不同品系小鼠胚胎玻璃化冷冻保存的比较研究

目的 研究甘油作为冷冻保护剂、不同基因型小鼠对胚胎玻璃化冷冻的影响。方法 采用 6 5mol L的甘油作为冷冻保护剂 ,采用二步法对CBA、NOD、C57BL 6J、ICR及CD1小鼠 3 5d的胚胎进行玻璃化冷冻 ,并比较了不同品系小鼠胚胎的复苏率及移植受孕率。结果和结论 CBA、NOD、C57BL 6J,ICR及CD1的复苏率分别为 5 7 6 %、4 8%、31 3%、86 5 %及 88% ,移植受孕率为 2 1%、2 3 5 %、11%、38%和 35 5 % ,封闭群小鼠的胚胎复苏率、移植受孕率均显著高于近交系小鼠。这提示胚胎的复苏率及移植受孕率可能与小鼠的不同基因型有关。五个品系中 ,桑椹胚及早期囊胚的体外复苏率均显著高于扩张囊胚。

几种因素对牙鲆胚胎玻璃化冷冻保存的影响

鱼类胚胎冷冻保存技术还远没有成熟, 为了寻找最佳的鱼类胚胎玻璃化冷冻保存条件, 我们以牙鲆(Paralichthys olivaceus) 胚胎为例, 研究了影响鱼类胚胎玻璃化冷冻保存的几个主要因子: 玻璃化液、麦管直径、胚胎阶段、平衡时间及平衡温度、洗脱浓度和洗脱时间。发现: (1) 含有多种抗冻剂的玻璃化液PMDD(2% PVP), 玻璃化稳定, 脱玻璃化率较低, 适宜进行玻璃化冷冻; (2) 尾芽期胚胎较其他时期耐受力强, 平衡40 min就足以使玻璃化液渗透完全, 时间延长, 成活率显著降低, 各个时期的胚胎对温度都比较敏感, 0°C与4°C下平衡的成活率显著高于15°C; (3) 洗脱浓度和洗脱时间对胚胎成活率影响不大; (4) 根据优化的条件, 对牙鲆两个时期的胚胎进行超低温冷冻保存实验, 共成活4次, 获得成活胚胎8粒, 其中7粒孵化出健康的鱼苗。本文为鱼类胚胎冷冻保存技术的建立提供基础资料, 并显示了牙鲆胚胎玻璃化冷冻保存是可行的。

生物活性产品玻璃化冷冻保存研究进展

综述了有关动物细胞、胚胎、组织、器官和工程化组织的玻璃化冷冻保存问题。对玻璃化冻存技术基本原理及其在生物产品保存中的冷冻、复温方法,玻璃化液的组成、作用及其对保存产品的影响等进行了阐述。指出玻璃化冷冻保存可能是长时间保存有活性的生物产品简单、适用、有效的方法。同时指出玻璃化冷冻保存方法面临的问题及发展的方向。

小鼠囊胚玻璃化冷冻保存研究

在 2 0°C室温下 ,用玻璃化冷冻液 (体积分数为 0 .4的乙二醇 ,质量浓度为 0 .1 8kg/L的葡聚糖和 0 .3mol/L海藻糖 )对昆明小白鼠囊胚进行一步法和二步法玻璃化冷冻保存 .一步法的 1 min平衡组和二步法的0 .5 min平衡组胚胎解冻后 ,体外培养 2 4h后的发育率较高 ,都为 91 % ,与对照组 (98% )相比无显著差异 (P>0 .0 5 ) ;体外培养 48h后的囊胚孵化率较好 ,分别为 48%和 5 1 % ,但与对照组 (90 % )相比 ,均有极显著差异(P<0 .0 1 ) .将此两组冷冻囊胚植入假孕 3 d的受体鼠子宫内 ,其产仔率分别为 43 %和 5 0 % ,与对照组 (5 5 % )相比 ,均无显著差异 (P>0 .0 5 ) .

囊胚玻璃化冷冻保存时长对复苏移植临床结局的影响

目的研究使用开放式载体玻璃化冷冻保存囊胚的时长对复苏移植妊娠结局和新生儿结局的影响,探讨胚胎经过玻璃化冷冻并进行6年以上的长期保存是否对临床结局产生负面影响。方法回顾性分析2006年3月至2018年12月期间在我院生殖中心进行囊胚玻璃化冷冻复苏移植的2 643例患者的临床资料。按照胚胎玻璃化冷冻保存时长将其分为7组:≤1年,1~2年,2~3年,3~4年,4~5年,5~6年和≥6年,比较各组患者一般情况、临床结局、活产情况和单胎新生儿出生结局之间的差异,再使用二分类Logistic回归分析女性取卵年龄、移植年龄、胚胎冷冻保存时间、囊胚冷冻日期和囊胚级别对妊娠率和活产率的影响。结果各组患者取卵年龄、移植年龄、优胚率、复苏胚胎存活率、妊娠率和活产率组间差异有统计学意义(P<0.05)。各组平均移植胚胎数、D5胚胎比例、种植率、流产率、异位妊娠率、单胎率、出生男孩率、出生缺陷率、单胎出生体重、身长和孕天数均无统计学差异(P>0.05)。Logistic回归分析显示取卵年龄、移植年龄和冷冻保存时间对妊娠率无显著影响(P>0.05),取卵年龄和冷冻保存时长对活产率无显著影响(P>0.05),而增加移植D5胚胎和优质胚胎数量可以提高妊娠率和活产率(P<0.05),移植年龄的增加会降低活产率(P<0.05)。结论使用开放性载体玻璃化冷冻保存囊胚的时长对复苏后移植的妊娠结局和新生儿结局没有明显影响。囊胚经过玻璃化冷冻并进行6年以上长期冷冻保存,临床结局未产生明显负面影响。

卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展

随着许多哺乳动物卵母细胞冷冻的成功,哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存技术取得了不断发展。作者列举比较了开口式拉长细管法、电镜铜网法、固体表面法和尼龙环法等多种卵母细胞的玻璃化冷冻保存方法,并对影响卵母细胞玻璃化冷冻保存的细胞骨架等因素进行了阐述。讨论后提出自己的建议。

鸡胚19期原始生殖细胞慢速冷冻和玻璃化冷冻保存的研究

本研究对发育至第19期的鸡胚性腺原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)分离提纯后,在DMEM中添加冷冻保护剂DMSO(二甲基亚砜)、EG(乙二醇)、蔗糖、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)分别组成6种慢速冷冻保护液和6种玻璃化冷冻保护液,进行超低温冷冻保存。复苏后苔盼蓝染色测定细胞存活率,体外接种培养、传代。结果:①慢速冷冻保存中,PGCs在慢速冷冻液V(10%EG+10%FBS+0.1mol/L蔗糖)条件下复苏后存活率最高(92.20%),且与慢速冷冻液I(10%DMSO+10%FBS)存活率之间差异显著(P<0.05)。②玻璃化冷冻保存中,PGCs在玻璃化冷冻液I(10%DMSO+10%EG+20%FBS+10%PVP)条件下复苏后存活率最高(84.15%),且与其余5种玻璃化冷冻液下复苏后存活率之间差异均极显著(P<0.01)。③培养传至第3代的慢速冷冻复苏后PGCs细胞和培养传至第2代的玻璃化冷冻复苏后PGCs细胞,PAS染色、AKP染色呈阳性并保持完整的二倍体核型。

小鼠原核胚玻璃化冷冻保存技术的研究

目的 原核胚是转基因等生物技术所必需的主要材料 ,其冷冻保存使操作不受时间和空间的限制。另外 ,冷冻保存还可以避免体外培养过程中的细胞发育阻断期。方法 在室温 (2 0℃或 2 5℃ )条件下 ,以乙二醇、DMSO为主体抗冻保护剂配制成的玻璃化溶液 (EFS、EDT、EDFS) ,不借助冷冻仪 ,对小鼠原核胚进行一步法和二步法玻璃化冷冻保存。结果 2 0℃室温条件下 ,用EDFS4 0平衡 1min一步法冷冻解冻后的原核胚 ,经培养后囊胚发育率最高仅为 4 7% ,与新鲜原核体外培养的对照组 (75 % )的差异极显著 (P <0 0 1) ;当原核在 10 %E +10 %D溶液中预处理 5min ,移入EDFS30中平衡 30s二步法冷冻保存 ,解冻后的囊胚发育率达 6 8%。而室温升至 2 5℃ ,二步法冷冻保存后原核胚的囊胚发育率高达 77% ,与对照组差异无显著性 (P >0 0 5 )。用最佳冷冻组的原核胚或解冻后培养到囊胚移植给受体母鼠均获得产仔。结论 本研究对小鼠原核胚实施玻璃化冷冻保存 ,经体外培养和移植结果与对照组无显著性差异 。

绵羊卵母细胞玻璃化冷冻保存实验

采用玻璃化冷冻保存方法,对375个成熟的绵羊卵母细胞进行冷冻,解冻后进行体外受精。结果为:形态完好率94.4%,卵裂114个,36个受精卵达到早期桑葚胚的阶段。实验的目的在于尝试绵羊卵母细胞玻璃化冷冻保存的可能性,相信绵羊卵母细胞冷冻保存问题最终会得到解决。

玻璃化冷冻保存组织工程肌腱植入大鼠体内的组织学变化

背景:应用玻璃化冷冻方法保存组织工程肌腱具有可行性和应用前景,有待进一步研究。目的:探讨应用玻璃化冷冻保存组织工程肌腱体内植入对大鼠跟腱缺损修复的影响。方法:选用成年SD大鼠64只,于大鼠跟腱中段制备5mm肌腱缺损模型,随机摸球法均分为2组,分别植入玻璃化冷冻保存组织工程肌腱和新鲜非冷冻保存组织工程肌腱。植入后2,4,6,8周,观察植入肌腱材料及周围组织的大体形态和组织学变化。结果与结论:两组肌腱材料体内植入后的大体形态和组织学反应无明显差异。植入后2,4周,植入的肌腱材料发生降解,材料中间及周围有大量炎性细胞浸润和纤维结缔组织增生。植入后6,8周,大量新生胶原纤维组织长入并替代降解的植入材料,形态和排列方式趋近于正常肌腱组织,大鼠跟腱缺损基本修复。结果表明玻璃化冷冻保存组织工程肌腱体内植入可修复大鼠跟腱缺损。

渤海黑牛超数排卵与胚胎玻璃化冷冻保存研究

渤海黑牛目前存栏量急剧下降,亟需对这一宝贵种质资源进行抢救性保护。本试验选用青年牛作为供体进行超数排卵处理,研究季节、促卵泡素(FSH)来源、饲粮成分对其超数排卵效果的影响,并将获得的可用胚胎利用冷冻载杆进行玻璃化冷冻保存。结果表明:(1)春季头均可用胚数、胚胎可用率显著高于冬季(P<0.05);(2)使用国产FSH渤海黑牛的超排有效率、头均胚胎数、头均可用胚数、胚胎可用率显著低于进口FSH(P<0.05);(3)含胚芽玉米组超排有效率、头均胚胎数、头均可用胚数、胚胎可用率均显著高于不含胚芽玉米组(P<0.05);(4)玻璃化冷冻保存85枚胚胎,胚胎冷冻可用率为82.52%,杆均胚胎数为2.30枚。本试验为渤海黑牛体内胚胎生产及种质资源保存提供了一定的参考。

小鼠2-细胞胚胎单个卵裂球体外培养及其发育形成囊胚的玻璃化冷冻保存技术的研究(简报)

单个卵裂球分离和培养是生产同卵双胎或一卵多胎动物的一种有效方法。在羊和牛已经获得了来源于2-细胞和4-细胞期胚胎的单个卵裂球的活体后代;在兔也获得来源于4-细胞胚胎的单个卵裂球后代;在猪已获得8-细胞单个卵裂球的后代。但多数的研究者发现,小鼠单个卵裂球培养后的体外发育率、移植妊娠率和产仔率都很低。上述均为新鲜胚移植结果,至于分离后卵裂球发育成的囊胚再进行玻璃化冷冻保存尚未见报道。

哺乳动物胚胎玻璃化冷冻保存概况及其常用方法

哺乳动物卵母细胞和胚胎的超低温冷冻保存技术，是胚胎移植、体外受精、转基因和克隆等生物技术不可缺少的部分。Rall和Fahy于1985年首次报道了用玻璃化方法来冷冻保存小鼠胚胎，这种方法不仅大大简化了冷冻过程，而且减少了由于细胞冰晶形成所引起的一系列物理及化学损伤，提高了冷冻效率。

牛胚胎玻璃化冷冻保存研究进展

所谓的玻璃化冷冻就是在完全的玻璃化状态下冷冻保存细胞、组织或器官。为了在一定冷冻速度下形成玻璃化，需要使用高浓度的可渗透性低温保护剂。

玻璃化冷冻保存对体外成熟猪卵母细胞DNA的影响

采用乙二醇(EG)+二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂处理并使用微管法冷冻保存猪卵母细胞,运用细胞形态观察和单细胞凝胶电泳(SCGE)方法检测玻璃化冷冻过程对细胞DNA损伤情况。结果显示:保护剂处理冷冻组,细胞形态正常率和DNA异常率分别为63.364%、42.059%;同保护剂处理未冷冻对照组82.571%、25.758%的差异显著(P<0.05)。表明冷冻保存过程对猪卵母细胞DNA有一定影响;以无冷冻保护剂处理卵母细胞为对照检测保护剂的细胞毒性,对照组形态正常率和DNA异常率分别为84.51%、12.28%,与冷冻保护剂处理组有显著差异(P<0.05)。说明冷冻保护剂对猪卵母细胞DNA有明显细胞毒性作用。

新生小鼠卵巢组织玻璃化冷冻保存与异体异位移植研究

开展小鼠新生胎儿卵巢组织冷冻保存与移植研究,为建立家畜卵巢组织冷冻保存与移植技术奠定基础。采用微滴法玻璃化冻存方法处理卵巢,卵巢复苏后移植到昆明系雄性小鼠受体肾囊下,19只雄性受体鼠接受了卵巢移植,每侧肾囊移植2枚,卵巢共移植1日龄小鼠卵巢38个。饲喂28 d有效回收移植卵巢的受体鼠为17只,受体总有效率分别为89.4%;有效回收移植卵巢30个,卵巢总回收率为78.9%。结果表明,小鼠早期卵巢经过冷冻、解冻并异体异位移植后,其原始卵泡能够重新启动生长发育。

玻璃化冷冻保存法及其在运动医学关节软骨组织保存的应用

随着低温保存技术的持续进步,玻璃化保存技术和方法已被广泛地用于各种生物材料的低温保存中。玻璃化冷冻法在运动医学软组织(比如关节软骨、肌腱组织)移植方面有广阔的应用前景,并为其相应的组织库保存提供技术保障,在组织修复中起到重要作用。