采用玉米Ubi-1启动子获得低拷贝转基因玉米植株

通过基因枪粒子轰击和草丁膦 (PPT)选择获得可育的玉米转基因植株 ,并分析了外源基因在转化体中的拷贝数与启动子之间的关系。用玉米Ubi 1启动子驱动外源基因 ,玉米转化体中外源基因的拷贝数较低 ;可能的原因为Ubi 1启动子通过与其内部同源序列发生重组而被定点整合进玉米基因组 ,共转化的两种质粒DNA在整合至玉米染色体DNA之前已重构成为一个整体。结果显示使用某一植物自身基因的启动子可以降低外源基因在该物种转基因个体中的拷贝数 ,进而避免基因沉默现象的发生。目前已得到第二代转基因玉米种子。

玉米低磷胁迫诱导型启动子P_(1502)-ZmPHR1在玉米中的瞬时表达

用农杆菌介导法将玉米低磷胁迫诱导型启动子P_(1502)-ZmPHR1与GUS报告基因的融合基因分别转入玉米478未成熟幼胚以及萌动的成熟胚中,通过检测GUS基因的瞬时表达情况来分析该启动子在玉米中的表达活性。结果表明,P_(1502)-ZmPHR1在玉米中低磷条件下被诱导表达,具有启动活性。

玉米低磷胁迫诱导型强启动子P_(1502)-ZmPHR1的克隆与表达分析

玉米ZmPHR1基因是转录因子MYB-CC家族成员,过量表达该基因可促进低磷环境中植物对磷的吸收并改善植物的生长。本研究从磷高效利用型玉米自交系478中获得了ZmPHR1基因的5'上游序列P_(2205)-ZmPHR1,序列长度2205 bp。将P_(2205)-ZmPHR1及它的4种5'端缺失启动子片段与报告基因GUS连接后转化拟南芥。GUS组织化学染色与GUS定量分析结果表明,在0~1502 bp的片段范围内,随着片段长度的增加,它对外界低磷环境的响应逐步增加,在-1502 bp时,响应时间短,表达活性高,持续时间长;超过1502 bp其活性不但没有增高,反而变为下降或无变化。推测0至-972 bp为启动子功能区段,-972 bp至-1502 bp为启动功能增强区段。转P_(1502)-ZmPHR1拟南芥的实时定量PCR结果显示,P_(1502)-ZmPHR1既受外界信号的刺激,也受体内基因产物的影响,有反馈调节的作用,是一个受低磷胁迫诱导的强诱导型启动子,它诱导基因表达的功能受体内外磷浓度的调节。该研究为在低磷环境改良作物提供了理想的启动子和应用依据。

利用CRISPR/Cas9基因编辑片段敲除技术创制玉米多样化等位变异

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制等位变异已经成为众多植物中增加种质资源多样性的重要手段。提高玉米等谷物中类胡萝卜素含量是发展中国家解决维生素A缺乏症的一种经济方法。本研究以玉米中调控类胡萝卜素合成的基因crtRB1为研究对象,利用双靶标片段缺失性基因编辑技术,在原生质体中对crtRB1的启动子顺式元件进行片段敲除,获得了具有片段缺失和InDel(插入或缺失)的多样化等位变异,这为在玉米中实现稳定的crtRB1启动子元件的缺失突变奠定了基础,对启动子元件的功能研究和玉米的品质改良具有重要意义。

花粉致死基因ZmAA1对玉米遗传转化的研究

为了研究花粉致死基因ZmAA1的功能,进而创制转ZmAA1基因玉米不育新材料。在Gen Bank中找到花粉致死基因ZmAA1及启动子Pg47,并在目的片段的上下游设计増加酶切位点,基因合成构建到克隆载体puc57上,采用传统酶切连接的方法构建了植物表达载体pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar,并利用农杆菌介导法转化优良玉米自交系郑58萌动胚。成功构建植物表达载体pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar;共获得94株除草剂抗性植株,其中47株目的片段PCR呈阳性反应,对温室中表现为花粉败育的PCR阳性植株进行目的片段及筛选标记bar基因RT-PCR与蛋白免疫学试纸条检测,结果表明,花粉致死基因ZmAA1及启动子Pg47已经整合到玉米基因组并表达。

玉米转录因子基因ZmASR1的克隆及植物表达载体构建

为深入研究玉米转录因子基因ZmASR1的功能,提高玉米株系的产量和抗逆性,根据http://www.maizegdb.org/网站上公布的玉米自交系B73的ZmASR1序列和Cornejo发表的Ubiquitin启动子的序列,设计引物从玉米自交系B73的DNA序列中克隆了ZmASR1基因和Ubiquitin启动子,并对ZmASR1基因进行了生物信息学分析。序列分析结果表明,ZmASR1基因DNA全长为1 381 bp,包含1个长度为131 bp的内含子序列,存在1个完整的开放阅读框417bp,编码138个氨基酸。氨基酸序列分析表明其具有ASR家族典型的保守结构域ABA_WDS(abscisic acid/water deficit stress),氨基酸序列的N端有该家族成员所特有的依赖于Zn2+的DNA结合位点,而C端则有1个核定位信号,玉米的ZmASR1与单子叶植物的ZmASR1亲缘关系较近,而与双子叶植物的ZmASR1亲缘关系较远。并构建了同时带有该启动子和ZmASR1基因的植物表达载体。

玉米弯孢叶斑病菌clt-1基因生物信息学分析和启动子的功能鉴定

利用农杆菌介导的基因转化(Agrobacterium-mediated transformation,ATMT)技术构建玉米弯孢叶斑病菌突变体库,并从中筛选到了一个毒素合成相关基因clt-1。对clt-1基因编码的蛋白质进行生物信息学分析,结果表明CLT-1的分子质量为81.984 8k Da,等电点p I为8.62,不稳定指数为55.08;CLT-1是亲水性蛋白,包含1个膜外区域。在亚细胞水平上,CLT-1定位于细胞核内;在氨基酸序列方面,CLT-1含有多个苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸激酶磷酸化位点;在功能方面,CLT-1包含BTB特征结构域,可能参与一些功能蛋白质活性的调控。利用GFP(green fluorescent protein)基因作为报告基因,构建了用于鉴定clt-1基因启动子活性的p C1300th-Pclt1-GFP真菌表达载体,采用ATMT方法转化弯孢菌萌发的分生孢子,通过PCR及GFP荧光检测clt-1基因启动子在弯孢菌中调控GFP基因表达的活性。结果表明,在共聚焦激光扫描显微镜下观察到菌丝和孢子发绿色荧光,说明弯孢菌clt-1基因启动子具有较强驱动外源gfp基因表达的活性。

玉米ZmNAS1和ZmNAS2基因启动子的克隆与序列分析

根据已知玉米全基因组序列设计引物,采用PCR方法从基因组DNA中克隆两种玉米材料的Zm-NAS1和ZmNAS2基因启动子,利用生物信息学软件对启动子元件进行分析预测并比较在两种材料间差异。结果表明,ZmNAS1基因启动子在两种材料上差异明显,沈137较K12除一段574bp缺失外,他们之间还有24处单核苷酸多态性位点;两种材料间的ZmNAS2基因启动子无差异。ZmNAS1和ZmNAS2基因启动子均具有一些与光调控、激素诱导、响应逆境胁迫等有关的顺式作用元件,但数目存在一定差异;两个基因启动子上都有一定数目缺铁诱导元件的核心序列。根据启动子元件分析,初步判断ZmNAS1和ZmNAS2基因除受缺铁诱导表达外,还可能受到其他多种信号的共同调控,是一个复杂的调控过程。此外,ZmNAS1基因启动子在两种材料间差异明显,推测该基因在两种材料间受到的表达调控水平也不相同。

玉米纹枯病菌诱导启动子P_(LHT1)核心顺式作用元件的鉴定

玉米纹枯病是玉米上重要的病害之一,前期通过高通量测序筛选到一个受纹枯病菌诱导表达的玉米基因LHT1,为了揭示该基因的调控机制,本研究克隆了该基因的启动子区域(P_(LHT1))并对其病原诱导核心元件进行了鉴定。结果表明,P_(LHT1)包含有4个激发子响应元件、3个GT-1元件、4个SA响应元件、3个ABA响应元件、1个生长素响应元件和1个GA响应元件。该启动子在多个组织器官中高水平表达,且在接种纹枯病菌菌株YWK196后,该启动子在4 h内就能够高效诱导表达报告基因。启动子截短分析发现,-1 416 bp至-1 087 bp区间的缺失使P_(LHT1)丧失了受纹枯病菌诱导的能力,对照Plant CARE的分析结果,该区段含有3个已知的病原菌诱导元件GT-1,将该区段内的3个GT-1进行单个缺失后,发现-1 416 bp至-1 087 bp区段受纹枯病菌诱导的活性减弱并未完全丧失;此外,将3个GT-1元件同时替换为GGGGGG后,-1 416 bp至-1 087 bp区域不再响应纹枯病菌的侵染,这些结果说明,这3个GT-1元件在P_(LHT1)响应纹枯病菌的侵染中协同发挥作用。