生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定双酚A

建立了可用于快速、灵敏地检测双酚A的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法,测得最佳实验条件为包被抗原浓度为13.8 mg/L、抗体稀释为2.4×105倍,生物素化二抗和酶标亲和素的最佳稀释倍数分别为2000倍和500倍.在优化条件下,方法的线性范围0.2～1000 μg/L;最低检出限0.05 μg/L.所建立的方法用于食品和唾液中双酚A含量的测定,样品处理简单,结果满意.

双抗体夹心生物素-亲和素ELISA法检测相思子毒素

目的建立相思子毒素(abrin)的酶联免疫检测方法,为abrin临床诊断、中毒治疗、法医学鉴定等应用领域提供技术基础和参考依据。方法采用双抗体夹心生物素-亲和素ELISA法来检测微量abrin。结果该法检测abrin线性范围为0.125～31.25μg/L,线性回归方程为Y=0.52369X+0.51632(r=0.9816,P<0.0001,n=9),检测限为0.125μg/L。不同浓度蓖麻毒素(ricin)、葡萄球菌肠毒素(SEB)对检测结果基本无干扰,表明该法检测abrin具有很好的特异性。该法能用于abrin毒素污染水样、土样、食品、血液等模拟样品的分析,相对标准差为2.35%～4.14%,具有较好的重现性。结论成功建立了夹心BA-ELISA法检测abrin,巧妙地将多克隆抗体的强富集能力、单克隆抗体的特异性以及生物素-亲和素系统的放大作用结合起来,达到了提高检测的灵敏度和特异性的目的,可适用于各种微量abrin样品的分析。

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定二乙基磷酸酯类有机磷农药

基于生物素和亲和素之间发生特异性反应,形成多酶系统,建立了二乙基磷酸酯类有机磷农药的竞争酶联免疫分析技术和生物素-亲和素放大酶联免疫分析技术。在优化条件下,二乙基磷酸酯类有机磷农药浓度在1×10-1～1×104mg/L范围内与抑制率线性关系良好,其线性回归方程为y=0.1168x+0.6259(r=0.9889),半抑制浓度和检出限分别为34 mg/L和0.0248 mg/L,与间接竞争酶联免疫分析方法相比,在交叉反应率基本不变的情况下,检测灵敏度和检测范围都得到显著提高,实际样品的加标回收率为70.1%～117.8%,基本满足痕量物质分析的要求。

基于生物素-亲和素放大的SPR传感器检测大肠杆菌研究

建立了一种基于表面等离子体共振(SPR)技术的大肠杆菌特异性快速检测方法。采用EDC/NHS将葡聚糖修饰的CM5芯片表面活化,通过亲和素固定生物素标记的二抗(羊抗兔IgG抗体),利用一抗(兔抗大肠杆菌ATCC25922单克隆抗体)和二抗反应,将兔抗大肠杆菌单克隆抗体固定在传感芯片表面。利用一抗和二抗的质量扩增效应和生物素-亲和素的多级放大效应,实现了对低浓度大肠杆菌ATCC25922的快速检测,提高了SPR传感器灵敏度。利用NaOH溶液对芯片再生,可对多个不同浓度样品进行检测,采用相对响应单位(RU)记录数据。本传感芯片对大肠杆菌ATCC25922响应的线性范围为1.5×102 CFU/mL～1.5×107 CFU/mL,检测限为1.5×102 CFU/mL,相关系数r为0.981 5。这种方法简便快捷,有望成为一种在线检测治病菌的有力手段。

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定呋喃西林代谢物

目的建立竞争生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法(biotin-avidin enzyme linked immumosobent assay,BA-ELISA)检测呋喃西林代谢物。方法采用棋盘法确定单克隆抗体和包被原的最佳稀释倍数,通过单因素试验优化辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(streptavidin-horseradish peroxidase,SA-HRP)稀释倍数、封闭液浓度、竞争反应时间、生物素标记羊抗鼠二抗(biotinylated goat anti-mouse Immunoglobulin G,Biotin-IgG)孵育时间、SA-HRP孵育时间和显色时间,建立标准曲线,并对方法的灵敏度、特异性、准确度和精密度进行方法学评价。结果最佳实验条件为:包被原稀释倍数为1:800,单克隆抗体稀释倍数为1:12800,SA-HRP稀释倍数为1:8000,封闭液为1%的脱脂乳,竞争反应时间为30 min,Biotin-IgG孵育时间为30 min,SA-HRP孵育时间为60 min,显色时间为15 min;在优化条件下,线性方程为Y=-0.3299X+0.4272(r^2=0.990),IC_(50)为0.601ng/m L,线性范围为0.074~4.883 ng/m L;加标回收率为88.8%~98.5%,批内变异系数(coefficient of variation,CV)和批间CV分别为1.2%~3.6%和2.5%~5.1%,建立的方法与其他结构类似物及衍生化试剂的交叉反应率(cross reactivity,CR)均小于0.1%。BA-ELISA与高效液相色谱-串联质谱法的回收率均在85%~115%范围内。结论 BA-ELISA法灵敏度高、特异性好、重现性好,可适用于动物组织中呋喃西林代谢物的快速筛查。

人血清癌胚抗原的生物素-亲和素ELISA检测方法的建立

目的:建立检测血清癌胚抗原(CEA)的高灵敏度生物素-亲和素酶联免疫检测(BA-ELISA)方法。方法:亲和层析纯化得到CEA,免疫新西兰家兔制备多克隆抗体。将得到的抗体连接生物素和辣根过氧化物酶,在生物素化BSA包被的96微孔板上建立生物素-亲和素ELISA(BA-ELISA)。对这一体系的线性、灵敏度、特异度、稳定性、回收率等参数进行鉴定,并和常规ELISA、放射免疫检测以及化学发光法相比较检测了临床标本中的CEA浓度。结果:线性检测范围为(0.42～50)U/mL,检测结果表明,体系稳定性良好;灵敏度为0.42 U/mL,批内、批间差异均小于10.0%。该研究建立的方法与常规ELISA对比差异有统计学意义,与放射免疫检测对比差别无统计学意义。与化学发光法相比较,回归方程为:y=0.04825+0.99674x,r=0.994,差异无统计学意义。结论:建立的CEA的BA-ELISA检测方法易于操作、灵敏度高、价格低廉,适合应用于临床检测。

基于生物素-亲和素系统的压电免疫传感器检测相思子毒素研究

利用生物素-亲和素系统的放大作用和纳米金质量扩增效应,建立了压电免疫传感器检测相思子毒素的新方法。首先在石英晶体的金电极上依次组装二巯基丙酸、EDC和NHS进行表面修饰,然后通过亲和素固定生物素标记相思子毒素多抗来制备敏感膜,利用纳米金的质量扩增效应设计了一种"毒素-纳米金标记单抗"复合物,成功实现了对相思子毒素的检测,提高了传感器灵敏度和重现性。本传感器对相思子毒素响应的线性范围为0.05～5mg/L;回归方程为Δf=50.81CAbrin+67.11(r=0.9903,n=10,P<0.0001);检测灵敏度为50.81Hz.L/mg。

生物素-亲和素系统在压电免疫传感器中质量放大作用研究

生物素－亲和素系统（ＢｉｏｔｉｎＡｖｉｄｉｎＳｙｓｔｅｍ，ＢＡＳ）是７０年代后期迅速发展起来的一种新型生物放大系统，具有高灵敏度、高特异性以及简便、经济、快速等优点，在现代生物免疫学领域中已得到广泛的应用［１］．我们首次将生物素－亲和素系统用于压电免...

^(99)Tc^m-DTPA-生物素-亲和素预定位技术用于肿瘤放免显像

目的 评价用99Tcm 替代111In标记生物素 亲和素系统 (BAS)在肿瘤放免显像预定位中的价值。方法 DTPA 生物素溶液中加入99Tcm 淋洗液 ,室温放置 10min。荷LA 795肺癌鼠分成荷瘤7d肺无转移组和荷瘤 15d肿瘤肺转移组。采用三步法预定位技术给药 ,先注射生物素化C5 0抗体 ,1d后注射亲和素 ,再过 2d注射99Tcm DTPA 生物素 ,设对照和空白组 ;并与常规99Tcm 直接法标记C5 0抗体放免显像比较。结果 99Tcm DTPA 生物素的标记率大于 90 % ,亚锡量是影响标记率的重要因素。注射后 2h ,三步法组肿瘤摄取量为 (1.35± 0 .45 ) %ID/g ,瘤 /血比值 (T/B)为 5 .86 ,瘤 /肌肉比值(T/M)为 8.43。而对照直接注射99Tcm DTPA 生物素组的T/B为 0 .85 ,T/M为 1.1。99Tcm 直接法标记C5 0放免显像组在注射后 8h的T/B为 1.6 5 ,T/M为 2 .0。注射后 2h平面显像 ,三步法组肿瘤显影清晰 ,余各组肿瘤均未显影。结论 99Tcm DTPA 生物素可用于三步法肿瘤放射免疫显像 。

CA125的生物素-亲和素酶联免疫检测方法的建立

目的:建立CA125的生物素-亲和素酶联免疫检测(BA-ELISA)方法,进行方法学评价。方法:纯化卵巢癌患者腹水得到CA125抗原,制备生物素化CA125抗体,酶标板包被生物素化BSA,建立BA-ELISA反应系统。观察本方法的灵敏度、回收率、特异度、稳定性等指标。测定卵巢癌患者以及卵巢良性肿瘤患者血清CA125水平,与化学发光免疫检测结果对比。结果:BA-ELISA方法灵敏度为3.18U/L,与CEA、PSA等交叉反应率低;高低浓度样品平均回收率分别为107.11%、99.96%,批内和批间变异分别为7.97%、8.04%,稳定性好。本研究与化学发光免疫检测检出结果差异无统计学意义,检测卵巢癌患者血清CA125水平,回归方程为y=-6.830+1.014x,r=0.993。检测卵巢良性肿瘤患者血清CA125水平,回归方程为y=1.936+0.937x,r=0.986。结论:BA-ELISA检测方法的建立在诊断卵巢癌等方面灵敏度高、特异性强,操作简便,无需昂贵仪器,适合广泛应用。

生物素-亲和素偶联探针蛋白芯片检测技术

自行制备一种新型生物素-亲和素偶联探针分子并用于反相蛋白芯片的检测。首先,将生物素-羊抗鼠IgG与亲和素按照不同比例混合后与鼠IgG蛋白芯片反应,观察荧光信号的放大情况;然后以鼠IgG-羊抗鼠IgG体系为研究模式,对反相蛋白芯片的制备条件进行了考察和优化,包括荧光分子的非特异性吸附、点样缓冲液的选择以及蛋白的活性等。最后,采用此偶联探针对反相蛋白芯片进行了检测。结果表明,BSA缓冲液制备的反相蛋白芯片可以防止非特异性吸附,并有利于保持固定蛋白活性和提高检测限;另外,与传统的与生物素-亲和素检测技术相比,采用生物素-亲和素偶联探针对反相芯片的检测限可以提高4倍左右。表明亲和素-生物素偶联探针成本低、易于合成、并可以与其它的信号放大技术联用进一步提高检测的灵敏度,有望用于蛋白质芯片的检测。

生物素-亲和素系统在MR靶向成像中的应用

目的探讨利用生物素-亲和素系统的靶向定位效应和生物放大作用,提高MR分子成像的敏感性。方法制备生物素化HAb18单克隆抗体并测定其生物素化程度及抗原结合活性。将8只荷人肝细胞癌裸鼠静脉注射生物素化单克隆抗体600 μg,24 h后腹腔注射80 μg 亲和素,30 min后再静脉给予Gd-DTPA-链霉亲和素。对实验动物行MR扫描,测量SE T1WI平扫及增强后10、30 min及2、6、12、24 h图像内肿瘤、肝脏、肌肉的信号强度,绘制信号强度-时间曲线,并计算其强化率及对比度噪声比。结果HAb18单克隆抗体经生物素化后,每个抗体分子平均可结合20个分子生物素,其抗原结合活性约为91%。增强后肿瘤信号强度缓慢升高,在注射对比剂后第6小时,肿瘤的强化率、比度噪声比达到最大值,与其他各时间点有显著性差异。肝脏在注射对比剂后第6小时的信号强度达到最高,而后信号强度下降,增强后12 h的信号强度与平扫相似。肌肉表现为轻度强化,增强后各时间点的信号强度与平扫相比无明显差异。结论利用生物素-亲和素技术对肿瘤进行MR靶向成像,具有特异性强化作用并能延长肿瘤的强化时间,但Gd-DTPA-SA的血池效应也造成了肝脏的持续强化。

圆斑酶联免疫吸附试验诊断囊虫病——生物素-亲和素酶复合物在该方法中的应用

目的：应用生物素－亲和素－酶复合物系统，建立一种繁感、特异、经济简便的囊虫病血清学诊断。方法：生物素－亲和素－酶复合物圆斑酶联免疫吸附试验（ＡＢＣ－Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）、滤纸血斑ＡＢＣ－Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ。结果：ＡＢＣ－Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ 诊断囊虫病，检出率（９５．９２％ ）远较圆斑酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）高８３．６７％ ，平均几何滴度（１∶２ ８０１．７３）约为Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ（１∶５８７．２６）的５ 倍；用该方法对４℃条件下保存３ 月的患者滤纸血斑样本进行检测，阳性率为９４．７４％ （５４／５７），无假阳性反应（０／４５）；对相同患者血清和滤纸血斑双份血样进行检测，阳性率均为９０％ （２０／２２）。结论：该方法提高了检出率，简化了采样及送样程序，适合于边远地区和用于流行病学调查。

人血清甲状腺素的生物素-亲和素竞争酶联免疫分析

目的:建立人血清T4-BA-ELISA分析方法。方法:合成的3种生物素化的T4-衍生物、经过筛选,Biotin-BSA-T4被用于以下实验中:T4在三氯乙酸作用下与甲状腺T4结合球蛋白（TBG）分离,并与Biotin-BSA-T4对有限量的兔抗人T4IgG形成竞争,在链霉亲和素化辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP）存在下,以四甲基联苯胺（TMB）为底物,进行T4的ELISA定量分析。结果:标准曲线的可测量范围是10～20μg/L,批内变异系数为7.1％,批间变异系数为 8.03％。另外,用EIA和RIA同时测定了71份血清标本,对两套数据作了回归分析.r=0.969 5,P<0.001。结论:此方法的灵敏度已达到甚至超过了放射免疫分析的灵敏度,标准曲线范围与放射免疫分析相同。

人促甲状腺激素生物素-亲和素系统免疫放射分析法的建立

报道将ＢＡＳ（生物素－亲和素系统）引入双位点夹心ＩＲＭＡ（免疫放射分析法），建立了人血清ＴＳＨ（促甲状腺激素）固相试管双位点夹心ＢＡＳ－ＩＲＭＡ。该法批内ＣＶ为１．４％—８．３％，批间ＣＶ为６．１％—８．４％，最小检出量为０．０４ｍＩＵ／Ｌ，平均回收率为１００．１６％，灵敏度约是同条件下ＩＲＭＡ的３倍；与ＩＲＭＡ对比测定２０份病人血清ＴＳＨ样品，经统计学处理，两者测定结果呈良好相关性。

生物素-亲和素放大酶联免疫吸附法测定氯胺酮

建立了检测氯胺酮的生物素-亲和素放大酶联免疫吸附测定法(BA-ELISA)。实验最佳测定条件:抗原包被浓度为2.0mg/L、氯胺酮单克隆抗体浓度为10.2mg/L,生物素化羊抗小鼠IgG(Biotin-IgG)和酶标链霉亲和素(SA-HRP)的最佳反应浓度分别为0.29和1.0mg/L。在此优化条件下,方法的线性范围为0.1～1000μg/L;检出限为0.03μg/L。氯胺酮生物样品的加标回收率为94%～102%。与酶标二抗体系ELISA法相比,BA-ELISA具有更高的灵敏度,适于低浓度氯胺酮的检测。

生物素-亲和素放大系统荧光免疫分析检测太空杯中的双酚A

通过简单的全合成将生物素共价结合到抗双酚A抗体上形成生物素化的抗双酚A抗体复合物，结合荧光素标记的亲和素作为荧光探针，建立了测定双酚A的荧光免疫分析新方法．在优化的实验条件下，测定双酚A的线性范围为0．1～10000ng／mL，检出限为0．05ng／mL．将其用于太空杯中双酚A的测定，得到的样品回收率和相对标准偏差分别为91．8％～110．0％和2．2％～5．3％．实验结果表明该方法简单、稳定、可靠．

生物素-亲和素增敏抑制型SPR等离子共振传感器检测牛奶中链霉素

针对牛奶中链霉素(STR)残留问题,开发一种基于生物素-亲和素系统(BAS)增敏及抑制型等离子共振(SPR)免疫传感器。方法:直接交联法获得的半抗原STR-OVA,通过活化酯法偶联生物素得到抗原BNHS-STR-OVA,与芯片上的链霉亲和素(SA)结合,绑定抗原。依据免疫抑制原理,STR与BNHS-STR-OVA共同竞争固定浓度的特异性抗体,依据不同浓度STR所得响应值,计算抑制率并绘制曲线,实现对食品中STR残留的准确、灵敏、快速分析。利用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS)检测该方法的准确性。结果:检测过程中抗原的固定量为6μg,抗体质量浓度为60 mg/mL。构建的抑制型免疫传感器的检出限(IC15)为0.37μg/L,灵敏度(IC50)为1.65μg/L。检测时长不超过10 min,芯片可重复使用90次。结论:研究所构建的BAS-SPR增敏、抑制型免疫传感器,方法简单,灵敏度高,检测时间短,成本低,可满足牛奶样品中STR高效检测的需求。

静电吸附法与生物素-亲和素桥联法制备PSMA抗体靶向纳米微泡的对比实验研究

目的比较静电吸附法和生物素-亲和素桥联法制备前列腺特异性膜抗原(PSMA)抗体靶向纳米微泡的物理特性和靶向黏附率。方法分别应用静电吸附法和生物素-亲和素桥联法制备PSMA抗体靶向的纳米微泡,检测其物理性状;光镜下观察两种微泡与前列腺癌细胞LNCaP和C4-2的靶向能力,并与胃癌细胞MKN45对照;对比分析两种靶向纳米微泡的粒径、浓度及与前列腺癌细胞结合能力。结果两种靶向纳米微泡均呈圆形,表面光滑,大小均匀,分散度好,无聚集,粒径均<1000 nm。静电吸附法制备的靶向纳米微泡平均粒径为(702.96±66.65)nm,平均浓度为(3.46±0.30)×108/ml,与前列腺癌细胞LNCaP黏附率(77.2±3.19)%,与C4-2细胞黏附率(61.00±4.47)%;生物素-亲和素桥联法制备的靶向纳米微泡平均粒径为(609.90±37.40)nm,平均浓度约(4.52±0.19)×108/ml,与前列腺癌细胞LNCaP黏附率(96.60±1.14)%,与C4-2细胞黏附率(94.00±1.58)%。两种靶向纳米微泡的粒径、浓度及与前列腺癌细胞黏附率比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);与胃癌细胞MKN45均无黏附。结论生物素-亲和素桥联法是一种高效、灵敏、稳定、特异性强的PSMA抗体靶向微泡制备方法,较静电吸附法具有更大的优势。