨种传播到人的风险。此外,SCMY-1株VP4基因与美国3个猪源毒株同处一个小分支;VP7基因与RVA/Pig/China/LNCY/2016株遗传进化距离最近。上述结果提示,PoRV可能在国际和国内生猪贸易过程中被广泛传播。与NCBI上已登录毒株相比,SCMY-1株VP4、VP7蛋白氨基酸分别存在13个和2个独有氨基酸位点的突变,可能对VP4和VP7两个主要抗原毒力及抗原性产生影响。重组分析显示,SCMY-1株VP3基因由两个猪源亲本株重组而来,推测这可能增强病毒毒力和宿主适应性。研究结果丰富了PoRV基因组学和分子流行病学相关研究资料,为PoRV预防控制提供理论参考,也为深入研究PoRV跨物种传播的分子基础提供科学依据。

四川省稻城县3个藏香猪猪场腹泻样本4种病毒的检测

为了调查稻城县规模化藏香猪猪场仔猪腹泻的原因,采集了3个暴发仔猪腹泻的猪场共50份样本,采用RT-PCR方法检测4种病毒的感染情况。结果显示,50份样本中猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪δ冠状病毒、传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒4种病毒的检出率分别为60%、0、0、0,猪流行性腹泻病毒在3个猪场的阳性率为64%、50%、60%。试验结果表明,PEDV是引起3个猪场腹泻的主要原因,为稻城县仔猪腹泻的防控提供参考。

PEDV、PoRVA和PDCoV TaqMan三重RT-qPCR检测方法的建立与初步应用

旨在建立一种可快速同时检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪A群轮状病毒(porcine rotavirus type A, PoRVA)和猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)三重荧光定量PCR方法。针对PEDV-N、PoRVA-VP6和PDCoV-M基因设计了引物和探针,条件优化后进行性能评估,并与商品化试剂盒检测对比。结果显示:本研究建立的三重RT-qPCR方法具有良好特异性,对PRRSV、PCV_2和PRV等阳性核酸不发生扩增;具有较高的敏感性,PEDV、PoRVA和PDCoV的最低检测限均达1 copies·μL^(-1);重复性良好,组内和组间变异系数均小于1%;样本适应性广,检测不同样本类型时,变异系数均小于1%。与商品化试剂盒对比,本研究建立的方法PEDV和PoRVA的检测符合率为92.5%和97.5%,并对PDCoV的检测范围更广,对其变异毒株仍有较好的检测效果。本研究建立的检测方法具有特异性好、敏感性高、稳定性强和样本适应性广等优势,为临床腹泻样本提供了一种好的检测方法。