甘蔗黄叶病毒的RT-PCR检测技术

以甘蔗黄叶病毒(ScYLV)特异性引物YLSF111和YLSR462为引物,对福建蔗区8个罹病品种的疑似病株进行RT-PCR检测,扩增出352 bp特异性片段.将PCR产物克隆后测序,序列分析表明,该片段是ScYLV外壳蛋白(CP)基因的一部分,核苷酸和氨基酸序列同源性达95%以上,与美国、印度、巴西等国家ScYLV分离物(GeneBank登录号分别为AF157029、AY236971、AF141385)CP基因同源性达100%,证实我国福建地区甘蔗黄叶综合症的病原体为ScYLV.本研究同时建立了ScYLV的RT-PCR检测技术.

甘蔗黄叶病毒与花叶病毒CP基因RNAi载体构建与转化甘蔗研究

甘蔗黄叶病和甘蔗花叶病是我国甘蔗最主要的病毒病,感病品种产量下降和品质变劣,传统方法难以防治。RNA干扰技术使培育抗病毒甘蔗品种成为可能。本研究根据甘蔗黄叶病毒和侵染甘蔗的高粱花叶病毒结构与功能特性,广泛收集不同来源病毒分离物CP基因序列,经过比对选取保守序列作为干扰序列。通过在序列两端添加酶切位点,合成并连接成双价甘蔗黄叶病和花叶病毒干扰序列,然后构建到中间载体p HANNIBAL上,形成双价RNAi干扰结构,最后插入到p ART27上形成干扰表达载体。利用基因枪轰击甘蔗品种福农15号愈伤组织进行转化,经G418筛选获得抗性再生植株。通过提取DNA和RNA分析,证实双价RNAi干扰结构不仅以不同拷贝整合到甘蔗基因组中,而且得到了转录表达。

甘蔗黄叶病毒CP蛋白基因ihpRNA表达载体构建及烟草转化

为提高甘蔗抗病性,本研究根据甘蔗黄叶病毒海南分离物ScYLV-CHN-HN1全基因组序列(GenBank no.HQ342888),利用病毒CP蛋白介导的RNAi技术,针对病毒外壳蛋白CP,设计两对含有酶切位点的特异性引物,CPsf1/CPsr1和CPasf1/CPasr1,以构建好的pMD19-T/CP质粒为模板,pRNAi1017为中间载体,分别合成构建干扰载体的正反向片段pRNAi-CP-F-R,将CP正反向片段分别插入表达载体pCAMBIA2300的相应位置,构建含有发卡结构的RNAi载体p2300-CP-F-R,经过PstⅠ酶切鉴定,证明载体构建成功。通过农杆菌介导的方法,以干扰表达载体p2300-CP-F-R转化烟草,经过PCR检测,得到12株阳性转基因植株,Southern blot杂交和半定量RT-PCR对其检测,证明干扰片段已经整合烟草基因组中并进行了转录,该结果为RNAi介导抗病毒甘蔗育种研究奠定基础。

甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因原核表达研究

本研究主要目的是构建ScYLV-CP基因的原核表达载体,表达ScYLV-CP蛋白。采用PCR扩增出CP基因的蛋白编码序列,克隆到中间载体中,再经双酶切、亚克隆到表达载体中,构建该基因的表达载体pET-29 a-CP,在大肠杆菌中用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳。酶切鉴定表明表达载体内插入片段正确,在大肠杆菌中诱导后,出现一条分子量约为22 kDa蛋白带,与CP基因开放阅读框架的理论推算值21.719 kDa相符。研究表明甘蔗黄叶病毒外壳蛋白能在原核细胞中高效表达,为建立甘蔗黄叶病毒血清学快速检测技术奠定基础。

感染甘蔗黄叶病毒后甘蔗叶组织超微结构的病变

利用电镜技术对感染甘蔗黄叶病毒蔗叶组织超微结构进行观察表明,韧皮部伴胞及叶肉细胞内的线粒体、叶绿体等细胞器及细胞核都发生了明显的病理变化.线粒体形态异常,有的肿大、内嵴模糊,严重者内嵴消失,空泡化,仅剩未被消解的残骸;叶绿体被膜破裂,严重者被膜完全消解,基粒类囊体和基质片层消失,基质外流.维管束鞘细胞中的叶绿体被膜和基质片层也遭到破坏,淀粉粒增多、膨大;细胞核形态变为不规则,局部核膜破裂,核内染色质分布不均匀,呈降解状.

甘蔗黄叶病毒P0蛋白分子特性及其抑制RNA沉默活性

【目的】甘蔗黄叶病(yellow leaf,YL)是一种主要的甘蔗病毒病害,在全球多数甘蔗种植国家或地区普遍发生,已对甘蔗生产造成严重威胁。其病原为甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,SCYLV),属于黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属成员。研究SCYLV编码的沉默抑制子P0蛋白的分子特征、保守结构域及其在自然寄主甘蔗上抑制RNA沉默的功能,为下一步从RNA沉默水平解析SCYLV致病分子机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR克隆技术获得SCYLV中国分离物CHN-FJ4编码的RNA沉默抑制子基因P0及其两个缺失突变体P0Δ2-15(N端缺失15个氨基酸)和P0Δ155-256(C端缺失102个氨基酸),然后定向克隆到单子叶植物表达载体p Ubi-nos(空载体)上,获得重组质粒。利用甘蔗嫩叶组织瞬时表达系统鉴定病毒RNA沉默抑制子技术,结合Image J软件定量分析P0及其两个缺失突变体抑制外源基因EYFP瞬时表达活性的变化。番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)编码的P19作为沉默抑制子阳性对照。【结果】P0核苷酸序列的遗传进化分析结果显示,所获得的SCYLV病毒分离物CHN-FJ4为BRA基因型,与其他BRA基因型分离物氨基酸序列一致性为96.1%—98.4%。利用MEME在线软件预测P0蛋白的保守结构域,结果表明P0蛋白含有3个显著的保守区。分别位于第1—60、76—125和161—210氨基酸残基。通过Datamonkey在线服务器(http://www.datamonkey.org)提供的5种运算方法分析P0蛋白氨基酸位点的选择压力,结果显示P0蛋白具有8个氨基酸正向选择位点。将含有P0及其缺失突变体的重组质粒连同含EYFP报告基因的p TEM12质粒采用基因枪轰击法分别导入甘蔗嫩叶组织细胞,轰击后48—120 h,P0和P19逐渐地提高EYFP荧光表达点数和荧光表达水平;在120 h,与p Ubi-nos空载体(不含沉默抑制子)对照组相比,P0和P19均显著地提高甘蔗嫩叶组织EYFP荧光表达点数和荧光表达水平,分别达1.6倍和4.0倍以上。P0与P19抑制RNA沉默活性水平没有显著差异(P>0.05)。P0蛋白N端缺失15个氨基酸(P0Δ2-15)和C端缺失102个氨基酸(P0Δ155-256)均丧失了沉默抑制子的功能,荧光表达与不含沉默抑制子对照组相当。【结论】在甘蔗嫩叶组织EYFP瞬时表达体系上,P0能够显著地提高外源基因EYFP表达水平。P0蛋白N端15个氨基酸和C端102个氨基酸含有显著的保守区域,是P0发挥沉默抑制子功能所必需的。

应用多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR检测甘蔗黄叶病毒和高粱花叶病毒

基于已报道的甘蔗黄叶病毒(Sugarcane Yellow Leaf Virus,ScYLV)cp基因和高粱花叶病毒(Sorghummosaic virus,SrMV)NSP基因序列设计特异性引物,建立了针对这两种病毒的实时荧光定量PCR(real time-quantitative,RT-qPCR)检测方法。在此基础上,利用扩增产物Tm值的不同,建立了可区分ScYLV与SrMV的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR方法,两种病毒扩增产物的Tm值分别为80.8～82.8℃和84.6～86.6℃。检测数据显示:SrMV和ScYLV均有各自的特异性峰值出现,而健康植株无特异性峰值;在单独检测中的检出水平分别可达500和250 copy/μL;两种病毒Tm值的批内变异系数分别为0.03%和0.02%,批间变异系数分别为2.06%和3.12%。综上所述,所建立的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR方法在对以上两种病毒的检测中具有较好的特异性、敏感性和稳定性。

甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测体系研究

甘蔗黄叶综合症(yellow leaf syndrome,YLS后称甘蔗黄叶病)是由甘蔗黄叶病毒(sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)引起的一种重要的甘蔗病害,为更快、更准确地检测ScYLV,合成了一对特异性引物s-pf和s-pr,建立了运用SYBR Green I荧光染料法检测ScYLV的实时荧光RT-PCR体系,并对该体系的特异性、灵敏性和适用性进行了测试。结果表明:该检测体系能特异地检出ScYLV,对测试的高粱花叶病毒不能检出,灵敏度比常规PCR高100倍,适用性广。实时荧光RT-PCR检测整个过程完全闭管,无需PCR后处理且SYBR Green I荧光染料成本较低,适用于检测甘蔗体内含量较低的ScYLV病毒。

抗原直接包被间接ELISA检测甘蔗黄叶病毒

利用正交设计L9(34)方法优化甘蔗黄叶病毒(SCYLV)抗原直接包被间接ELISA实验条件,统计结果表明,甘蔗蔗汁和蔗叶SCYLV粗提液包被抗原合适体积为150μL,最佳的抗体浓度SCYLV-IgG多克隆抗体(一抗)稀释1500倍,碱性磷酸酶羊抗兔IgG(二抗)稀释20000～30000倍,最佳反应时间为1～2h。应用这一优化体系,分析甘蔗不同部位的蔗茎和不同叶位的叶片SCYLV滴度的差异,结果表明,上部甘蔗蔗茎SCYLV病毒含量显著高于中下部蔗茎组织,最高可见肥厚带叶(+1叶)及其上一叶(-1叶)的嫩叶组织SCYLV病毒含量显著高于最高可见肥厚带叶以下第2叶(+3叶)和第4叶(+5叶)的老叶组织。甘蔗幼嫩组织部位SCYLV滴度较高,更适合于病毒检测。

甘蔗黄叶病毒P0基因的克隆与原核表达及抗血清制备

根据已发表ScYLV-P0基因系列设计特异性引物,应用RT-PCR技术从甘蔗病叶的mRNA扩增得到目的 DNA片段。以pET32a(+)为原核表达载体,构建重组表达质粒pET32a-P0。经过双酶切鉴定和DNA测序后,将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)pLySs,在30℃培养条件下IPTG诱导表达。通过SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达情况。表达结果显示,在该表达系统中,融合表达蛋白P0是以包涵体形式的蛋白存在;P0融合蛋白大小约45kDa,与P0开放阅读框的理论推算值29.991 kDa加上载体自身蛋白约18 kDa相符,用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白,免疫家兔制备出抗血清,通过酶联法(ID-ELISA)测定本实验制备的ScYLY-P0抗血清工作浓度为1∶25000。

甘蔗黄叶病毒基因型研究进展

综述了世界甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)基因型的研究进展,研究表明,ScYLV为正单链RNA病毒,全基因组由5895～5899个核苷酸组成。目前基于ScYLV基因组核苷酸序列的对比可将ScYLV划分为7种基因型,其中BRA基因型为主要基因型。不同基因型的ScYLV存在致病性差异。

甘蔗黄叶病毒及其所致病害评述

甘蔗黄叶病毒是2000年国际病毒分类命名委员会第七次报告才确认的黄症病毒科未归属成员。其分布几乎遍及世界所有甘蔗产区,并已于近年传入我国南方蔗区。该病毒引起甘蔗病毒性黄叶病,经高粱蚜及玉米蚜以持久性方式传播,可能起源于黄症病毒科属间基因重组。本文简述该病毒研究概况及其在我国的发生特点。

采用分生组织培养生产脱甘蔗黄叶病毒苗(英文)

【目的】尝试使用茎尖分生组织培养技术生产UP 01235和UP 0097 2个甘蔗品种的脱甘蔗黄叶病毒(SCYLV)脱毒组培苗。【方法】以大田染病和健康甘蔗植株的不同大小茎尖分生组织为外植体,经培养获得组培幼苗。采用1对甘蔗黄叶病毒特异性引物(SCYLV-615F:5′-ATGAATACGGGCGCTAACCGYYCAC-3′和 SCYLV-615R:5′-GT-GTTGGGGRAGCGTCGCYTACC-3′)进行RT-PCR分析,在6个月内每隔1个月检查1次组培苗是否存在病毒。【结果】当以1.5 mm茎尖进行培养时,获得的2个甘蔗品种的组培苗在温室种植,在生长期间未发现存在黄叶病毒,说明黄叶病毒已被消除;而以超过1.5 mm的茎尖为外植体时,PCR分析表明结果,所获得的组培苗存在黄叶病毒。【结论】对以1.0～1.5 mm茎尖培养获得的200多株组培苗进行温室繁殖,在生长期间均未发现黄叶病毒。

广东甘蔗黄叶病田间调查及病原病毒的分子检测

广东省粤北和粤西蔗区多个县市的田间甘蔗上观察到甘蔗黄叶病（Sugarcane yellow leaf disease，SYLD）典型症状，目前该病仅局部分布，但部分田块病株率为5％～80％，发病品种有青皮果蔗、黑皮果蔗、新台糖系列品种、粤糖79／177和粤糖93／159等。采集发病田间显症叶片、无症叶片和在病叶上取食的甘蔗绵蚜（Ceratovacuna lanigera）样品，抽提总RNA，以基于甘蔗黄叶病毒（Sugarcane yellow leaf virus，SCYLV）CP基因序列的特异引物进行一步RT-PCR和巢式PCR扩增，并对扩增产物进行核苷酸序列测定和BLAST比对。结果显示，RT-PCR及巢式PCR产物核苷酸序列与分离自巴西的SCYLV B1株系相应区段同一率为100％；一步RT—PCR可从约70％的显症叶片样品中检测到SCYLV，而病田中的无症叶片样品以及在病叶上取食的单头甘蔗绵蚜样品需经巢式PCR扩增方可检测到SCYLV，阳性率分别为1％～5％和83％。本研究表明，广东省栽培甘蔗已受到SCYLV侵染，甘蔗绵蚜携带SCYLV。

甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因克隆及其实时荧光RT-PCR检测

甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,SCYLV)引起的甘蔗黄叶病是一种新的全球性病毒病害。本文以YLSCPF1和YLSCPR591为引物,采用RT-PCR方法克隆了甘蔗黄叶病毒福建分离物(CHN-FJ1)外壳蛋白(CP)基因,编码196个氨基酸。分析不同地理来源的SCYLV病毒分离物cp基因核苷酸及其推导编码的氨基酸序列,同源性达95%以上。根据cp基因的保守序列,设计1对特异性引物和TaqMan探针,建立了SCYLV的TaqMan实时荧光RT-PCR方法。结果表明,检测下限为初始质粒模板DNA 1 000拷贝/μL(约3.61 fg/μL),比常规PCR方法的灵敏度提高100倍。检测甘蔗花叶病毒、宿根矮化病菌和黑穗病菌,没有典型的扩增曲线和无Ct值。应用实时荧光RT-PCR、常规RT-PCR和组织印迹免疫杂交(TBIA)对田间甘蔗叶片样品进行检测,阳性检出率分别为100%、61.5%和69.2%,表明该方法比常规RT-PCR和TBIA具有更高的灵敏度,适合于对SCYLV的检测。

甘蔗黄叶病毒P0蛋白基因细菌双杂交诱饵载体的构建和自激活鉴定

由甘蔗黄叶病毒所引起的甘蔗黄叶病是甘蔗生产中潜在的重要病毒病害之一。该病毒属黄症病毒科(Luteoviridae)中的马铃薯卷叶病毒属(Poleroviruses)。根据甘蔗黄叶病毒海南分离物(SCYLV-CHN-HN1)全基因组序列(Gen Bank No.HQ342888),设计P0蛋白基因的一对特异性引物P0-Bait F/P0-Bait R。以实验室保存的重组质粒p MD18T-P0为DNA模板,PCR扩增P0蛋白基因。然后将P0蛋白基因和细菌双杂交诱饵质粒p BT分别进行双酶切后,连接构建重组诱饵质粒p BT-P0。经PCR扩增、双酶切鉴定和序列分析,表明获得了细菌双杂交重组诱饵载体p BT-P0,且编码框正确。将重组载体p BT-P0转化细菌双杂交系统Bacterio Match RⅡScreening Reporter感受态细胞,进行自激活和毒性验证。结果显示p BT-P0重组载体在细菌双杂交系统中无自激活作用及毒性作用,表明本试验构建的p BT-P0可应用于该系统筛选与之互作的寄主蛋白。

甘蔗黄叶病毒运动蛋白的原核表达和抗血清制备

甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)属于黄症病毒科(Luteoviridae)、马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus),主要由蚜虫传播,能够侵染甘蔗、玉米等多种作物,引发严重的植物病害。本研究将编码ScYLV运动蛋白(Movement protein,MP)的基因连接到pDB-His-MBP原核表达载体上,转化到大肠杆菌菌株Rosetta中,经IPTG诱导,表达分子量大小约为70 kDa的融合蛋白,将纯化后的融合蛋白制备多克隆抗血清。利用western blot检测抗血清的效价为1∶128000,灵敏度为1∶256,抗血清不与马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)的其它病毒以及黄症病毒属(Luteovirus)病毒发生交叉反应,具有很好的特异性。本文制备的ScYLV MP抗血清可以用于ScYLV的检测,并为深入研究ScYLV与寄主的相互作用等问题提供材料基础。

广西地区甘蔗黄叶病病毒分子鉴定

[目的]为广西甘蔗黄叶综合征(YLS)的分子检测和抗病育种提供参考。[方法]采集显症甘蔗叶样本,通过提取总RNA,利用引物P1/P2对样本进行反转录RCR(RT-PCR)扩增,对广西地区甘蔗黄叶病的病原体进行分子鉴定。[结果]经引物P1/P2扩增出630bp的目的片段。氨基酸和核苷酸序列分析结果表明,该片段是甘蔗黄叶病毒(SCYLV)外壳蛋白基因的一部分,与其他国家SCYLV分离物同源性达95%～99%。[结论]广西甘蔗黄叶病病原确是SCYLV,该病毒可能是近年从区外或境外传入的。

福州地区甘蔗黄叶病病原分子鉴定及电镜检测

电镜观察表明,感病甘蔗叶片的韧皮部伴胞内存在着大量类似甘蔗黄叶病毒(SCYLV)的病毒粒子;利用RT-PCR扩增出556bp的目的片段,氨基酸和核苷酸序列分析表明,该片段是SCYLV外壳蛋白基因的一部分,与其他国家SCYLV分离物同源性达95%以上;应用组织印迹杂交免疫检测技术,在YLS病症的叶片中脉韧皮部出现紫红色斑块,呈阳性反应。综合分析认为福州地区甘蔗黄叶病的病原体为SCYLV。

华南地区甘蔗黄叶病发生及甘蔗绵蚜传毒特性研究

【目的】明确甘蔗黄叶病毒(sugarcane yellow leaf virus,SCYLV)在华南地区的发生与危害情况,检验华南地区甘蔗上普遍发生的甘蔗绵蚜的传毒特性。【方法】对华南地区多个甘蔗产区主要甘蔗品种黄叶病发生情况进行田间调查,采用RT-PCR技术扩增病毒CP基因并对扩增产物进行测序分析,建立能够检出单头蚜虫及侵染早期未现症植株体内SCYLV的巢式RT-PCR检测技术,测定甘蔗绵蚜传毒寄主范围及传毒效率。【结果】华南地区果蔗和糖蔗均已受到SCYLV的侵染,大多田块病株零星分布,病株率0.5%～10%,但少数田块病株率超过80%。大多数SCYLV分离物CP基因核苷酸序列与SCYLV巴西分离物(SCYLV-B1)相应基因序列高度同源。甘蔗绵蚜除能在甘蔗植株间高效传播SCYLV外,还可将病毒传至高粱、水稻及玉米幼苗,但未能传至小麦和香蕉。【结论】SCYLV为近年自境外传入的甘蔗病毒病原,已在华南多个蔗区有分布,目前仅处于零星发生状态。首次证实甘蔗绵蚜是SCYLV传播媒介,能将病毒传至高粱、水稻和玉米等其它禾本科作物。SCYLV的潜在威胁应引起足够重视。