生物素化壳聚糖纳米粒的制备及其相关性质

制备了生物素化的壳聚糖纳米粒(biotinylated chitosan nanoparticles,Bio-CS-NP)并测定其相关性质,以此作为抗癌药物的载体。制备过程为:先用磺酸琥珀酰亚胺生物素与壳聚糖反应生成生物素化的壳聚糖(biotinylatedchitosan,Bio-CS),再采用氯化钠沉淀法制备Bio-CS-NP。采用试剂盒测定Bio-CS-NP表面配体连接密度,用透射电镜和激光粒度分析仪分别检测纳米粒的形态和粒径,并比较了人肝癌HepG2细胞对Bio-CS-NP和未经生物素修饰的壳聚糖纳米粒(chitosan nanoparticles,CS-NP)的摄取情况。结果显示,Bio-CS-NP表面配体连接密度为2.2 biotin CS;纳米粒形态为圆球形,表面光滑,平均粒径为296.8 nm,多分散指数为0.155;HepG2细胞对Bio-CS-NP的摄取能力显著高于CS-NP(P<0.05)。以上研究结果表明Bio-CS-NP有望成为一种新型的药物载体,用于抗癌药物对癌细胞的主动靶向。生物素的检测方法简便、可行。

生物素化壳聚糖修饰的PLGA纳米粒的制备及表征

合成了生物素化壳聚糖(Bio-CS),并通过核磁共振(1HNMR)及电感耦合等离子体光质谱法(ICP-MS)对其进行结构确证.采用溶剂挥发法(W1/O/W2)制备聚乳酸-羟基乙醇酸(PLGA)纳米粒,并通过共价交联法对纳米粒进行Bio-CS表面修饰.未修饰的PLGA纳米粒在扫描电镜下观察呈规则球状形态,平均粒径为(248.4±21.0)nm,Zeta电势为-(21.21±2.13)mV,Bio-CS修饰后的PLGA纳米粒保持球状形态,平均粒径为(268.3±23.4)nm,Zeta电势为(25.45±2.59)mV.采用X射线光电子能谱(XPS)以及试剂盒对纳米粒表面生物素进行定性及定量研究,结果显示,经过Bio-CS修饰后的纳米粒表面含有N,S元素,生物素取代度为31%的Bio-CS修饰的PLGA纳米粒,其表面生物素含量为(1.36±0.34)μmol/100mg纳米粒.

可溶性HLA-A2-肽复合物的体外折叠与生物素化

目的 :可溶性HLA A2 抗原肽复合物的体外折叠复性与生物素化。方法 :原核高效表达的HLAH链及 β2m,在抗原肽 (EB病毒的膜潜伏蛋白LMP2A的NH2 CLGGLLTMV COOH残基 )的存在下 ,通过稀释复性折叠成HLA A2 抗原肽复合物 ,并在BirA酶的作用下进行生物素化 ,使生物素结合到HLA A2 抗原肽复合物中的H链C端。利用特异性抗体 (mAbW6 / 32和兔抗人 β2m抗体 )及链霉亲合素进行ELISA和Westernblot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。结果 :折叠复合物中 ,主要含有HLAH链聚合体、HLA A2 肽复合物单体及 β2m3种成分 ,其中H链聚合体与HLA A2单体可生物素化。结论 :成功地获得生物素化的HLA A2 抗原肽复合物单体 ,为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础 ,也为过程复杂的HLA

通过生物素化标记分析细胞膜亚蛋白质组

细胞膜在许多基本生物学作用过程中扮演着重要角色,比如细胞-细胞相互作用、信号转导和物质运输.分析不同生理或病理状态细胞的膜蛋白的表达变化,有助于了解这些生物学过程以及发现新的诊断、治疗靶位.成功地进行膜蛋白分析最重要的是获得足够浓度与纯度的膜蛋白.这里报告一种分离高纯度膜蛋白的方法,主要包括三个步骤:(1)生物素化活细胞表面的膜蛋白,(2)链亲和素琼脂糖亲和吸附,(3)强烈的清洗条件去除非特异吸附的胞质蛋白.最后用化学方法洗脱生物素标记的膜蛋白进行双向电泳分离分析.用该方法制备了HeLa细胞的膜蛋白.免疫印迹结果表明,生物素标记的膜蛋白基本上都是低丰度蛋白.这样制备得到的膜蛋白双向电泳分离出2400多个蛋白质点,而且大多数点的亮度相近,分布得相对分散没有聚集成群.这种图谱非常便于比较分析找到差异蛋白.多次重复制备膜蛋白、电泳表明该方法的重复性和稳定性很好.

热稳定生物素化荧光素酶的制备及其在焦测序中的应用

新一代大规模焦测序技术需要稳定的可固定化的荧光素酶,为了制备热稳定性好且被生物素化的荧光素酶,本研究采用基因工程方法将生物素羧基载体蛋白C端87个氨基酸残基(BCCP87)与荧光素酶在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行融合表达,以实现菌体内直接表达生物素化的荧光素酶(BCCP-LUC);并对北美萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶基因进行了定点突变以增强其热稳定性;用链亲和素包被的磁珠对重组融合蛋白进行固定化,用于焦测序。实验结果表明:突变后的荧光素酶在50℃环境中仍具有活性;在43℃下10min活性保留大于80%,热稳定性明显增强。Western blot分析结果表明,荧光素酶能够在大肠杆菌内生物素化。用链亲和素包被的磁珠结合BCCP-LUC后具有较高活性(2.1×105RLU/μL Beads),经过多次洗涤活性无明显下降。采用微球固定的荧光素酶以及ATP硫酸化酶成功的进行了DNA序列的测定且定量准确,表明固定化的荧光素酶可以应用于焦测序中,为建立高通量大规模芯片焦测序技术提供有效、稳定的工具酶。

生物素化抗AIB1单克隆抗体的制备及应用研究

目的用生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)对纯化抗AIB1单克隆抗体1A2E1进行标记,并应用标记后单克隆抗体对靶细胞中AIB1蛋白进行检测。方法用BNHS与纯化抗体1A2E1交联,制备Biotin-1A2E1,用竞争抑制ELISA法及免疫细胞化学法检测Biotin-1A2E1的生物学活性。结果所制备的生物素化抗体活性高,效价为1∶3200,用于检测乳腺癌细胞中AIB1蛋白敏感性好。结论成功制备生物素化抗体Biotin-1A2E1,并可初步应用于靶细胞AIB1蛋白的检测,为肿瘤辅助诊断中AIB1蛋白的检测提供有力手段。

实时生物分子相互作用分析技术用于链霉亲和素-生物素化抗体的层层组装研究

使用生物分子相互作用分析 ( Biomolecular interaction analysis,BIA)技术实时监测了在链霉亲和素表面层层组装亲和素 -生物素化抗体多层膜的过程 ,结果表明 ,通过链霉亲和素与生物素之间的强亲和作用 ,能够在表面形成均一的多层膜 ,并用实时 BIA技术求得了每层蛋白质的表面浓度 .对于生物素化抗体 ,单层吸附表面浓度为 1 .32 ng/mm2 ;对于链霉亲和素 ,单层吸附表面浓度为 2 .93ng/mm2 .

猪MHC-Ⅰ α生物素化序列融合基因的构建、表达与纯化

采用RT-PCR技术从猪外周血单核细胞(PBMC)中获得猪白细胞抗原基因座P1、P14等位基因的胞外区,并在其3′端拼接上依赖BirA酶的可生物素化序列(BSP),构建了pET-P1-BSP和pET-P14-BSP高效表达载体并进行诱导表达和纯化,用SDS-PAGE和Western blotting法对表达产物进行鉴定。结果显示,成功构建了融合表达载体pET-P1-BSP和pET-P14-BSP,表达产物以包涵体的形式存在,获得高纯度的P1-BSP和P14-BSP蛋白,为进一步利用亲和素在体外构建SLA-I类分子肽四聚体奠定了基础。

生物素化ATP硫酸化酶的表达、固定化与应用

现代大规模焦测序技术的产生是DNA测序技术的一次革命,其关键技术之一是得到高活性的、固定于磁性微球表面的ATP硫酸化酶.生物素化的ATP硫酸化酶可以通过生物素与亲和素之间的特异结合特性固定在包被亲和素的磁性微球表面,但是利用化学修饰法将ATP硫酸化酶进行生物素化修饰很可能会影响酶的活性.利用融合表达策略,将大肠杆菌生物素酰基载体蛋白C端87个氨基酸肽段(BCCP87)与ATP硫酸化酶在大肠杆菌内融合表达,经SDS-PAGE和Westernblot分析,表达的融合蛋白分子质量约为64ku,并且能够在大肠杆菌内被生物素化.生物素化的ATP硫酸化酶能够与亲和素包被的磁珠结合,固定后的ATP硫酸化酶具有活性,并且能够用于定量检测焦磷酸盐(PPi)和焦测序,为今后建立高通量大规模焦测序系统提供了一个有效的工具酶.

生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物的制备

目的制备生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物。方法将原核高效表达的sHLA-A*2402-BSP融合蛋白及β2m和HLA-A*2402限制性抗原肽EB病毒BRLF1蛋白中的九肽NH2-TYPVLEEMF-COOH进行稀释、复性、折叠,形成HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,并在BirA酶作用下进行生物素化,使生物素结合到HLA-A*2402-抗原肽复合物中H链C端的BSP序列上形成生物素化的sHLA-A*2402-抗原肽复合物单体。利用特异性单克隆克体(W6/32和兔抗人2β微球蛋白抗体)及链霉亲合素进行ELISA和Western blot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。结果折叠复合物中,主要含有HLA-A*2402-肽复合物单体及β2m两种成分,其中HLA-A*2402-肽复合物单体可生物素化。结论成功制备出生物素化的HLA-A*2402-抗原肽复合物单体,为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础。

生物素化胆甾醇基普鲁兰糖合成及其自聚集性质

通过酯化反应将生物素接枝于胆甾醇基普鲁兰糖链上,获得不同取代度的生物素化胆甾醇基普鲁兰糖(Bio-CHSP)衍生物.采用氢核磁(1 H NMR)和X线粉末衍射法(XRD)共同验证Bio-CHSP材料的成功合成,并用1 H NMR法确定Bio-CHSP的生物素取代度.Bio-CHSP改性材料具有两亲性,透射电镜(TEM)显示,可在水中自聚集成球型纳米粒.动态激光粒度分析仪(DLS)测定表明,Bio-CHSP纳米粒带负电荷且粒径随生物素取代度增大而减小.以芘为荧光探针,采用稳态荧光法测定Bio-CHSP纳米粒水溶液的临界聚集浓度(CAC),其CAC随生物素取代度的增大而减小.Bio-CHSP材料在水中表现出良好的自聚集特性,有望成为一种新型抗肿瘤药物的纳米载体.

可生物素化H-2K^d-BSP融合蛋白的原核表达和纯化

目的构建可生物素化的H-2Kd-BSP融合基因的表达载体,原核表达H-2Kd-BSP融合蛋白,以制备H-2Kd-肽四聚体。方法采用RT-PCR技术从小鼠SP2/0细胞中克隆小鼠MHC-Ⅰ类分子H-2Kd基因的胞外区,拼接上依赖BirA酶的可生物素化序列(BSP)后,插入pET-22b高效表达载体多克隆位点,诱导表达后对表达产物进行纯化,用Western印迹法分析鉴定纯化融合蛋白。结果成功构建pET-H-2Kd原核表达载体,测序证实H-2Kd-BSP融合基因序列正确。pET-H-2Kd原核表达载体可在大肠杆菌BL21中高效诱导表达H-2Kd-BSP融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的36%,主要以包涵体形式表达;经反复洗涤纯化,纯化蛋白纯度可达90%以上。纯化蛋白可被H-2Kd分子特异性单克隆抗体SF1-1.1所识别。结论可生物素化H-2Kd-BSP融合蛋白的原核表达和纯化为进一步制备H-2Kd-肽四聚体奠定了实验基础。

抗杀螟硫磷生物素化纳米抗体的制备及其在免疫检测方法中的应用

本研究制备了一种抗杀螟硫磷生物素化纳米抗体并将其应用于免疫分析方法检测食品中杀螟硫磷残留。将杀螟硫磷人工抗原免疫羊驼,四次免疫后从外周血单核细胞获取羊驼的重链抗体可变区(VHH)基因,构建了纳米抗体基因文库,库容量为107 cfu。通过噬菌体表面展示技术进行四轮淘筛,得到9株不同序列的纳米抗体,优选了灵敏度最高的Nbsm6克隆。将Nbsm6基因克隆到pINQ载体中进行定向生物素化并可溶性表达与纯化,用于构建间接竞争酶联免疫分析方法。在最优工作条件下,该方法检测杀螟硫磷半抑制浓度(IC_(50))为2.0 ng/mL,线性范围(IC_(20)~IC_(80))为0.6~6.9 ng/mL,检测限(IC_(10))为0.3 ng/mL。选择白菜、生菜及橘子为样品进行添加回收实验,样品经QuEChERS净化后稀释20倍可消除基质效应,添加回收率在88.9%~117.4%之间,变异系数(CV)在6.2%~16.3%之间。该方法灵敏度高,样品前处理方便,可用于杀螟硫磷的快速筛查。

生物素化葡聚糖胺顺行追踪标记大鼠皮质脊髓束

目的:探讨生物素化葡聚糖胺(BDA)对皮质脊髓束(CST)示踪的应用价值。方法:采用成年SD大鼠40只,随机分为单侧锥体束损伤组(n=24)、假损伤组(n=8)和正常组(n=8)。在锥体交叉上方选择性切断左侧锥体建立单侧锥体束横断损伤模型。运用Rivlin斜板试验进行运动功能检测。在双侧感觉运动皮层多点分层立体定位注射BDA,BDA注射14天后取脑和脊髓切片进行ABC免疫组织化学染色显示BDA标记信号,观察皮质脊髓束的走行。结果:Rivlin斜板试验显示单侧锥体束横断损伤组倾斜平面临界角度变化明显小于正常对照组和假损伤组(P<0.05)。正常组和假损伤组大鼠BDA示踪显示BDA标记阳性细胞定位于双侧感觉运动皮层的锥体细胞,锥体细胞发出的BDA阳性纤维束对称分布于双侧皮层、内囊、大脑脚、脑桥基底部、延髓锥体中的皮质脊髓束内,继而经锥体交叉到脊髓后索,在双侧后索最深层、灰质后连合背侧下行至脊髓骶段。锥体束横断损伤大鼠在损伤部位以上可见双侧对称的BDA阳性纤维束,损伤平面以下在右侧延髓锥体和左侧脊髓后索中见有BDA阳性纤维束,损伤侧锥体和右侧脊髓后索中未见有BDA阳性纤维束。结论:BDA顺行示踪技术可以清楚地显示皮质脊髓束,对皮质脊髓束损伤与修复的形态学研究具有较好的应用价值。

生物素化抗细胞因子单克隆抗体的制备

目的探讨生物素化单克隆抗体的制备方法。方法应用经超滤、硫酸铵沉淀、Protein G亲和层析纯化的来源于杂交瘤细胞培养上清中的大鼠抗小鼠 IL - 5、IL - 4和 IFN -γ单克隆抗体 ,以每 mg抗体加入生物素制剂 80μg室温反应6 0 min,其反应液经 Sephadex G- 2 5层析纯化 ,然后用生物素 -亲和素 EL ISA法测定所制备的生物素化抗体活性。结果该法制备的生物素化抗体活性高 ,用于检测感染巴西钩虫的 IL - 5转基因小鼠和非转基因小鼠的血清标本敏感性好。结论该生物素化抗体的制备方法具有制备简单、稳定性好等优点。

生物素化微细纤维肽修饰IGF-1对急性心肌梗死兔血清炎性因子的影响

目的探讨生物素化微细纤维肽修饰胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对急性心肌梗死(AMI)兔血清炎性因子的影响。方法将28只新西兰白兔随机分为对照组和实验1组、实验2组、实验3组,每组7只。对照组行假手术,实验1、2、3组建立AMI模型。建模成功后,实验1组注射生物素化微细纤维肽修饰的IGF-1,实验2组注射未修饰的IGF-1,对照组和实验3组注射等剂量的生理盐水。干预1周后,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清白细胞介素-6(IL-6)、超敏C-反应蛋白(hs-CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。结果干预1周后,与对照组比较,实验1、2、3组血清IL-6、hs-CRP、TNF-α水平均显著升高(均P<0.05);与实验3组比较,实验1、2组血清IL-6、hs-CRP、TNF-α水平均显著降低(均P<0.05);与实验2组比较,实验1组血清IL-6、hs-CRP、TNF-α水平均显著降低(均P<0.05)。结论 IGF-1和生物素化微细纤维肽修饰的IGF-1均能够显著降低AMI兔炎性因子的水平,但生物素化微细纤维肽修饰的IGF-1效果更优。

生物素化微细纤维肽修饰IGF-1对急性心肌梗死兔左心室重构的影响

目的探讨生物素化微细纤维肽修饰胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对急性心肌梗死兔左心室重构的影响。方法将28只健康的、雄性新西兰白兔随机分为对照组和实验1组、实验2组、实验3组,每组7只。将实验1、2、3组的冠状动脉左前降支结扎来建立兔急性心肌梗死模型,对照组不结扎冠状动脉左前降支。模型建立后,实验1组注射生物素化微细纤维肽修饰的IGF-1,实验2组注射未修饰的IGF-1,实验3组和正常对照组注射0.9%氯化钠注射液。分别检查各组干预6～8h后和干预1、8周后的心电图(ECG),干预1、4、8周后左心室舒张末期内径(LVEDd)、左心室射血分数(LVEF)、心输出量(CO)的水平。结果实验3组干预8周后ECG示出现宽大的病理性Q波。实验1、2、3组干预1、4、8周后LVEDd水平均显著高于对照组,LVEF、CO水平均显著低于对照组(均P<0.05)。干预1、4、8周后,实验1、2组LVEDd水平均显著低于实验3组,且实验1组又均显著低于实验2组(均P<0.05);实验1、2组LVEF、CO水平均显著高于实验3组,且实验1组又均显著高于实验2组(均P<0.05)。结论生物素化微细纤维肽修饰IGF-1能显著改善兔急性心肌梗死后心脏的缺血及左心室重构,且有利于心肌功能的修复。

生物素化微细纤维肽结合IGF-Ⅰ对兔心肌细胞Akt蛋白表达及磷酸化的影响

目的探讨生物素化微细纤维肽结合IGF-Ⅰ后对兔心肌细胞Akt蛋白表达及磷酸化的影响。方法体外培养胎兔心肌细胞,分别以生物素化微细纤维肽结合的IGF-Ⅰ和未结合的IGF-Ⅰ诱导Akt磷酸化,检测Akt、p-Akt蛋白表达,肌钙蛋白表达。结果与未结的IGF-Ⅰ相比,生物素化微细纤维肽结合的IGF-Ⅰ心肌细胞Akt、p-Akt、肌钙蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。结论生物素化微细纤维肽结合的IGF-Ⅰ不但保留了IGF-Ⅰ的生物蛋白活性,并且能加强和延长其作用,增强Akt、p-Akt、肌钙蛋白表达,增加蛋白质合成。

生物素化葡聚糖胺逆行标记检测嗅鞘细胞移植对视神经损伤后视网膜神经节细胞存活的影响

目的通过生物素化葡聚糖胺(biopinylated dextan amine,BDA)逆行标记的方法,检测移植嗅鞘细胞对视神经损伤后视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGCs)存活的影响;观察BDA逆行标记RGCs效果。方法培养纯化嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs),并进行活性鉴定。取纯度为95%活性最高OECs种植于10只成年SD大鼠(雌雄不限)视神经吸断处,另设10只行单纯吸断伤作为对照,两组均于术后存活4W,做视网膜铺片,记数各象限同一视野下BDA荧光标记RGCs数。结果各视野下,移植OECs组荧光标记RGCs数均显著高于对照组(P<0.01);RGCs胞体及轴突轮廓清晰。结论OECs可有效保护RGCs,减缓其凋亡速率;BDA逆行标记RGCs效果理想,可进一步推广应用。

抗生物素化三聚氰胺人源单链可变区抗体筛选与鉴定

目的筛选生物素化三聚氰胺人源单链可变区(scFv)抗体,为研究相关快速检测试剂盒创造条件。方法本试验利用生物素化三聚氰胺为包被抗原,从半合成噬菌抗体库中筛选其特异性噬菌体抗体片段。即采用菌噬体表面展示技术,以链亲和素-生物素标记的三聚氰胺为固相包被靶抗原,把靶抗原包被在免疫平板上,加入噬菌体抗体库,则头部带有能与靶抗原特异性结合的抗体分子的噬菌体就被固定在免疫平板上,不能特异结合的噬菌体则被漂洗掉;将特异结合的噬菌体洗脱下来,侵染大肠杆菌,就可以得到含抗体基因的噬菌粒。结果从半合成的菌噬体单链可变区抗体库中经过3轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程后,获得抗原特异性和结合性较强的生物素化三聚氰胺scFv片段。结论酶联免疫吸附试验等进行鉴定后,筛选得到了抗生物素化三聚氰胺的噬菌体抗体基因片段,为下一步亲和力鉴定、蛋白表达及开发相关检查试剂盒奠定了基础。