猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法的建立

猪Linda病毒能引起仔猪先天性震颤,严重危害养猪业的发展,目前在我国暂未发现感染病例。本研究根据猪Linda病毒Core-E~(ms)基因序列,设计并合成巢式RT-PCR引物,通过对退火温度、引物浓度等进行优化,建立了猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法。结果显示,该方法具有良好的特异性,与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性好,对慢病毒阳性对照品的最低检出限为10~1 copies/μL,比普通RT-PCR灵敏10倍。使用该方法检测模拟病毒样品,发现最低检出限为10~1 TU/mL,与荧光定量RT-PCR方法一致。本研究首次建立了可检测猪Linda病毒的巢式RT-PCR方法,其特异性强、灵敏度高,为在口岸以及条件有限的场地对猪Linda病毒进行精准且快速的检测提供了有效技术手段,也为防范Linda病毒传入提供了有力技术支撑。

猪Linda病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪Linda病毒(LV)的实时荧光定量PCR检测方法,本研究基于LV的Erns基因序列,设计并合成了实时荧光定量PCR引物和探针,经过优化退火温度、引物和探针的比例,建立了一种灵敏度高、特异性好且操作简便的LV实时荧光定量PCR检测方法。该方法具有良好的线性、稳定性及准确性,最低检出限为1×10^(1)copies/μL,批内和批间变异系数均小于2%,且该方法检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型时呈阴性。通过对不同模拟样品的检测结果进行比较分析,发现该方法能够检测到1×10^(1)copies/μL模拟DNA样品、1×10^(1)TU/mL模拟RNA样品。本研究建立的实时荧光定量PCR方法可用于LV的快速检测,为口岸检测、预防与控制由LV引起的进境仔猪先天性震颤提供了技术支持。