基于连接酶-琼脂糖凝胶电泳的单核苷酸多态性快速检测方法

目的研究一种简便、快速、灵敏的单核苷酸多态性（SNP）分型方法,使其能够在简单实验条件下进行常规的临床检测。方法基于连接酶-琼脂糖凝胶电泳技术,设计突变位点的检测探针,通过对检测探针的连接、纯化和通用扩增反应,根据琼脂糖凝胶电泳条带的出现情况判定检测位点的突变类型。以表皮生长因子受体（EGFR）基因的3个SNP突变位点EGFR,c.2573T〉G（L858R）,EGFR,c.2582T〉A（L861Q）和EGFR,c.2155G〉T（G719C）为检测对象,分别对质粒模板和肺癌血浆循环DNA样本进行了检测。结果建立方法操作简便,具有较高的特异性和灵敏度。经过20-30个循环的PCR扩增,能够根据扩增条带的有无清晰判断检测位点的基因型。在对不均一样本中混合等位基因检测时,能够最低检测出2.5%的突变型等位基因。本方法和直接测序法分别能够从62例肺癌样本检测出6例和2例L858R位点杂合子突变。结论 SNP突变检测方法适合于在简单实验条件下对不均一样本进行常规突变检测。

全自动Hb琼脂糖凝胶电泳与Hb-F碱变性试验对Hb-F含量测定的比较分析

目的 :比较全自动Hb电泳法与Hb F碱变性试验法对Hb F含量的检测结果 ,探讨全自动电泳法对Hb F定量检测的意义。方法 :采用全自动Hb琼脂糖凝胶电泳与Hb F碱变性试验分别同时对同一标本进行Hb F含量测定 ,比较二种方法对Hb F含量的检测结果。结果 :采用全自动Hb电泳法进行Hb F测定 ,对于6个月以内的婴儿 ,完全可以分辨出清晰的Hb F区带 ,且扫描定量与Hb F碱变性试验相符。对于成人 ,如Hb F碱变性试验Hb F测定稍高者 (含量 >3 1% ) ,电泳仍隐约可辨Hb F区带 ,扫描定量Hb F含量与Hb F碱变性试验基本一致 ;如Hb F碱变性试验测定Hb F含量在正常范围者 (1 0 %～ 3 0 % ) ,电泳便分辨不出Hb F区带 ,与Hb A一起组成Hb (A +F)区带。结论 :全自动Hb琼脂糖凝胶电泳法能够分辨出Hb F含量异常者 ,为地中海贫血的诊断提供重要数据。

十二烷基磺酸钠-琼脂糖凝胶电泳技术在蛋白尿分析中的临床应用

检验医学传统的各种尿蛋白检测方法具有相当的局限性,难以系统、全面地分析蛋白尿的类型。近年来,建立了十二烷基磺酸钠-琼脂糖凝胶(SDS-AGE)电泳技术,进行非浓缩尿蛋白电泳对尿液各种蛋白质进行分离,并对尿蛋白各组分进行扫描定量分析,可全面地判断尿蛋白的性质。该文着重介绍该技术在鉴别各种蛋白尿中的应用。

全自动电泳分析系统筛查地中海贫血的临床应用价值探讨

目的探讨全自动电泳分析系统筛查地中海贫血(简称地贫)的应用价值。方法选择2008年1～12月已被基因诊断确诊的138例地贫患者和69例非地贫患者,对其血红蛋白电泳结果进行回顾性分析。结果与基因分析法相比,全自动电泳分析系统筛查α地贫的敏感性为95.0%,特异性为91.3%,诊断准确性为93.3%,阳性预测值95.0%,阴性预测值94.0%;筛查β地贫的敏感性为98.3%,特异性为95.7%,诊断准确性为96.9%,阳性预测值95.0%,阴性预测值98.5%。结论全自动电泳分析系统具有较高的特异性和较好的敏感性,是一种筛查地贫的理想方法。

SDS-AGE尿蛋白电泳对肾脏损伤部位的实验诊断分析

目的利用法国HYDRAYS全自动电泳仪对非浓缩尿液中不同组分蛋白进行分离,区分尿蛋白类型,用于早期肾损伤的诊断和评估肾脏损伤部位。方法应用十二烷基磺酸钠-琼脂糖凝胶(SDS-AGE)进行非浓缩尿蛋白电泳。对30例原发性肾病、15例糖尿病肾损伤、5例高血压肾病患者和5例健康者(对照组)尿液样本进行分析。结果 30例原发性肾病患者尿蛋白电泳样本中非选择性肾小球蛋白尿3例、选择性肾小球蛋白尿5例、肾小管性蛋白尿4例、混合性蛋白尿18例。15例糖尿病肾损伤患者中非选择性肾小球蛋白尿2例、选择性肾小球蛋白尿3例、肾小管性蛋白尿5例、混合性蛋白尿3例、生理性蛋白尿2例。5例高血压肾病患者中非选择性肾小球蛋白尿1例、选择性肾小球蛋白尿2例、肾小管性蛋白尿1例、混合性蛋白尿1例。对照组5例均为生理性蛋白尿。结论本法具有检测敏感性高、方法简便、取材不需特殊要求,经扫描后可获取半定量结果,胶片存档易于保存等优点。

全自动毛细管电泳系统在Hb-F检测中的应用

目的:探讨Sebia Capillarys2全自动毛细管电泳系统在Hb-F含量检测中的应用价值。方法:采用法国Sebia公司Capillarys2全自动毛细管电泳系统及相应配套试剂,在9.8kV电压、pH9.4的缓冲液条件下,在8条并联的石英毛细管内进行血红蛋白电泳,用415μm波长直接检测Hb-F的含量。同时采用Hb-F碱变性试验和琼脂糖凝胶电泳对同一标本进行Hb-F含量测定,比较3种方法对Hb-F含量的检测结果。结果:采用毛细管区带电泳和Hb-F碱变性试验、琼脂糖凝胶电泳同步检测100例临床标本,Hb-F在正常范围(≤3.0%)时琼脂糖凝胶电泳无法与HbA带区分,毛细管区带电泳和Hb-F碱变性试验检测结果基本一致。Hb-F轻度增高(>3.0%)和显著增高时,3种方法所检测的结果基本一致。结论:全自动毛细管电泳系统能直接检测Hb-F含量,可替代Hb-F碱变性试验用于Hb-F异常时对地中海贫血的综合分析,为地中海贫血的筛查提供直接依据。

基于毛细管电泳的片段分析和克隆测序在脊髓小脑共济失调动态突变检测中的应用研究

目的探讨基于毛细管电泳的片段分析和克隆测序在脊髓小脑共济失调(SCA)动态突变检测中的准确性和稳定性。方法采用基于毛细管电泳的片段分析和克隆测序对14例脊髓小脑共济失调患者(包括3例SCA2型、2例SCA7型、7例SCA8型和2例SCA17型)致病基因三核苷酸重复序列进行检测。结果 3例SCA2基因样本基于毛细管电泳的片段分析显示,扩展片段胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤(CAG)重复序列分别为31、30和32次,每例样本取3个菌落进行克隆测序,CAG重复序列分别为37/40/40、37/38/39和38/39/40次;2例SCA7基因样本基于毛细管电泳的片段分析显示,扩展片段CAG重复序列分别为57和34次,1例取3个菌落进行克隆测序,CAG重复序列为69、74和75次,1例为45次;7例SCA8基因样本基于毛细管电泳的片段分析显示,扩展片段胞嘧啶-胸腺嘧啶-腺嘌呤(CTA)/胞嘧啶-胸腺嘧啶-鸟嘌呤(CTG)重复序列分别为99、111、104、92、89、104和75次,克隆测序分别为97、116、104、90、90、102和76次;2例SCA17基因样本基于毛细管电泳的片段分析显示,短片段/扩展片段CAG重复序列为37/50和36/45次,扩展片段分别取3和2个菌落进行克隆测序,CAG重复序列为51/50/52和45/44次。结论基于毛细管电泳的片段分析在判读重复序列时存在一定偏倚,但可以预估,可重复性佳,不影响基因检测结果的判定;而克隆测序具有明显不稳定性,尤其是SCA2和SCA7基因,可能与其重复序列组成较为单纯有关。克隆测序不适宜作为检测基因动态突变的方法,更不适宜作为判定动态突变序列组成的标准。

牛磺酸对经单细胞凝胶电泳技术检测人视网膜色素上皮氧化损伤的保护特征

目的:观察过氧化氢对人视网膜色素上皮细胞的氧化作用,以及牛磺酸对人视网膜色素上皮细胞的抗氧化作用。方法:实验于2005-01/09在哈尔滨医科大学公共卫生学院中心实验室完成。①人眼视网膜色素上皮细胞来源:实验眼来自20～35岁男性意外死亡后12h内捐给黑龙江省眼库作为角膜移植的供体眼5眼,家属签署知情同意书。取8～10代人眼视网膜色素上皮细胞用于实验。②过氧化氢损伤实验:将培养的细胞按随机数字表法分为5组:过氧化氢各浓度组分别加入终浓度为10,25,50,100μmol/L的过氧化氢,阴性对照组只加入等量的磷酸盐缓冲液。③牛磺酸实验:将培养的细胞按随机数字表法分为5组:阴性对照组用不含血清的DMEM-F12培养液培养,牛磺酸各浓度组分别用含有终浓度为300和600μmol/L的牛磺酸培养液进行培养。将上述每个浓度组的细胞悬液分成2份,向其中1份加入终浓度为25μmol/L的过氧化氢,另一份加入等量的磷酸盐缓冲液。④指标检测:15min后,用单细胞凝胶电泳法检测人视网膜色素上皮细胞的DNA损伤的程度,以拖尾率(彗星细胞数/总细胞数)和拖尾细胞DNA迁移距离[400倍显微镜下测量25个拖尾细胞的DNA迁移长度,整个核DNA直径和迁移DNA(即彗星尾)长度,其差值为DNA迁移距离]的变化表示。⑤统计学分析:用四格表χ2检验(确切概论法)比较组间彗星细胞拖尾率;用t检验进行组间DNA迁移距离比较。结果:①过氧化氢损伤实验结果:阴性对照组DNA荧光图像为红色圆球形,过氧化氢各组出现彗星样,随着过氧化氢浓度(10,25,50,100μmol/L)的增加,人视网膜色素上皮细胞拖尾率和DNA迁移距离均明显高于或长于阴性对照组[拖尾率:4.6%,26.0%,43.3%,86.6%,96.0%;DNA迁移距离:(4.13±0.52),(10.54±2.03),(20.59±4.42),(39.56±10.28),(51.54±15.93)μm,P<0.01]。②牛磺酸实验结果:300和600μmol/L牛磺酸组视网膜色素上皮细胞拖尾率和拖尾细胞DNA迁移距离与阴性对照组相近(P>0.05)。300和600μmol/L牛磺酸+25μmol/L的过氧化氢组均明显低于或短于25μmol/L过氧化氢组[拖尾率:22.6%,20.0%,43.3%;DNA迁移距离:(17.46±7.13),(13.56±2.52),(20.59±4.42)μm,P<0.05],且牛磺酸浓度越高,差异越大。结论:10μmol/L过氧化氢就能对人视网膜色素上皮细胞直接造成DNA断裂损伤,该作用呈剂量依赖性。适量的牛磺酸(300和600μmol/L)对人视网膜色素上皮细胞DNA的氧化断裂损伤起保护作用。

尿液蛋白定量、凝胶电泳、NAG酶联合检测对肾病的诊断价值

尿液的生化检验已广泛应用于临床,某些生化指标能很好地反映肾脏病变的性质.作者对51例健康成人、64例肾病患者、47例其他疾病患者的尿液标本进行了24 h尿蛋白定量、凝胶电泳及NAG酶的检测观察,以了解其对肾病患者的诊断价值.

七氟醚预处理对心肌缺血再灌注大鼠心肌线粒体蛋白质组学双向凝胶电泳分析

[目的]研究七氟醚预处理对缺血再灌注心肌保护的线粒体相关蛋白的变化.[方法]采用双向凝胶电泳技术对七氟醚预处理（S组）与对照组（C组）大鼠心肌线粒体蛋白质进行分离和比较分析.[结果]S组与C组相比,有21个蛋白质表达发生了改变,其中表达增强的有17个蛋白,表达降低的有4个蛋白.[结论]这些差异表达的蛋白质可能参与了七氟醚预处理对心肌的保护作用.

瑞香狼毒诱导HL-60细胞凋亡和调节SGC-7901细胞bcl-2蛋白表达(英文)

目的 探索瑞香狼素 (SC)抗肿瘤机制。方法 以 HL- 6 0和 SGC- 790 1为靶细胞 ,用 MTT比色法测定细胞增殖抑制 ,荧光显微镜观察凋亡细胞的形态学改变 ,DNA电泳和流式细胞仪检测DNA断裂 ,免疫组化检测 bcl- 2蛋白表达。结果 含 SC药物血清处理细胞 48h后 ,HL- 6 0细胞增殖呈剂量依赖性抑制 ,并表现出典型的凋亡细胞形态学改变及 DNA断裂 :即染色体聚集、核固缩、断裂及阶梯状 DNA电泳条带 ,G1 期前细胞从 11.7%增至 5 7.4% ;而 SGC- 790 1细胞 bcl- 2蛋白表达率从 78.3%下降到 32 .9%。结论 SC可诱导肿瘤细胞凋亡 ,降低 bcl- 2蛋白表达。

氟尿嘧啶影响人大肠癌细胞增殖及凋亡的分子机制

目的研究氟尿嘧啶(5-Fluorouracial,5-FU)体外影响人大肠癌Lovo细胞增殖抑制及诱导凋亡的分子机制。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)显色法,检测不同浓度5-FU作用不同时间对Lovo细胞生长所产生的不同影响;光镜观察凋亡细胞的形态特点;流式细胞术(FCM)检测凋亡细胞百分率;琼脂凝胶电泳、免疫组化SP法检测Lovo细胞增殖核抗原Ki-67及凋亡相关基因蛋白p53、Fas表达水平。结果5-FU能抑制Lovo细胞生长,在一定剂量和时间范围内,通过光镜观察,见凋亡细胞明显增多,经5-FU诱导后,用FCM分析Lovo细胞,发现凋亡百分率增加并显示剂量和时间效应。实验组细胞Ki-67表达明显低于对照组,Fas表达明显升高,而P53在诱导前后均无表达。结论5-FU能诱导Lovo细胞凋亡并抑制其增殖及侵袭性,Fas基因激活可能是触发Lovo细胞凋亡的主要机制。

细胞凋亡检测方法的研究进展

目的 对目前国内外用于细胞凋亡的检测方法进行综合评价。方法 结合国内外相关文献分析讨论细胞凋亡各种检测方法的原理及应用范围。结果 各种方法均具有一定的优缺点及应用范围。结论 选择多种适当的方法进行综合检测,常可得到较准确的结果。

硫芥对大鼠淋巴细胞DNA及白细胞介素的影响

目的 探讨硫芥中毒动物淋巴细胞的损伤特点及中毒早期白细胞介素的浓度变化作为硫芥毒性损伤诊断的可能性 .方法 分离大鼠脾淋巴细胞培养 ,经 10～ 10 0 0 μmol·L- 1 芥子气染毒 30 min,以单细胞凝胶电泳法 (SCG )检测DNA损伤 ;同时测定硫芥中毒大鼠血液 IL- 2和 IL- 6浓度 .结果 中毒后淋巴细胞 DNA迁移率和受损细胞百分率呈时间和剂量依赖关系 (r=0 .6 3,P<0 .0 1) ;培养液中 IL- 2和IL- 6浓度明显降低 ,IL- 6含量为 (46 8± 16 ) μg· L- 1 ,4 h开始下降 ,72 h降至 (177± 16 )μg· L- 1 (P<0 .0 1) ,12 0 h有所回升 ,但仍然明显低与对照 (P<0 .0 1) .其中 IL- 2几乎难以检出 .结论 硫芥中毒早期机体免疫系统受到明显抑制 ,SCG检测

原发性高血压患者GNB3基因多态性的研究

目的探讨GNB3基因多态性与原发性高血压(EH)发病的关系。方法采用聚合酶链反应结合限制性内切酶片段长度多态分析方法(PCR-RFLP)对110例40岁及以上成年人和92例EH患者GNB3基因多态性进行检测,记录性别、年龄、糖尿病史、吸烟史、饮酒史,并测定体质量指数(BMI)、腰臀比(WHR)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及空腹血糖(FPG)浓度。结果 C825T多态性位点在两组人群中的分布均符合Hardy-weinberg遗传平衡定律,EH患者中CC、CT、TT 3种基因型频率分布依次为32.2%、54.3%、13.0%;对照组3种基因型频率分布依次为30.9%、63.0%、5.5%;两组人群中825T等位基因频率分别为40.2%、37.3%,两组比较差异无统计学意义。结论 GNB3基因多态性可能与EH发病无关。

一种经济、快速的凝胶DNA回收方法

目的:用明胶海绵吸收法回收DNA片段,并验证该方法能否有效、快速的从电泳后琼脂糖凝胶中回收DNA片段。方法:将明胶海绵剪成楔形,在紫外灯照射下插入含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶中,待海绵完全膨胀后取出,离心收集DNA溶液;并用该法回收的DNA片段进行PCR扩增,检验其回收的DNA质量。结果:明胶海绵吸收法回收DNA样品的得率介于63%～98%,所回收的DNA进行PCR扩增能够获得相应的目的条带。结论:明胶海绵吸收法是一种快速、有效的DNA回收方法。

大黄素对抗顺铂引起的WI-38细胞凋亡

目的 从细胞水平研究大黄素对顺铂引起WI 38细胞凋亡的影响。方法 采用MTT法检测细胞毒性 ,用形态学观察、DNA凝胶电泳及流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 WI 38细胞经大黄素和顺铂同时处理 2 2h后 ,30mg·L- 1大黄素可明显减轻顺铂引起的细胞毒性 ,其IC50 值由 (16± 3)mg·L- 1增加至 (34± 6 )mg·L- 1;可明显抑制顺铂引起的细胞形态学改变、核异染色质边集和DNA片段化 ,使顺铂 10和 30mg·L- 1导致的细胞凋亡率由 35 .5 6 %和33.99%降至 9.2 1%和 10 .2 5 % ,S期细胞百分数由6 2 .6 6 %和 4 8.4 6 %降至 4 8.6 7%和 36 .18%。结论 大黄素可对抗顺铂所致WI 38细胞凋亡 。

慢性苯染毒小鼠DNA损伤及体内抗氧化酶的变化(英文)

背景:苯是重要的工业溶剂,长期接触可导致苯可导致DNA损伤,染色体畸变,DNA加合物的形成,基因突变等。目的:了解苯对体内DNA的损伤作用、机制以及抗氧化酶体系的变化情况。设计:随机对照的实验研究。单位:哈尔滨医科大学附属第一医院检验科,哈尔滨医科大学公共卫生学院。材料:实验在哈尔滨医科大学公共卫生学院动物室完成。选用健康雄性昆明种小鼠24只,体质量18-22g,由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供。干预:分为正常对照组、低剂量苯损伤组和高剂量苯损伤组。除对照组外,其余各组小鼠进行静式吸入苯蒸气染毒,4h/d,2个月后处死,分离骨髓细胞及外周血淋巴细胞,取肝、脾、脑组织并制备匀浆。主要观察指标:用单细胞凝胶电泳技术对骨髓细胞及外周血淋巴细胞DNA损伤进行检测;同时检测肝、脾、脑组织中超氧化物歧化酶(superoxidedismu-lase,SOD)、谷胱肝肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-Px)的活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。结果:染毒组小鼠骨髓细胞及外周血淋巴细胞彗星百分率分别为骨髓细胞(83.56±10.28)%,(92.54±15.93)%,外周血淋巴细胞(41.27±6.03)%,(65.79±11.62)%,显著高于对照组(4.13±0.52)%,(2.21±0.31)%(P<0.01),并呈剂量-反应关系。高、低浓度组小鼠肝匀浆SOD活?

核因子-κB活化与结肠直肠癌临床病理关系研究

目的 探讨核因子 - κB(NF- κB)活化与结肠直肠癌临床病理的关系。方法 应用凝胶电泳迁移率改变分析 (EMSA)检测 5 0例结肠直肠癌、30例结肠直肠腺瘤和 2 0例正常大肠组织 NF- κB的结合活性 ,并结合临床病理学资料评估其相互关系。结果 结肠直肠癌和结肠直肠腺瘤分别与正常结肠直肠组织比较 ,NF- κB结合活性明显增高 ,差异有显著性 (P<0 .0 5 ) ;结肠直肠癌和结肠直肠腺瘤比较 ,NF- κB结合活性差异无显著性 (P>0 .0 5 )。NF- κB的活化与结肠直肠癌患者的性别、病变部位、组织类型、淋巴结转移和 Dukes分期均无显著相关 (P>0 .0 5 )。结论 结论 NF- κB活化与结肠直肠癌的发生有关 。

一种从口腔拭子中提取DNA的简易方法

目的应用简便方法提取口腔拭子中DNA,并用特异引物扩增,评估该方法的应用价值。方法用1×PCR缓冲液、MgCl2及蛋白酶K混合裂解液在PCR仪上对口腔拭子进行消化,并以该产物为模板,应用角蛋白5基因1号外显子及1号染色体上2个微卫星标记特异性引物扩增,目的片段分别用于测序和毛细管电泳。结果通过上述方法可获得用于PCR反应及后续基因测序及微卫星标记毛细管电泳分型的足量DNA。结论利用PCR缓冲液、MgCl2及蛋白酶K混合裂解液从口腔拭子中提取DNA是一种简单、高效、快速、低成本的方法,更是一种无创的采样方法。