球毛壳菌(Chaetomium globosum)过氧化物膜蛋白过敏原基因克隆、序列分析及原核表达

以球毛壳菌cDNA文库中获得过氧化物膜蛋白(pero)基因片段(GenBank Accn: BP099709)为基础,用RACE技术获得该基因的全长cDNA序列。序列长747bp,由412bp的3’ RACE产物和508bp的5’RACE产物拼接而成。开放阅读框501bp,编码166个氨基酸,蛋白分子量为17．5kDa,理论等电点为5．75。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA 序列,序列分析表明该基因由2个内含子和3个外显子组成。ClustalX多序列比对表明:该基因与粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的过氧化物膜蛋白过敏原同源性最高(83％)。将pero基因编码区克隆到原核表达载体pET28a中,构建成表达质粒pET28a-pero并转化大肠杆菌BL21,IPTG 诱导后SDS-PAGE检测表达情况,结果发现在21kDa处有一特异性融合蛋白带,大小与预期相符, 说明该基因已经在大肠杆菌中表达。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在 GenBank登录(登录号分别为AY555771,AY584753,AAS66898)。

球毛壳菌小麦秸秆发酵产物抑制辣椒疫霉的稳定性及机制

【目的】由辣椒疫霉(Phytophthora capsici)侵染引起的疫病给辣椒等作物产业带来了巨大的经济损失。论文旨在明确球毛壳菌(Chaetomium globosum)代谢产物抑制辣椒疫霉的稳定性和抑菌机制,为研究与开发辣椒疫霉的微生物源抑菌剂提供参考。【方法】将球毛壳菌发酵粗提物分别在不同温度(40—121℃)、pH(1—13)、光照时间(0—12 d)和储存时间(0—60 d)条件下进行处理,采用菌丝生长抑制法测定经不同处理后粗提物对辣椒疫霉的抑制率,以探究粗提物抑制辣椒疫霉的热、酸碱、光和时间稳定性。利用光学显微镜观察粗提物对辣椒疫霉菌丝形态的影响,通过多种生理生化试验探究粗提物作用于辣椒疫霉12—72 h后,对辣椒疫霉细胞壁、细胞膜、活性氧代谢、蛋白质含量、还原糖含量和致病力的影响。【结果】在所设置的处理范围内,球毛壳菌发酵粗提物(1 mg·mL^(-1))经不同光照时间和储存时间处理后对辣椒疫霉的抑制率没有显著降低,抑制率维持在93%左右;粗提物在40—70℃的热处理范围内对辣椒疫霉的抑制率没有显著降低,70℃以上的热处理会显著降低粗提物对辣椒疫霉的抑制率,但抑制率不低于70%;粗提物在pH 1—5和9—13的酸碱处理范围内会显著降低对辣椒疫霉的抑制率,但抑制率也不低于70%。粗提物处理影响辣椒疫霉菌丝形态,使菌丝发生严重的扭曲皱缩现象,并影响活性氧代谢,使菌丝中的活性氧大量积累。辣椒疫霉经粗提物处理12—72 h后,其培养液中的碱性磷酸酶活性、β-葡萄糖苷酶活性、核酸和蛋白质含量均显著升高,且其菌丝中的丙二醛和过氧化氢含量显著增加。辣椒疫霉菌丝中的过氧化氢酶活性、可溶性蛋白和还原糖含量则在粗提物处理12—72 h内显著降低,而超氧化物歧化酶、过氧化物酶、多聚半乳糖醛酸酶和β-葡萄糖苷酶活性则仅在一定时间显著降低。【结论】在本试验所设置的处理范围内,球毛壳菌的小麦秸秆发酵粗提物抑制辣椒疫霉的效果不受光照及储存时间的影响,但超过70℃的热处理和pH 1—5和9—13的酸碱处理会显著降低粗提物对辣椒疫霉的抑制效果。此外,该粗提物通过改变菌丝形态,破坏细胞壁和细胞膜,引发细胞内物质泄漏,降低菌丝中蛋白质和还原糖含量,抑制抗氧化酶活性,干扰活性氧代谢使活性氧大量积累从而抑制辣椒疫霉。

一株球毛壳霉次级代谢产物及其体外抗肿瘤活性研究

目的研究球毛壳霉次级代谢产物及其体外抗肿瘤活性。方法2021年3—12月,采用硅胶柱色谱法、凝胶柱色谱法、半制备高效液相色谱法等分离方法和技术对球毛壳霉次级代谢产物进行分离纯化,使用NMR核磁数据及质谱数据分析鉴定化合物的结构;采用MTT法评价化合物的体外抗肿瘤活性。结果从球毛壳霉次级代谢产物中分离得到7个化合物,分别鉴定为(1)cyclo-(L-Leu-L-Trp),(2)N-acetyl-L-tryptophan,(3)N-acetyltryptamine,(4)armochaetoglobin G,(5)armochaetoglobin J,(6)armochaetoglobinK,(7)chaetoglobosinU;化合物1和3为首次从球毛壳霉中分离得到;化合物4和5对选定的人肿瘤细胞具有一定的体外抗增殖活性,IC_(50):12.58~35.28µmol/L。结论球毛壳霉能够产生结构丰富的代谢产物,其中一些代谢产物有良好的抗肿瘤活性,具有潜在药用价值,其活性化合物有待进一步挖掘。

球毛壳菌固态发酵产抗植物病原真菌活性物质的工艺优化

【目的】优化球毛壳菌(Chaetomium globosum)秸秆固态发酵的培养基组成和发酵条件,提高发酵粗提物的抗真菌活性,为球毛壳菌生物农药的开发及秸秆绿色资源化提供参考。【方法】首先,以粗提物抗9种植物病原真菌菌丝生长的抑制率为评价指标,对培养基中的秸秆(水稻、小麦、玉米、油菜)和氮源(豆粕、麦麸、氯化铵)进行筛选,确定最适发酵培养基组成。随后进行发酵条件的单因素优化,以粗提物对辣椒疫霉的抑制率为评价指标,初步确定各发酵条件的较优范围及对粗提物抗真菌活性影响的程度。基于单因素优化的结果,利用正交设计对发酵条件进行正交优化,各参数的范围如下:发酵时间18—36 d、发酵温度26—32℃、培养基初始含水量70%—85%、秸秆与麦麸质量比4﹕1—1﹕1、秸秆粒径20—>100目。最后,获得球毛壳菌秸秆固态发酵产抗真菌活性物质的最优发酵条件并进行验证。【结果】在筛选固态发酵培养基组成时发现,球毛壳菌以小麦秸秆和麦麸组成的培养基进行发酵所获得的粗提物的抗真菌效果总体上优于其他组成的培养基。在发酵条件单因素优化中,菌液接种量对粗提物抗真菌效果影响不显著,故不对其进行后续的正交优化。正交优化中各发酵条件对球毛壳菌发酵粗提物抗真菌活性的影响极为显著(P<0.001),其影响程度依次为小麦秸秆与麦麸质量比>发酵时间>培养基初始含水量>发酵温度>小麦秸秆粒径。正交优化获得的最优发酵条件为发酵时间24 d、发酵温度26℃、培养基初始含水量80%、小麦秸秆与麦麸质量比4﹕1、小麦秸秆粒径60—100目。经发酵条件优化后,1 mg·mL^(-1)的球毛壳菌发酵粗提物对核盘菌、辣椒疫霉、稻瘟病菌、桃褐腐病菌、尖镰孢、黄色镰孢、鞘腐霉、禾谷镰孢、水稻纹枯病菌的抑制率分别为100%、92.86%、85.94%、83.90%、76.12%、73.02%、66.18%、58.96%、52.99%。【结论】经过发酵培养基组成和发酵条件优化后,球毛壳菌的发酵粗提物具有较高的抗真菌活性,可为后续分离、纯化球毛壳菌利用秸秆固态发酵产生的抗真菌活性物质打下基础。

球毛壳菌促生防病机制及应用研究进展

球毛壳菌是植物常见的内生真菌,对多种植物病害有生防作用。本文从产生抗菌活性物质、促进植物生长、诱导植物抗性、生态位和营养物质竞争和重寄生作用等方面综述了球毛壳菌对植物病害的生防作用机理。阐明球毛壳菌在植物防病促生、土壤改良和秸秆降解方面具有广阔的应用潜力。探讨了球毛壳菌规模化发酵和基因工程技术的研究进展。本研究将为促进球毛壳菌的应用研究提供理论参考。

杜仲内生球毛壳菌发酵产物体外抗脂质过氧化和保护红细胞的研究

对所筛选的一株具有较高抗氧化活性的杜仲内生球毛壳菌的发酵液提取物进行体外抗脂质过氧化和抑制小鼠红细胞溶血氧化的研究。结果表明:杜仲内生球毛壳菌的发酵液提取物对小鼠肝、肾、心和脾组织的脂质过氧化的抑制效果随着发酵提取物浓度的增加而不断增强,1mg/ml发酵提取物对小鼠心和脾两种组织脂质自发过氧化的抑制率分别为71.55%和71.68%,对H2O2诱导的肝组织脂质过氧化的抑制率达到92.50%;0.3mg/ml的发酵提取物对小鼠红细胞自氧化溶血的抑制率为68.48%,对H2O2诱导的小鼠红细胞氧化溶血的抑制效果则随着浓度的提高而增强,0.75mg/ml浓度的抑制率达到96.12%。结论:杜仲内生球毛壳菌发酵液提取物在体外有较显著的抗脂质过氧化作用和通过降低氧化溶血而保护红细胞的作用。

球毛壳菌60S核糖体蛋白L10a基因克隆与特性分析

用粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)XP_322380和赤霉菌(G ibberella zeae)PH-1(EAA76971)的60S核糖体蛋白L10 a基因(60S ribosom al prote in L10 a,RPL10 a)蛋白序列对球毛壳菌(Chaetom ium globosum)ESTs序列数据库进行tB lastn检索,获得了球毛壳菌RPL10 a cDNA序列。cDNA序列长765 bp,开放阅读框654 bp,编码217个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为23.9 kD。B lastP分析表明该基因氨基酸序列与粗糙脉胞菌相似最高为89%;与玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)相似性最低为78%。cDNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY669070,AAT74578)。

球毛壳菌组蛋白H3基因克隆与特性分析

构建了球毛壳菌菌丝的cDNA文库,并获得了1410条ESTs序列,用里氏木霉(Hypocrea jecorina,AAM76068)和粗糙脉胞菌(Neurospora crassa,CAA25761)的组蛋白H3基因(Histone H3)蛋白序列对球毛壳菌(Chaetomium globosum)ESTs序列本地数据库进行tBlastn检索,获得了球毛壳菌组蛋白H3cDNA序列。cDNA序列全长739bp,开放阅读框411bp,编码136个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为15.4kD。BlastP同源性分析表明该基因与里氏木霉同源性最高为100%;与地钱(Marchantia polymorpha)同源性最低为95%。三级结构预测表明,该蛋白C端为球状结构域,而N端结构对其发挥调控作用起重要作用。该基因的cDNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY669068,AAT74576)。

球毛壳菌ND35对枸杞扦插苗根系发育的影响

球毛壳菌(Chaetomium globosum)ND35是分离筛选自健康毛白杨的优势植物内生真菌。本文通过测定球毛壳菌ND35处理的枸杞扦插苗侧根数量、根系活力、根系木质素含量和叶绿素含量等分析其对枸杞扦插苗根系生长发育的影响。研究结果表明,球毛壳菌ND35显著增加了枸杞扦插苗侧根数量,提高了扦插苗根系活力、根系木质素含量和叶绿素含量。同时,球毛壳菌ND35能够诱导苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化物酶(POD)等木质素关键合成酶的活性提高,促进枸杞扦插苗根系的木质化。本文研究结果将为球毛壳菌ND35在枸杞繁育、栽培生产中的开发应用提供理论依据。

柑橘源球毛壳菌对番茄枯萎病的生防机制及抑菌效果

通过分子生物学鉴定方法,将从柑橘炭疽病感染叶中分离得到的1株真菌菌株5号初步鉴定为球毛壳菌(Chaetomium globsum)。通过皿内拮抗性试验和竞争试验,发现该菌株对番茄枯萎病拮抗系数为Ⅲ级,拮抗率达53.8%。为了进一步了解菌株5号球毛壳菌的生防潜力和作用机制,对其进行了包括营养竞争、代谢产物等生防机制的研究。结果显示,菌株5号对番茄枯萎病的抑制是多种生防机制的协同作用,具有一定的生防潜力。

球毛壳菌CGMCC 6882利用小麦秸秆发酵生产抗氧化多糖

针对我国小麦秸秆存在严重浪费和污染环境的现状,该实验采用球毛壳菌CGMCC 6882对小麦秸秆进行发酵,生产一种新型胞外多糖,并对多糖结构和抗氧化活性进行研究。结果显示,球毛壳菌CGMCC 6882以小麦秸秆为碳源发酵所得胞外多糖的单糖组成和摩尔比为鼠李糖∶氨基葡萄糖∶半乳糖∶葡萄糖∶木糖∶果糖∶葡萄糖醛酸=21.46∶1.58∶1.11∶55.15∶36.37∶7.04∶7.34,重均分子质量M w为3.538×10^(4) Da。体外抗氧化实验结果显示,球毛壳菌CGMCC 6882胞外多糖可以有效清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子和ABTS阳离子自由基,且清除率与多糖浓度成正相关。多糖质量浓度为5 mg/mL时,对上述自由基的清除率分别达到(83.08±2.58)%、(81.39±1.47)%、(79.38±2.03)%和(85.69±1.62)%。细胞抗氧化实验结果显示,加入多糖实验组的丙二醛酶活水平从(15.8±0.25)μmol/g降低至(7.5±0.31)μmol/g,与多糖浓度成负相关;Caco-2细胞内超氧化物岐化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活力水平分别从(147.28±4.82)、(11±1.15)和(18.08±1.96)U/mg增加至(238.89±3.91)、(39.12±0.76)和(41.35±2.18)U/mg,且与多糖浓度成正相关。该实验为小麦秸秆的高效利用提供了重要依据和理论基础。

美登木内生真菌产抗癌物质球毛壳甲素的分离及鉴定

目的 通过植物内生真菌的分离 ,筛选产生抗癌成分的菌株。方法 从美登木 (Maytenushookeri)茎、叶中分离内生真菌 ,对其发酵产物经活性跟踪 (抑菌实验 ) ,其活性成分用薄层色谱、柱色谱纯化及活性跟踪 ,再经质谱及核磁共振光谱分析确定结构。结果 从美登木中分离筛选到一株球毛壳菌 (Chaetomium globosum ) :98M 6 ,其产生抗癌化合物球毛壳甲素(chaetoglobosinA)。 结论 美登木内生真菌中 ,有的内生真菌可产生与宿主所产的美登素 (maytensine)

林下参内生球毛壳菌FS-01对人参病原真菌的抑制作用

为探究林下参内生真菌球毛壳菌(Chaetomium globosum)FS-01菌株对人参病原菌的抑菌作用,该研究在实验室条件下,测定了FS-01菌株菌丝、发酵液和孢子悬浮液对人参黑斑病菌(Alternaria panax)、人参菌核病菌(Sclerotinia schinseng)、人参灰霉病菌(Botrytis cinerea)、人参立枯病菌(Rhizoctonia solani)、人参根腐病菌(Fusarium solani)5种人参病原菌的抑制作用。结果表明:内生真菌球毛壳菌FS-01对5种病原菌均有抑制作用,其中,对人参黑斑病菌的抑制作用最高,为30.80%,其次是人参立枯病菌、人参菌核病菌、人参根腐病菌和人参灰霉病菌;发酵液抑菌实验结果表明,在加入内生真菌球毛壳菌FS-01菌株发酵液的PDA培养基上,对人参灰霉病菌的抑制作用最高,为82.09%,其次是人参菌核病菌、人参黑斑病菌、人参立枯病菌和人参根腐病菌;孢子抑菌实验结果表明,在加入内生真菌球毛壳菌FS-01菌株孢子悬浮液的PDA培养基上,对人参黑斑病菌的抑制作用最高,为83.72%,其次是人参灰霉病菌、人参立枯病菌、人参菌核病菌和人参根腐病菌。综上结果认为,内生真菌球毛壳菌FS-01菌株对人参病原菌均有很高的抑菌作用,可作为人参病原菌的生防菌株资源。

球毛壳菌CIB-160次生代谢产物的分离鉴定及其免疫活性

采用硅胶柱层析、HPLC、Sephadex LH-20凝胶柱层析等分离方法对球毛壳菌CIB-160的次生代谢产物进行纯化,得到10个化合物。通过NMR、HR-MS和旋光数据分析以及文献比对,其结构鉴定为chaetoglobosins A（1）、C（2）、E（3）、F（5）、Fex（6）、W（7）,penochalasin F（4）,5-（methyl-2-butenyl）-indole-2,3-dione（8）、chaetoviridin A（9）和cochliodone A（10）。8和10为首次从野生型球毛壳菌代谢物中分离得到的化合物。体外免疫活性检测显示1-6对小鼠脾细胞的增殖具有抑制作用,IC50值分别为0.21、2.8、2.3、2.2、1.7、2.7μM。同时1-6具有较强的细胞毒性,对静息小鼠脾细胞存活率IC50值分别0.82、7.5、2.3、6.1、4.6、6.7μM。

球毛壳菌荧光标记与重寄生现象研究

球毛壳菌是一种非常重要的生防真菌.为了从分子生物学水平研究球毛壳菌与立枯丝核菌的拮抗机制,选用GFP(green fluorescent protein)作为报告基因对球毛壳菌进行标记.通过构建和转化EGFP(Enhanced GFP)表达载体,得到氯嘧磺隆抗性的转化子.经过几轮验证筛选,包括选择性平板筛选、PCR扩增目的片段验证、Southern杂交、荧光镜检等,确认SUR基因和EGFP基因已经插入球毛壳菌的基因组并在其中表达标记.取一个确认为荧光标记转化子的菌株,进行生防特性分析.主要通过与病原真菌平板共培养、载玻片对峙培养等方法初步研究了球毛壳菌与立枯丝核菌的拮抗机理.结果发现,在对立枯丝核菌的抑制过程中,球毛壳菌的拮抗机理主要是重寄生作用.

石榴叶斑病球毛壳菌生长习性及杀菌剂筛选

采用生长速率法研究了云南蒙自石榴叶斑病球毛壳菌菌丝生长的条件及有效杀菌剂。结果表明,球毛壳菌菌丝在26~34℃均能生长,适宜温度是26~32℃,最适温度为28℃;偏好75%~85%的相对湿度,最适相对湿度为85%;光照促进菌丝生长;pH值4.5~7.5时均适宜于球毛壳Bd-2菌丝的生长,最适pH值为6.5,表明该菌偏好弱酸性环境。不同碳源、氮源对球毛壳菌菌丝生长的影响均较明显,麦芽糖和蛋白胨对菌丝生长有显著的促进作用。随后,分别用75%百菌清、80%甲基硫菌灵和80%代森锰锌等3种常见杀菌剂,以及细辛、小桐子和夹竹桃等3种植物提取液在培养基上进行抑菌实验,从菌丝生长的抑制率大小初步鉴定80%甲基硫菌灵为该病害的有效杀菌剂;在3种植物提取液中,细辛提取液对球毛壳Bd-2的菌丝生长抑制率最高,4 mg·mL^(-1)抑菌率达100%。明确了云南蒙自石榴叶斑病球毛壳菌生长的环境条件及有效杀菌剂,为生产上化学防治提供了选择杀菌剂的理论基础。

球毛壳菌部分表达序列标签的生物信息分析

球毛壳菌属于子囊菌门，是一种植物病害的广谱生物防治菌。为了解球毛壳菌的遗传背景和为生产上的应用打下基础，构建了球毛壳菌菌丝体的cDNA文库。测序产生了3507个可读序列，进一步分析时去掉小于100bp的短序列。用phrap软件对所获得的3116个表达序列标签(EsT)进行拼接，生成387个contigs和1023个singlets。BLAST分析表明513个单一基因是已知基因，897个单一基因代表新基因。通过E-mail从国际DNA数据库(DDBJ)取得了1410条序列的登录号。从已知基因中鉴定了3类生物防治相关基因。研究结果表明，利用EST途径鉴定球毛壳菌的基因是非常有效的，而且能为生物防治分子机理和生物防治基因表达产物生产技术的研究提供重要线索。

油菜内生球毛壳菌抑菌作用初步测定

平板对峙试验显示,从油菜(Brassicanapus)叶、根和种子上分离到的14株内生球毛壳菌(Chaetomiumglobosum)对油菜菌核病原菌和立枯丝核菌均有不同程度的抑制作用,其中以种子上分离到的Dyst-1和MYNS-1的抑制作用最好。Dyst-1和MYNS-1的发酵液通过高压湿热灭菌和细菌过滤器过滤灭菌后,分别对所选用的几株植物病原真菌表现出抑制作用,特别是对油菜种传病害菌核病病菌。油菜内生球毛壳菌的详细抑菌机制需进一步研究。

球毛壳菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆及特性分析

用粗糙脉孢菌(Neurospora crassa,XP_327967)和菜豆炭疽病菌(Colletotrichum lindemuthianu,P35143)的甘油醛_3_磷酸脱氢酶基因(Glyceraldehyde 3_phosphatedehydrogenase,GAPDH)氨基酸序列对球毛壳菌(Chaetomium globosum)菌丝ESTs序列本地数据库进行tBlastn检索,获得了球毛壳菌GAPDH全长cDNA序列。该序列长1240bp,开放阅读框1014bp,编码337个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为36.1kD。用PCR方法克隆了该基因的DNA序列,序列长为1556bp,由2个内含子和3个外显子组成。BlastP同源性分析表明该基因与鹅掌柄孢壳(Podosporaanserine)同源性最高为95%;与米曲霉(Aspergillusoryzae)同源性最低为87%。GAPDH酵母转化子生物功能分析表明转化子对Na2CO3和高温有高的耐受性,证明GAPDH为抗胁迫基因。该基因的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY522719,AY593253,AAS01412)。

球毛壳菌降解天然木质纤维素能力差异及酶系基因分析

目的:以不同植物中分离到的4株内生球毛壳菌NK102、NK103、NK104和NK105为对象,研究不同生态来源球毛壳菌降解木质素和纤维素的能力。方法:首先采用羧甲基纤维素和纤维素刚果红平板检测各菌株的纤维素降解能力,并利用Bavendamm平板反应检测各菌株的木质素降解能力;将4株菌分别培养在以微晶纤维素、杨树叶和木屑为惟一碳源的液体培养基中,通过检测培养液中纤维素酶和漆酶的酶活力,比较各菌株分解利用天然木质纤维素材料的能力,连续培养12 d后检测培养液中次级代谢产物的合成情况;利用已测序的球毛壳菌CBS148.51的基因组信息,寻找编码木质纤维素降解酶类的基因,为球毛壳菌分解利用木质纤维素提供分子生物学依据。结果:NK102、NK103、NK104和NK105在羧甲基纤维素培养基和纤维素刚果红培养基上都能够生长并形成水解圈;Bavendamm平板反应显示4株菌降解木质素的能力由强到弱依次是NK103、NK102、NK105和NK104。4株菌都能分解利用微晶纤维素、杨树叶和木屑,分泌纤维素酶和漆酶,其中NK102在以木屑为碳源的培养基上纤维素酶活力最强,达到0.76 U/mL发酵液,NK103在以杨树叶为碳源的培养基上漆酶活力最强。与此同时,4株菌在发酵培养过程中都能够稳定地合成球毛壳甲素(ChA),ChA产量受到碳源影响,在以杨树叶为碳源的培养基上,NK104的ChA产量最高,可达到14.88 mg/L发酵液。利用已测序的球毛壳菌CBS148.51的基因组信息,寻找到119个编码纤维素半纤维素酶的基因、8个编码漆酶的基因和2个编码锰过氧化物酶的基因,球毛壳菌具有完整的降解纤维素半纤维素的酶体系,在木质纤维素降解真菌的开发过程中具有重要的研究价值。结论:本研究为球毛壳菌木质纤维素降解过程的研究及该菌种的开发利用奠定了基础。