帕金森病猴模型的神经生化学研究

应用HPLC-EC法和SPECT在体显像检测由MPTP制备的双侧和偏侧帕金森病猴模型的神经递质含量和DA受体活性。结果发现:(1)6只双侧和4只偏侧帕金森病猴模型的尾状核、壳核和黑质DA及其代谢产物显著降低,DOPAC/DA和HVA/DA比值明显增高;(2)2只偏侧帕金森病猴模型病变侧的D_2 DA受体活性在症状初期无改变,症状明显时发生超敏。研究表明,帕金森病猴模型的神经递质含量变化和DA受体活性改变符合帕金森病患者的神经生化学改变。

急性SIVmac感染猴模型评价中药1号体内抗病毒效果

采用ＳＩＶｍａｃ感染剂量（１～１０ＭＩＤ５０）和先给药后感染方式，中药Ⅰ号能１００％保护动物不发生活动性ＳＩＶ感染，表现在感染治疗后从血浆分离病毒阴性，无可检出的抗体，ＰＣＲ检测ＰＢＭＣＳＩＶｍａｃＤＮＡ阴性，但巢式—ＰＣＲ检测２／３猴阳性。对照组３／４猴建立了真正感染，病毒分离阳性，抗体上升。中ＳＩＶｍａｃ感染剂量（１０～１００ＭＩＤ５０和先感染后给药方式，中药Ⅰ号未能抑制感染后２周的血浆病毒水平，但与对照组比较明显降低感染２周后的血浆病毒水平。表明中药Ⅰ号有抗猴体内病毒的作用。本模型亦可应用于中药方剂猴体内抗病毒的效果评价。

帕金森病猴模型红细胞内钙镁离子含量的测定及意义

目的：研究帕金森病猴模型红细胞内钙、镁离子浓度的改变与病情严重程度间的相互联系。方法：采用逐日肌注MPTP法(0．1mg/kg/d)制造帕金森病猴模型，运用行为学评分量表进行评分，对病情严重程度进行量化，并划分病期。抽取不同病期的血样，用火焰原子吸收光谱法检测红细胞内的钙镁离子含量。结果：红细胞内钙离子含量在亚临床期即表现为明显的增高(P＜0．05)。临床早中晚期与正常对照相比有极显著的增高(分别为P＜0．01，P＜0．01和P＜0．001)。而红细胞内镁离子含量在亚临床期及临床早期明显低于对照(均为P＜0．05)，临床中晚期与对照相比有极显著的降低(均为P＜0．01)。结论：帕金森病猴模型红细胞内钙、镁离子浓度随着病情的发展呈现规律性的改变。

人柯萨奇B2病毒感染恒河猴模型的初步研究

目的通过对人柯萨奇B2病毒经口腔感染恒河猴婴猴的感染特征进行初步分析研究,为人柯萨奇B2病毒恒河猴感染模型的建立提供实验方法及技术支持,为后续开展其感染机制、病理生理等研究奠定基础。方法将柯萨奇B2病毒经口腔感染方式感染3~4月龄的恒河猴婴猴,观察记录恒河猴临床症、体温;采集血液检测生理生化指标;血样和疱疹检测病毒;疱疹组织进行病理检测。结果恒河猴感染后2~5 d出现手、足、口疱疹;动物出现精神沉郁、活动及饮食量减少的情况;体温呈现稽留热曲线图;疱疹液和血样中都可检测到柯萨奇B2病毒;血常规检测出现白细胞减少、单核细胞增加、淋巴细胞数量减少、粒细胞数量增加、嗜酸性细胞增加、嗜碱性细胞减少的情况。血液生化检测发现肝功、肾功、心肌酶都发生了不同程度的升高;疱疹组织病理学显示恒河猴疱疹呈鳞状上皮增厚,表面角化过度,局部坏死伴炎细胞浸润,脓肿形成。结论人柯萨奇B2病毒感染婴猴后出现一系列较为特征的手足口疱疹、临床症状、生理生化、病毒血症等情况,表明经口腔感染方式恒河猴婴猴可以成功构建柯萨奇B2病毒感染的动物模型,建立的相关检测方法和技术是可行的,为后续建立开展恒河猴柯萨奇B2病毒感染模型、发病机制研究、药物及疫苗的评价奠定了实验基础。

用mRNA差异显示法寻找帕金森病猴模型的相关基因

本研究采用mRNA差异显示方法，比较了在1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的恒河猴单侧帕金森病模型中，双侧黑质细胞在基因表达上的不同。具体方法为制成恒河猴单侧帕金森病模型，1周后处死动物，分别取两侧黑质组织，提取总RNA。用三种锚定引物Oligo（dT）A、Oligo（dT）G、Oligo（dT）C将mRNA逆转录成为cDNA。使用试剂盒提供的部分随机引物（AP1～8，AP34）与上述几种锚定引物组合，以逆转录得到的cDNA为模板，分别进行PCR。把对照与病变侧组织相应的PCR产物在7％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，经过银染，显示出差异条带。回收差异条带中的DNA并以之为模板再次进行PCR扩增，将所得片段在HindⅢ位点插入pGEM－3Zf（＋）质粒进行克隆。在所发现的数条差异条带中，初步筛选出一个长度约为310bP的DNA片段。分析此结果表明此片段具有一定特异性。

MPTP建立帕金森病猴模型的研究进展

帕金森病(parkinson’s disease,PD)是以静止性震颤、肌强直和运动徐缓为主要临床表现的神经退行性病变,当今医学只能延缓其进展而不能治愈。成功复制出与人类发病机理相似的PD实验动物模型是解决这一难题的关键环节。非人灵长类动物生理、生化机制与人类极其类似,且利用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导PD模型在医学研究中的应用越来越广泛。笔者就近些年应用MPTP制作PD猴模型方面的研究进展作一综述。

应用PeriCam PSI血流灌注散斑成像仪对食蟹猴模型舌象的初探研究

目的探索运用PeriCam PSI血流灌注散斑成像仪检测食蟹猴模型舌部血液灌注量的方法并分析其可行性及应用价值。方法(1)5只雌性食蟹猴行宫颈环扎术,制备食蟹猴子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)疾病模型,1只雌性食蟹猴开腹仅观察盆腔情况。(2)分别于术前、手术当月及术后1、2、3个月运用PeriCam PSI血流灌注散斑成像仪测量所有食蟹猴舌面、舌底血液灌注量,采用与之配套的PIMSoft软件进行数据采集与分析。结果(1)成功检测6只食蟹猴在不同时间段的舌部血液灌注量,宫颈环扎组食蟹猴术后的血液灌注量均呈现显著上升或下降,差异有统计学意义。(2)术后2月轻-中度盆腔粘连的食蟹猴舌面及舌底的血液灌注量均显著高于无粘连组,差异有统计学意义。结论运用PeriCam PSI血流灌注散斑成像仪测量食蟹猴舌部血液灌注量的方法稳定可行,可能成为疾病病证结合模型舌象的量化评价方法。

SARS-CoV恒河猴模型动物中组织病理学动态变化

目的在感染的8只恒河猴的SARS-CoV模型动物中,观察肺等组织中出现的系列病理学改变,为针对抗SARS药物筛选、疫苗评价中的免疫病理反应等奠定实验依据。方法SARS-CoV经鼻腔接种8只恒河猴,在感染的第5、7、10、15、20、30和60天,分别安乐处死动物,组织病理取材,制片,观察。结果经病毒分离和RT-PCR证实动物感染是成功的。系列病理改变表明,早期肺组织可见间质性肺炎,水肿、结构破坏、出血,巨噬细胞浸润;后期出现内皮细胞受损及再生,透明膜形成,小血管玻璃样变,肺组织纤维化及肺气肿形成,肺泡网状纤维和弹力纤维破坏并增生等,脾脏、淋巴结生发中心早期有萎缩,后期有恢复等病理学改变均和SARS患者相似。结论感染恒河猴出现与SARS患者类似的临床和病理学改变,为进一步研究该病毒的病原特性、发病机理、药物筛选、疫苗评价等方面的研究奠定了重要基础。

偏侧帕金森病猴模型的影像学对比研究

目的 探讨实验性帕金森病 (Parkinsondisease ,PD)的影像学表现及比较不同影像学检查对诊断PD的价值。方法 经一侧颈内动脉注射 1 甲基 4 苯基 1,2 ,3 ,6 四氢吡啶 (MPTP) ,制作8只偏侧PD猴模型 ,均于术前及术后行CT、MRI和单光子发射计算机体层摄影术 (包括多巴胺转运蛋白显像及局部脑血流显像 )。 1只猴于术前、3只猴术后行正电子发射计算机体层摄影术 (葡萄糖代谢显像 )检查。结果 所有动物均成功制成偏侧PD模型。多巴胺转运蛋白显像见术侧纹状体放射性核素摄取较术前明显减低、亦明显低于对侧。葡萄糖代谢显像见PD组术侧纹状体、丘脑平均标准摄取值低于对侧及健康猴 ,而对侧较健康猴无明显减低。局部脑血流显像显示偏侧PD猴无局部脑血流灌注异常。MRI上正常老年猴基底节区可无异常信号 ,也可见苍白球呈双侧对称性窄条状低信号 ,但无壳核低信号。术后第 3个月PD猴壳核及苍白球新出现低信号或苍白球原窄条状低信号区扩大。术前、术后MRI均未见黑质区信号异常及脑萎缩征象。CT未见异常。结论 多巴胺转运蛋白显像及葡萄糖代谢显像均能早期显示实验性PD纹状体多巴胺转运蛋白下调或纹状体与丘脑葡萄糖代谢减低。MRI能发现PD基底节区信号减低 ,但相对较晚。

帕金森病模型猴^(11)C-Raclopride多巴胺D_2受体PET脑显像

目的探讨亚临床期和临床期帕金森病(PD)脑多巴胺D2受体(D2R)功能变化特征。方法建立亚临床期和临床期PD猴模型,合成多巴胺D2RPET显像剂11CRaclopride。对4只健康猴、4只亚临床期和2只临床期PD模型猴分别进行11CRacloprideD2RPET脑显像。利用感兴趣区(ROI)技术半定量分析纹状体D2R功能。结果健康猴11CRaclopridePET脑显像放射性浓聚于双侧纹状体,左右对称,双侧纹状体小脑放射性比值无明显差异(5.06±0.79,5.03±0.78,t=0.704,P>0.05)。亚临床期PD猴11CRaclopridePET脑显像双侧纹状体小脑放射性比值无明显差异(5.03±0.83,4.98±0.77,t=0.926,P>0.05)。与健康猴比较,纹状体小脑放射性比值差异无显著性(5.00±0.74,5.04±0.72,t=1.016,P>0.05)。临床期PD猴11CRaclopridePET脑显像双侧纹状体放射性分布不对称,2只临床期PD猴右侧比左侧纹状体小脑放射性比值分别增高19.69%和22.68%。毁损侧(右侧)纹状体D2R功能发生上调。结论PD亚临床期脑内纹状体D2R功能无明显变化,临床期毁损侧D2R功能出现上调。

慢性帕金森病MPTP猴模型纹状体区质子磁共振波谱的动态研究

目的观察慢性帕金森病(PD)1甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶(MPTP)猴模型纹状体区质子磁共振波谱(1H MRS)的动态变化,探讨1H MRS在PD早期诊断研究中的价值。方法4只健康成年雄性猕猴,以MPTP(皮下注射,0.1mg·kg1·d1)制备慢性PD全身模型,造模前及其后6周内每周应用GESigna1.5T超导型NV/i磁共振扫描系统,行双侧纹状体区1H MRS采集,观察氮乙酰天门冬氨酸(NAA)、胆碱化合物(Cho)和肌酸及磷酸肌酸(Cr),采用随机软件FuncTool4.0对各代谢物含量行半定量分析,计算NAA/Cr和Cho/Cr的变化,并与行为学评分、MPTP累积剂量进行相关分析。结果4只猴经MPTP处理后均达到PD诊断标准,平均出现症状时间为(18.3±1.3)d,行为学评分稳定时间为(26.3±1.3)d,MPTP的累积用量为(17.78±0.27)mg。相同时间点双侧纹状体区NAA/Cr和Cho/Cr比较差异无统计学意义(P>0.05);使用MPTP后第1周至行为学评分稳定期间,NAA/Cr呈进行性下降,Cho/Cr呈进行性升高,行为学评分稳定后NAA/Cr和Cho/Cr趋于稳定;MPTP处理后第3周NAA/Cr和Cho/Cr与正常组比较差异有统计学意义(t=3.59,P<0.05;t=4.77,P<0.05);MPTP累计剂量与NAA/Cr的变化呈显著负相关(r=-0.970,P<0.05);与Cho/Cr的变化呈显著正相关(r=0.924,P<0.05)。结论1H MRS能够早期发现慢性PDMPTP猴模型纹状体?

中药1号治疗SIVmac感染猴和艾滋病模型猴的观察

中药１号治疗ＳＩＶｍａｃ感染猴２只，给药６周。结果：治疗组病毒血症在感染后４周消失，对照组病毒血症持续至１４周。淋巴结病理组织学显示，治疗组淋巴结滤泡数量较多，淋巴组织修复较好，结构基本保持原来状态。对照组淋巴结滤泡数量减少，并有滤泡耗竭现象。中药１号治疗模型猴２只，给药８周。结果：病毒学检查治疗和不治疗的猴无差异。淋巴结病理组织学表明，治疗猴淋巴结的结构和滤泡有明显修复现象。对照猴淋巴滤泡大量减少，出现滤泡耗竭和纤维化现象，并死亡１只。

食蟹猴局灶性脑缺血模型中脑组织蛋白质组学鉴定分析研究

目的探讨食蟹猴局灶性脑缺血模型中梗死区、半影边缘区及正常组织之间蛋白质组学的差异。方法成功建立灵长类动物食蟹猴脑缺血模型4 h后,提取正常区、半影区及梗死区组织,采用强型阳离子交换法在蛋白水平进行分级,随后使用纳升级超高效液相色谱串联沃特式高分辨质谱进行数据采集。后期数据经过去冗余化和分类,并进行代谢通路分析。结果在缺血组织、半影区组织、正常组织中分别鉴定得到178、133、282个非冗余蛋白。通过KEGG通路分析,在3个区域中差异性表达的蛋白质参与最多的通路包括代谢通路、免疫反应通路和转录调节通路。参与物质代谢的蛋白在3个区域中的表达个数有明显的不同。梗死组织表达了更多种类的免疫相关蛋白,而在半影区组织中则表达了更多的转录调节因子。结论与梗死区相比,边缘区的组织损伤可逆,是使用药物治疗脑缺血的重点。脑缺血4 h后,正常组织、半影区、梗死区组织的蛋白质表达以及蛋白参与的代谢通路均具有明显差异。其结果为解释脑缺血病理机制提供了信息,为疾病治疗药物的开发提供了靶标分子。

猴免疫缺陷病毒(SIV)在艾滋病模型恒河猴组织中的分布和载量测定

目的研究当艾滋病恒河猴模型的血浆病毒载量处于低水平或阴性时,猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency viruses,SIV）在宿主组织中的分布情况。方法SIVmac251感染恒河猴10只,定期检测其血浆载量,感染病毒平均高峰时间第14天时,活检取淋巴结。选取感染18个月后病毒载量最低水平和阴性的2只艾滋病猴（SAIDS）,经安死术后取淋巴结、脾、肝、肺、肾、脑等组织,用原位杂交和实时荧光定量PCR的方法检测病毒在组织中的分布和组织中的病毒载量。结果感染后14d,10只猴血浆病毒载量达到10^7copies/mL,淋巴结组织病毒载量为10^5-10^8copies/g,原位杂交方法在腹股沟淋巴结中检测到强阳性斑点。感染后第18个月的2只猴,血浆病毒载量下降并维持不高于10^2copies/mL水平或阴性,但组织分布不尽相同,在肠系膜淋巴结、肾上腺、海马回、空肠、脾脏等组织中检测到10^5-10^6copies/g的病毒载量,于一只猴的脑积液中检测到10^3copies/mL的病毒载量。用原位杂交的方法在肠系膜淋巴结和空肠中检测到强阳性斑点,其它组织中未检测到阳性斑点。结论实验证实SAIDS猴在血浆病毒载量低甚至阴性时,病毒在不同组织中仍有分布,有些组织中甚至出现高病毒载量,提示在制备SIV/SAIDS模型中,尤其在药物筛选和疫苗评价时,应考虑组织病毒载量指标的测定和药物、疫苗对组织病毒的治疗清除作用的评价。

少阳主骨方对食蟹猴自然退变膝关节骨性关节炎模型p16/Rb信号通路的影响

目的根据中医"少阳主骨"理论,研究少阳主骨方延缓关节软骨细胞衰老和退变的作用机制。方法通过X线选取13只膝关节退变的老年食蟹猴作为动物模型,随机选取1只进行病理学观察,其余食蟹猴随机分为少阳主骨方组、氨糖美辛组、生理盐水组,每组4只,连续灌胃8周后处死所有食蟹猴,对关节软骨进行病理学观察,RT-q PCR、Western-blot检测关节软骨中p16、Rb基因与蛋白的表达。结果老年食蟹猴KOA模型关节软骨病理改变符合KOA病理变化特点,三组食蟹猴Mankin评分少阳主骨方组(7.5±0.53)分、氨糖美辛组(7.75±0.71)分、生理盐水组(8.25±0.46)分,少阳主骨方组与生理盐水组间具有统计学差异(P<0.05);p16基因与蛋白的表达少阳主骨方组<氨糖美辛组<生理盐水组,具有统计学差异(P<0.05);Rb基因与蛋白的表达少阳主骨方组>氨糖美辛组>生理盐水组,具有统计学差异(P<0.05)。结论少阳主骨方可以通过p16/Rb途径延缓关节软骨细胞衰老,从而延缓关节软骨退变。

ELISPOT方法检测SIVmac239感染猴特异性细胞免疫水平

目的为了完善现有的SIV/恒河猴模型,掌握恒河猴被SIV感染后体内细胞免疫应答状态,为评价HIV疫苗提供方法和数据上的参考,我们测定了SIV感染猴体内病毒特异性的细胞免疫水平。方法实验前选出4只无SIV、STLV、SRV/D和B病毒感染的恒河猴,用SIVmac239病毒液静脉感染实验猴,使用RT-PCR、流氏细胞术和ELISPOT等方法,监测SIVmac239病毒在恒河猴体内复制情况、感染猴的外周免疫损伤情况和细胞免疫情况,持续测定一年。结果实验结果显示IFN-γELISPOT方法能有效的评估实验猴的细胞免疫情况,IFN-γELISPOT结果和CD4+T细胞数无相关性,与血浆病毒载量稍有相关。结论本实验明确了SIVmac239感染中国恒河猴体内CTL的基本趋势和范围,了解了外周血病毒载量、外周免疫损伤与细胞免疫状况之间的联系,完善了SIV/SAIDS模型评价指标,为使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了基础条件。

灵长类动物子宫内膜异位症病证结合模型构建初探

目的 探索食蟹猴子宫内膜异位症(简称内异症)病证结合模型构建的方法。方法 (1)6只雌性食蟹猴随机分为实验组5只、对照组1只,实验组开腹行宫颈环扎术,对照组仅开腹。(2)于术前、术中及术后第1、2、3个月运用PSI测量猴舌血液灌注量。(3)术后3个月腹腔镜探查,因均未见内异症病灶,改进建模方法:将猴分为实验组4只、对照组2只,实验组月经期收集子宫内膜组织盆腔内注射,连续使用3个月免疫抑制剂,对照组不作处理。结果 (1)宫颈环扎后3个月后腹腔镜探查,两组均未见内异症病灶。(2)猴子术后2月舌部血液灌注量明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)每只猴的舌面及舌底血液灌注量变化趋势一致。(4)改进建模方案后3个月腹腔镜探查示,实验组重度盆腔粘连、子宫表面血管增生并充血明显,一只猴可见内异症病灶,对照组则无。结论 收集子宫内膜盆腔内注射、加用免疫抑制剂可以构建食蟹猴内异症模型。运用PSI测量猴舌部血液灌注量的方法稳定可行,有望成为疾病病证结合模型舌象的量化评价方法。

去卵巢食蟹猴眼表状态的动态观察

目的探讨去卵巢食蟹猴作为绝经期干眼研究动物模型的可行性。方法选择4～6岁健康成年雌性食蟹猴6只，采用随机数字表法将食蟹猴分为卵巢摘除组和假手术组，每组各3只。卵巢摘除组食蟹猴手术摘除双侧卵巢，假手术组以相同的手术方式进行操作但不摘除卵巢。分别于术前及术后1、3、6个月收集各组食蟹猴下肢静脉血各3 ml，采用放射免疫法检测猴血清雌二醇和睾酮质量浓度。分别于上述时间点采用泪液渗透压仪5600检测各组食蟹猴泪液渗透压，并进行干眼相关检查，包括基础泪液分泌试验（SⅠt）、角膜荧光素染色及结膜印迹细胞学检查。结果卵巢摘除组食蟹猴手术前后血清雌二醇、睾酮质量浓度均低于假手术组，但各组间差异均无统计学意义（F分组＝5.16，P＝0.09；F分组＝1.46，P＝0.29）；卵巢摘除组和假手术组食蟹猴组间泪液渗透压的比较，差异无统计学意义（F分组＝0.83，P＝0.37），卵巢摘除组食蟹猴术后3个月泪液渗透压较术后1个月明显升高，差异有统计学意义（t＝5.12，P〈0.05）；卵巢摘除组与假手术组食蟹猴SⅠt检测值比较，差异无统计学意义（F分组＝0.06，P＝0.82），卵巢摘除组食蟹猴术后3个月SⅠt检测值较术后1个月明显降低，差异有统计学意义（t＝1.13，P〈0.05）；各组食蟹猴手术前后各时间点均未见角膜荧光素染色。结膜印迹细胞学检查表明，卵巢摘除组食蟹猴术前及术后1个月结膜上皮细胞形态正常，结膜杯状细胞数量多，过碘酸希夫染色呈紫色，与假手术组食蟹猴结膜上皮细胞和杯状细胞形态相似；卵巢摘除组食蟹猴术后3个月结膜上皮细胞体积较大，形态多样，结膜杯状细胞体积缩小；术后6个月结膜上皮细胞形态多样且不易分辨，杯状细胞数量明显减少。结论去卵巢食蟹猴眼表结膜细胞形态发生异常变化，泪液渗透压升高，其眼表动态变化与血清雌激素水平下降趋势一致，因此去卵巢食蟹猴可作为性激素相关干眼研究的动物模型。

少阳主骨方介导p19^(Arf)-p53-p21^(Cip1)信号通路调控食蟹猴关节软骨退变的机制

目的根据"少阳主骨"理论,研究少阳主骨方介导p19Arf-p53-p21Cip1信号通路调控关节软骨退变的机制。方法通过X线选取13只膝关节退变的老年食蟹猴,随机选取1只进行病理学观察,其余食蟹猴随机分为少阳主骨方组、氨糖美辛组、生理盐水组,每组4只,连续灌胃8周后处死所有食蟹猴,取关节软骨进行病理学观察,RT-q PCR、Western blot检测关节软骨中p19Arf、p53、p21Cip1基因与蛋白的表达。结果老年食蟹猴KOA模型关节软骨符合KOA病理变化,3组食蟹猴Mankin评分少阳主骨方组7.38±0.52分、氨糖美辛组7.88±0.83分、生理盐水组8.38±0.74分,少阳主骨方组与生理盐水组间具有统计学差异(P<0.05);p19Arf、p53、p21Cip1基因与蛋白的表达少阳主骨方组<氨糖美辛组<生理盐水组,具有统计学差异(P<0.05)。结论少阳主骨方可以延缓关节软骨退变,调控p19Arf-p53-p21Cip1表达。