应用甲基化特异性聚合酶链反应分析P15基因对成人急性白血病微小残留病灶的检测价值

目的 :评价由甲基化特异性聚合酶链反应分析P15基因甲基化对成人急性白血病微小残留病灶的检测价值。方法 :运用甲基化特异性聚合酶链反应 ,分析了 38例各种类型的急性白血病在初诊时和缓解后的不同阶段P15基因的甲基化状态。结果 :①甲基化特异性聚合酶链反应检测P15基因甲基化的敏感性为 2 .0× 10 -4。② 38例急性白血病初诊时的P15基因甲基化的出现率为 6 8.4 % ,正常对照组无甲基化。③P15基因甲基化可能与疾病的预后有关。经治疗后P15基因甲基化消失的病人与P15基因甲基化持续存在的病人复发率之间的差异有显著性 (0 %比 6 8.8% ,P <0 .0 1)。结论 :P15基因甲基化状态在急性白血病中有较高的检出率 (达 6 8.4 % )。应用甲基化特异性聚合酶链反应分析急性白血病P15基因甲基化状态的特异性和敏感性高。该指标可监测急性白血病微小残留病灶相关的情况 ,值得在临床上推广。

巢式甲基化特异性聚合酶链反应在p16基因启动子过甲基化检测中的应用

目的 介绍巢式甲基化特异性聚合酶链反应 (nMSP)法 ,探讨了最佳PCR扩增条件 ,并用该法分析新鲜癌组织、石蜡包埋组织及肿瘤患者血清中p16基因启动子的甲基化状态。方法 将基因组DNA变性成为单链 ,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA ,将所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶 ,而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因特异引物 ,进行巢式聚合酶链反应扩增 ,最后经凝胶电泳检测目的片段。结果 在 3种类型的标本中都检测出了p16基因启动子甲基化。用甲基化特异性聚合酶链反应法 (MSP)和nMSP法分别检测 34例非小细胞肺癌 (NSCLC)患者血清 ,p16基因启动子甲基化阳性率分别为 5 3% (18/34)和 74 % (2 5 /34) ,nMSP法具有更高的灵敏度。结论 筑巢式甲基化特异性聚合酶链反应是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法 ,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化分析。

半巢式甲基化特异性聚合酶链反应在胃癌p16基因甲基化检测中的应用

目的 改进甲基化特异性聚合酶链反应 (MSP) ,采用半巢式MSP检测胃癌组织p16基因启动子区CpG岛的甲基化状态。方法 用亚硫酸氢盐修饰被测DNA后 ,采用半巢式MSP(引物分别为MS ,M1A和MS ,M2A) ,分析了 6 0例胃癌组织及相应正常组织中p16基因的甲基化状态。结果 单独用MSP ,胃癌组织中p16基因甲基化的发生率为 80 %。采用半巢式MSP ,甲基化发生率为86 7% ,比单独采用MSP提高了几个百分点 ,并提示胃癌病例的p16基因启动子区存在甲基化发生的不同模式。结论 半巢式MSP能够有效地提高灵敏度和减少假阳性。同时 ,免疫组化的结果也说明了p16基因异常甲基化与胃癌组织P16蛋白的表达密切相关。

采用甲基化特异性聚合酶链反应研究急性白血病p15基因CpG岛甲基化

目的 探讨ｐ１５ 基因ＣｐＧ岛甲基化作为各型急性白血病通用的基因标志物的可行性。方法 采用甲基化特异性聚合酶链反应（ＭＳＰ）法检测４０ 例初治或复发急性白血病、５ 例完全缓解期白血病及８ 例（ 份） 正常骨髓的ｐ１５ 基因ＣｐＧ岛甲基化，并对ＭＳＰ产物进行序列测定。结果 急性白血病患者ｐ１５ 基因ＣｐＧ岛甲基化阳性率为８０％ ，ＡＭＬ与ＡＬＬ的阳性率（分别为８３％ 和７３％） 差异无显著性；５ 例完全缓解期白血病患者中１ 例ｐ１５ ＣｐＧ岛甲基化阳性（该例患者不久白血病复发）；正常骨髓８ 例均为阴性，表明ｐ１５ ＣｐＧ岛甲基化为白血病细胞所特有；ＭＳＰ产物测序结果与理论结果相符合，ＭＳＰ敏感度可达１０ －３。结论 ｐ１５ ＣｐＧ岛甲基化在各型急性白血病中均有很高的发生率，可以作为各型急性白血病通用的微量残留病（ＭＲＤ） 指标；白血病完全缓解期ｐ１５ ＣｐＧ 岛甲基化仍为阳性可能预示着复发；ＭＳＰ法ＤＮＡ需要量极少，不需要有特异性酶切位点，无同位素污染，对标本要求不高，敏感度高，是甲基化研究的一个简便、敏感、特异的新手段。

甲基化特异性聚合酶链反应检测粪便ppENK基因甲基化对胰腺癌诊断的可行性

目的评价甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测粪便ppENK基因高甲基化用于诊断胰腺癌的可行性。方法收集胰腺癌患者24例和对照6例的新鲜粪便标本。采用MSP检测全部粪便标本中ppENK的甲基化状态；采用PCR检测全部粪便标本中野生型ppENK的阳性率。采用PCR-限制性片段长度多态性（RFLP）检测粪便K-ras的突变情况。将胰腺癌细胞PC3单细胞悬液加入同一健康者粪便标本，MSP法检测ppENK甲基化阳性，计算甲基化阳性时需掺人的胰腺癌细胞的最少数量。结果30份粪便标本的甲基化检出率为0（0／30），非甲基化检出率为10％（3／30），野生型ppENK检出率为6．7％（2／30）；PCR-RFLP可检测出所选10份野生型ppENK阴性的胰腺癌标本中的8份，其中7份有K-ras第12位密码子突变。MSP方法能够检测到粪便中ppENK甲基化条带所需胰腺癌细胞的数量至少为50个／ml。结论采用MSP方法检测胰腺癌患者粪便标本的ppENK基因甲基化状态，尚不能成为筛查和诊断胰腺癌的方法。

基于细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ序列位点特异性聚合酶链反应鉴别鹿茸及其伪品

目的:基于细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)序列建立一种新的PCR鉴定方法,以快速鉴别出梅花鹿、马鹿茸片与驯鹿茸片。方法:采集不同来源的鹿茸片共60批。通过比较梅花鹿、马鹿与驯鹿等其他伪品的COⅠ基因序列差异,根据SNP鉴别位点设计梅花鹿茸、马鹿茸同驯鹿茸的鉴别引物Cne-F、Rt-F、Co-R,并对影响聚合酶链反应(PCR)结果的主要因素变性时间、退火温度、退火时间、延伸时间等进行方法学考察和优化。结果:该实验构建的双位点特异PCR鉴别体系,基于COⅠ的鉴别位点,可通过PCR扩增获得294 bp的梅花鹿、马鹿特异片段,而产生514 bp的驯鹿特异片段,伪品及阴性对照无条带。结论:该实验建立对梅花鹿、马鹿及驯鹿等其他伪品鹿茸的PCR鉴别方法简便、可靠。

巯基乙酸修饰的CdTe量子点对聚合酶链反应特异性的影响

合成了巯基乙酸（TGA）修饰的量子点,X衍射分析证实CdTe相的存在,高分辨电子显微镜分析表明量子点的直径为3 nm,Zeta电位表征表明量子点表面带有负电荷.把TGA修饰的CdTe量子点加入到聚合酶链反应（PCR）反应液中,使用brcaa1基因载体作为PCR反应的模板,进行两轮PCR反应.最终的PCR产物通过w=1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析,结果表明,在0-1.33 g/L范围内,随着量子点的量逐渐增加,非特异性的扩增条带逐渐消失,荧光（PL）光谱表明PCR反应后的量子点荧光强度降低.X射线光电子能谱（XPS）证实PCR反应前后Cd元素和Te元素的能谱峰并没有出现化学位移,吸收光谱（UV-vis）表明了PCR反应之后的吸收强度增强.因此,TGA修饰的CdTe量子点置于PCR反应液之中,能提高PCR的特异性,可以应用于超灵敏DNA检测、光电生物传感器.

重组酶介导扩增技术与传统聚合酶链反应技术在甲状腺癌DNA甲基化检测中的应用比较

目的建立重组酶介导的核酸扩增（RAA）技术特异性检测DNA甲基化的新方法并与传统的DNA甲基化特异性PCR（MSP）方法进行比较。方法选取OXTR基因作为目的基因，提取样品外周血基因组DNA，经亚硫酸氢盐修饰后分别以MSP和RAA技术进行特异性检测DNA甲基化实验。结果2种技术皆能扩增出OXTR非甲基化条带，而RAA技术成功扩增OXTR甲基化条带。结论RAA是一种新型的等温体外核酸扩增技术，实现了在37℃恒温下的核酸快速扩增，可成为替代MSP乃至其他PCR实验的新方法。

丙型肝炎病毒型特异性聚合酶链反应基因分型的临床应用

目的 探索丙型肝炎病毒 (HCV)基因型在不同人群中的分布规律及流行优势型。方法 分别对健康体检者、住院患者和血液透析患者抗HCVIgG阳性标本 ,用自行设计的 5’非编码区 (5’ NCR) 1、2、3、1b型特异性引物进行扩增和基因分型。结果 3组人群中血液透析患者HCV感染率最高 ,抗HCVIgG和HCVRNA阳性率分别为 5 5 .37%和 38.84%。基因型以 1b亚型为主 ,1b及 1b的相关型占 91.6 7%。结论 本地区HCV流行优势型为 1b亚型。

逆转录聚合酶链反应检测Ⅲ型登革病毒的敏感性和特异性研究

本文应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,检测Ⅲ型登革病毒基因。所设计引物在E基因组,引物2位于核苷酸序列的1139～1158位,引物1位于1453～1471位,反应产物为333bp,内含1个HindⅢ限制性内切酶位点,酶切后有128 bp和199 bp两个片段。产物在含溴化乙锭的2％琼脂糖中电泳。采用RT-PCR法可测出少至5个半数组织细胞培养感染量(TCID_so)的病毒RNA。

聚合酶链反应顺序特异性寡聚核苷酸探针反向杂交法在HLA-DRB_1分型中的应用

目的:探讨聚合酶链反应顺序特异性寡聚核苷酸探针(polymerasechainreaction-sequencespe-cificoligonucleotideprobes,PCR-SSOP)反向杂交法应用于人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)-DRB1配型的可行性。方法:随机选取25例已行聚合酶链反应顺序特异性引物(polymerasechainreac-tion-sequencespecificprimers,PCR-SSP)法HLA-DRB1配型的肾移植受者的血标本,采用PCR-SSOP反向杂交法再次配型,并与PCR-SSP法的结果比较。结果:两法的一致性达92%。2例不一致的患者经再次PCR-SSOP反向杂交法配型后,其中1例与PCR-SSP结果一致,PCR-SSOP反向杂交法的平均操作时间为4小时30分。结论:PCR-SSOP反向杂交法是一种能以中等分辨度进行等位基因分型的方法,操作较简单,结果解读客观,适用于临床肾移植配型。

聚合酶链反应-序列特异性引物方法检测儿科疾病基因多态性

目的建立多个基因多态性分型的聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)的方法,以推广其在儿科疾病分子水平研究中的应用。方法应用PCR-SSP的方法分析以下基因的多态性,TNF-α-308A/G和-238G/A变异,IL-6-174G/C变异。结果应用同一个PCR扩增程序,可同时对多个基因、多个临床样本的多态性进行分析,基因型清晰,且基因分型快速、准确。结论PCR-SSP适合对大样本、多基因的多态性进行分析,成本低、快速、准确,在儿科疾病分子水平研究中前景良好。

聚合酶链反应检测对肺结核诊断的特异性和敏感性探讨

利用聚合酶链反应(PCR)技术检测482例肺部疾患病人的痰标本,并同时以涂片,培养法对病人疾标本进行检查,以评估PCR的敏感性和特异性。结果显示：PCR敏感性最高,62％(4／236),但特异性最低,为63％(54／246)。故目前此法仅能作为诊断肺结核的辅助检查,其方法有待进一步完善。

基因甲基化聚合酶链反应检测体系的优化

目的优化甲基化敏感限制性内切酶的聚合酶链反应(PCR)检测体系。方法用甲基化敏感限制性内切酶-PCR技术对10例健康未孕女性的RASSF1A基因进行甲基化检测,并对反应的缓冲体系进行优化。结果未经纯化的酶切产物直接进行PCR时,PCR反应特异性降低,出现众多非特异PCR产物;纯化酶切产物或用PCR缓冲液替代酶切缓冲液后,PCR反应特异性变高。结论酶切缓冲液可影响后续PCR反应的特异性,采取纯化措施或以PCR缓冲液替代酶切缓冲液能够有效提高后续PCR特异性,首选PCR缓冲液替代更为简便。

金纳米粒子对聚合酶链式反应体系中长链DNA特异性扩增的效应

以乙烯受体基因ETR1（2500bp）和山梨醇脱氢酶基因（SDH）（1100bp）为材料，研究了不同浓度金纳米粒子对聚合酶链式反应（PCR）体系中大于1000bp的长链DNA特异性扩增的效应。结果表明，金纳米粒子显著增强了ETR1和SDH在PCR时的特异性扩增，有效降低了非特异性扩增。在ETR1和SDH的PCR中，金纳米粒子适宜浓度为0．4nmol·L^-1。在50℃-62℃的退火温度范围内，金纳米粒子均能够显著增强ETR1和SDH的特异性扩增。因此，金纳米粒子不仅提高了1000bp以上的长链DNA在PCR扩增的特异性，而且拓宽了PCR的退火温度范围。

聚合酶链反应在口岸鼠疫监测中的特异性和敏感性试验

目的利用UDG防止聚合酶链反应(PCR)的产物污染,以2个不同基因为靶序列,设计了3对引物进行PCR扩增。方法用不同的模板考察方法的特异性和灵敏性。结果该方法可以特异性的检出鼠疫菌,对于DNA模板,检测灵敏度可以达到7CFU。结论PCR技术是一种快速、敏感、特异性很高的方法。

棉花甲基化酶基因COMT和CCoAOMT的组织特异性表达分析

本研究利用半定量RT-PCR分析方法探索了陆地棉(Gossypium hirsutum L.)木质素合成途径中甲基化酶基因家族COMT和CCoAOMT在不同组织和不同发育时期纤维中的表达情况。结果表明COMT1,COMT2,COMT3和CCoAOMT1,CCoAOMT2在棉花的7个组织器官(根、茎、叶、子叶、花瓣、雄蕊、胚珠)中都有表达,其中COMT1和CCoAOMT1在各组织中的表达趋势类似,COMT2,COMT3和CCoAOMT2表达趋势各异。在5～25d的棉纤维发育过程中,COMT1和COMT3表达稳定,COMT2表达量逐渐增加。而CCoAOMT基因家族的2个基因的表达量变化相对明显,CCoAOMT1在25d出现表达高峰,CCoAOMT2则在10d和15d呈现高表达量。本研究表明甲基化酶基因家族COMT和CCoAOMT在棉花的根,茎等维管组织中具有相对一致的高表达量,而在其他组织和发育纤维中则呈现出明显的组织特异性和纤维发育时期特异性。

检测HBV基因组nt551A→G突变特异性聚合酶链反应的建立与初步验证

目的：建立一种特异而敏感的检测乙型肝炎病毒(HBV)基因组nt551位A→G变异株的方法。方法：根据已知的HBV基因组序列，结合国内主要流行亚型adr和adw的特点，合成在nt55l位分别为A或G两对引物，建立了突变特异性聚合酶链反应方法。结果：利用该方法对由16份乙型肝炎患者血清扩增的HBVS基因片段进行了初步检测。结果14份样本nt55l为A，l份为G，l份nt55l非A非G。经核苷酸序列分析表明结果正确。结论：该法是鉴定HBV基因组nt55l位A→G变异株的特异而敏感的方法。

聚合酶链反应检测肝硬化患者腹水中细菌DNA

目的:探讨PCR方法检测肝硬化患者腹水中细菌DNA的可行性。方法:在细菌16SrRNA基因保守区设计一对通用引物,对7种对照菌株、人基因组DNA、HBVDNA、3 7份肝硬化患者腹水进行聚合酶链反应扩增。结果:7种对照菌株均获得5 3 0bpDNA片段。而与人基因组DNA、HBVDNA无交叉阳性反应,敏感性试验可检测出1pg的细菌DNA。3 7份腹水中有9份获得5 3bpDNA片段,阳性率2 4 3 % (9/3 7) ,而腹水细菌培养阳性率为5 4%(2 /3 7) ,两者比较差异有显著性意义(P <0 0 5 )。结论:将通用引物通过PCR方法扩增细菌16SrRNA基因,具有高度敏感性、特异性,可应用于肝硬化患者腹水中细菌DNA的检测及细菌移位的研究。