鸭坦布苏病毒、基因C型鸭甲肝病毒、鸭圆环病毒一步法多重PCR鉴别检测方法的建立及应用

旨在建立一种快速鉴别检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)、基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)、鸭圆环病毒(DuCV)的多重PCR方法。参考GenBank中DTMUV E基因序列、DHAV-C VP1基因序列、DuCV Cap基因序列分别设计特异性检测引物,建立鉴别检测DTMUV、DHAV-C、DuCV的一步法多重PCR。该方法对DTMUV、DHAV-C、DuCV分别扩增出720、480和250 bp片段,对基因A型鸭甲肝病毒(DHAV-A)、新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)、鸭瘟病毒(DEV)、鸭细小病毒(DPV)、鸭呼肠孤病毒(MDRV)均无扩增产物;对DTMUV、DHAV-C、DuCV最低检测限度分别为3.8×10^(-5)、5.4×10^(-5)和6.2×10^(-5)μg/μL;与DTMUV、DHAV-C、DuCV单项PCR方法的符合率均为100%;该方法检测290份临床病料样品,DTMUV阳性率为8.97%,DHAV-C阳性率为10.69%,DuCV阳性率为2.07%,DTMUV/DuCV混合感染阳性率为4.14%,DHAV-C/DuCV混合感染阳性率为3.10%,DTMUV/DHAV-C/DuCV混合感染阳性率为0.34%。结论:成功建立了一种能同时鉴别检测DTMUV、DHAV-C、DuCV的一步法多重PCR,可用于临床中3种病毒单独感染或混合感染的鉴别检测和流行病学调查。

鸭3型甲肝病毒的分离鉴定与VP1基因序列分析

【目的】探明引起安徽某鸭场雏鸭肝脏出血和大量死亡的病原及其遗传进化特征。【方法】对安徽省某鸭场的病死雏鸭中采集的出血肝脏开展鸭已知病原核酸检测、病原分离鉴定和动物回归试验,在明确其病原为鸭3型甲肝病毒(Duck hepatitis A virus type 3,DHAV-3)的基础上分析其VP1基因序列分子特征。【结果】细菌分离结果显示,未分离到细菌;经病毒核酸(RT-)PCR检测结果显示,鸭3型甲肝病毒(DHAV-3)核酸阳性,未检测出其他已知引起鸭肝出血的病毒核酸。将该阳性样品经鸭胚进行病毒分离与传代,发现接种后鸭胚发生死亡,胚体全身出血,对第5代尿囊液经RT-PCR检测为DHAV-3,将其命名为AH230225。经测定,该分离株的鸭胚半数致死量(Effective lethal dose 50,ELD_(50))为10^(−4.17)/0.1 mL。动物回归试验表明,该毒株对樱桃谷雏鸭的致死率为80%,且攻毒死亡鸭肝脏和肾脏的剖检病变与临床典型病变相近。对该分离毒的VP1基因核苷酸序列进行同源性分析,显示AH230225株的VP1基因核苷酸序列与AH07株DHAV-3(安徽分离株)的同源性最高,为98.8%,与GenBank登录的10株DHAV-3分离株VP1基因核苷酸序列同源性为90.4%~98.8%,而与DHAV-1和DHAV-2的VP1基因核苷酸序列同源性分别为62.1%~63.0%、64.6%~64.9%;基于VP1蛋白氨基酸序列的遗传进化显示,该分离株与AH07株DHAV-3处于同一小进化分支上,亲缘关系最近;而与SD01株、G株和韩国株(AP-04009、AP-03337)等亲缘关系较远,即远离DHAV-1和DHAV-2进化分支。【结论】引起安徽某鸭场雏鸭肝脏出血和大量死亡的病原为鸭3型甲肝病毒DHAV-3,同时明确了该毒株VP1基因的分子特征及遗传进化规律,为深入研究DHAV-3的致病机制和制定防控措施提供科学依据。

一例鸭甲肝病毒3型与新型番鸭细小病毒共感染的诊断

2023年10月,福建漳州某鸭场饲养的14日龄樱桃谷鸭群发病,根据临床症状、病变观察和实验室病原检测,确诊该病例为鸭甲肝病毒3型与新型番鸭细小病毒共感染。

一起鸭甲肝病毒1型和3型混合感染的研究报道

自山东省某疑似鸭肝炎发病鸭肝脏中分离到两株病毒,命名为TA1和TA2,分离毒分别回归3日龄雏鸭,可复制出鸭肝炎的典型症状和病理变化。利用鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)和3型(DHAV-3)特异性引物进行RT-PCR扩增,结果为阳性,经测序证实为DHAV-1和DHAV-3。分别扩增分离毒的VP1基因,经序列测定及遗传进化关系分析发现,分离毒TA1和DHAV-3毒株之间有较高的核苷酸序列相似性,与DHAV-3遗传距离最近,属于基因C型;分离毒TA2和DHAV-1毒株之间有较高的核苷酸序列相似性,与DHAV-1的遗传距离最近,属基因A型。

雏鸭混合感染基因A型和基因C型鸭甲肝病毒研究

研究了2013年四川地区某鸭场暴发的基因A型鸭甲肝病毒（DHAV-A）和基因C型鸭甲肝病毒（DHAV-C）的混合感染病例.疾病发生于20 ～ 25日龄雏鸭,发病率25％ ～ 30％,死亡率为20％～ 30％,临死前出现明显的神经症状,病死雏鸭肝脏肿大,出血.利用双重RT-PCR从病死雏鸭的肝脏组织中同时检测出DHAV-A和DHAV-C.这是四川省养鸭密集区第一次发现雏鸭混合感染DHAV-A和DHAV-C的情况.此外,对2009 ～ 2012年四川省各养鸭密集区鸭甲肝炎流行情况做了调查一共从四川省养鸭密集区采集312份疑似鸭肝炎样本中检测出120份鸭甲型肝病毒性肝炎.其中基因C型鸭肝炎阳性率为75％,基因A型鸭肝炎仅为25％,未发现基因A型和基因C型混合感染情况.结果说明2009～2012年我省鸭病毒性肝炎以基因C型鸭甲肝病毒为优势病原.2013年,开始出现DHAV-A和DHAV-C混合感染病例.因此如何采取有效措施应对其危害,这应该引起养鸭界及相关部门的高度重视.

雏番鸭胰腺型鸭1型甲肝病毒分离鉴定及VP1基因分析

采集自胰腺发黄或出血的雏番鸭病料经RT-PCR检测为鸭1型甲肝病毒阳性后,接种11日龄非免疫番鸭胚获得一株病毒(命名为MPZJ1206)。该株病毒在不同温度下均不凝集鸡、鸭和绵羊红细胞;鸭胚中和试验表明蚀斑纯化毒可被经典的鸭1型甲肝病毒高免血清特异性所中和。该株病毒对7日龄雏番鸭的致死率为38.5%,病死鸭剖检病变与临床发病鸭相同,且从病死鸭脏器中回收分离到的病毒经鉴定仍为鸭1型甲肝病毒。应用鸭1型甲肝病毒VP1基因特异性引物从该株病毒克隆获得的714bp的基因片段,与经典鸭1型甲肝病毒分离株Du/CH/LGD/111239VP1基因的同源性最高,为99.1%,经遗传进化分析表明该株病毒属鸭1型甲肝病毒谱系。以上结果表明,雏番鸭胰腺炎是由鸭1型甲肝病毒感染所致,这一新病型明显不同于经典的鸭1型甲肝病毒感染引起的肝脏出血,鉴于此,建议将本试验分离株命名为胰腺型鸭1型甲肝病毒。

辽东湾沿岸海水及贝类中甲肝病毒分布的研究

用RT-PCR方法检测辽东湾几个重点沿岸海域表层海水和几种经济贝类样品中甲肝病毒的分布。结果表明,6个重点沿岸海域表层海水中均检出甲肝病毒(Hepatitis A virus,HAV),6种经济贝类样品中有4个样品检出甲肝病毒。检测结果显示,辽东湾某些重点沿岸海域受陆源生活污水影响严重,有关部门应加强海洋环境和海产贝类卫生安全监测和管理,以避免引发甲型肝炎暴发流行。

辽东湾沿岸水域甲肝病毒和粪大肠菌群分布

报道了2002年辽东湾3个沿岸海域表层海水中甲肝病毒和粪大肠菌群分布的检测结果。结果显示,5月份表层海水 中没有检出甲肝病毒,粪大肠菌群也符合卫生标准;8月份和10月份表层海水中的甲肝病毒loo％呈阳性,粪大肠菌群均超标。 结果表明,粪大肠菌群指示海水中肠道病毒污染程度仍具有很大程度的可靠性。

RT-PCR法检测贝类中的甲肝病毒的研究

在世界范围内,甲肝病毒是与食用贝类有关的主要传染性疾病之一。由于贝类中含有PCR抑制剂以及病毒富集过程中病毒的回收率低,阻碍了天然污染的贝类中HAV的PCR检测。研究中建立了一种经苷氨酸缓冲液洗涤,2次PEG沉降富集病毒,然后进行RNA提取和RT-PCR对贝类中的甲肝病毒进行检测的方法。经比较,采用小体系肠道样品检测比采用全贝检测的富集效果更佳,并比较了PEG8000和PEG6000对病毒富集的效果,回收率分别为13.5%和7.6%,此方法可有效地降低PCR抑制剂的影响,最低检测限可达10个TCID50/1.5 g。

应用生物反应器培养Vero细胞制备甲肝病毒

目的 研究用生物反应器培养Vero细胞制备甲肝病毒W株的可行性。方法 Vero细胞悬浮吸附HAVW株后 ,接种到搅拌式生物反应器中 ,用微载体进行培养 ,对营养物质、代谢产物及病毒的增殖进行分析。结果 经四周的培养 ,病毒收获时 ,细胞密度达 1.4× 10 6 ml,甲肝病毒抗原滴度达 1∶64。结论 W株已适应于Vero细胞中 ,用生物反应器培养产毒 。

胰腺型、经典型鸭1型甲肝病毒对雏鸭的致病性差异

为明确胰腺型鸭1型甲肝病毒(DHAV-1)和经典型DHAV-1对不同品种雏鸭的致病性,以胰腺型DHAV-1和经典型DHAV-1分别感染7、14、21、28、35d番鸭、半番鸭、樱桃谷鸭和麻鸭,结果表明番鸭对胰腺型DHAV-1最易感,半番鸭和樱桃谷鸭次之,麻鸭最不易感;而樱桃谷鸭对经典型DHAV-1最易感,番鸭次之;感染胰腺型DHAV-1的番鸭、半番鸭胰腺出血、明显发黄,肝脏未见出血。表明胰腺型鸭1型甲肝病毒、经典DHAV-1在易感宿主、组织嗜性和特征肉眼病变上均存在明显差异。

H2株甲肝病毒经KMB17细胞培养的毒力及核苷酸序列

目的 监测H2株甲肝病毒经人胚肺二倍体细胞KMB17培养的毒力 /减毒水平及核苷酸序列。方法H2株甲肝减毒活疫苗H2M2 0K7(K7)用KMB17细胞增殖 ,分别在 35℃和 37℃连续传代后 ,抽查不同代次病毒的普通狨猴接种反应和核苷酸片段序列。结果 H2 KMB17系统在 35℃培育 16代次过程中 ,病毒的抗原滴度和感染性滴度稳定 ,在 37℃的滴度明显低下 ,经 13代次仍未达亲本水平。K18(35℃ ,11代 )和K15 (37℃ ,8代 )病毒经普通狨猴接种反应证实为减毒性质。核苷酸两片段共 1897个碱基的序列分析显示 ,K18和K15与K7的同源性高达 99 3%～ 10 0 %。结论 K7疫苗病毒在KMB17细胞培养经 35℃和 37℃连续传代 。

氯仿抽提细胞培养物中纯化甲肝病毒

目的 探讨氯仿抽提纯化甲型肝炎病毒 (HAV )过程中多种因素对其活性的影响。方法 利用正交分析方法 ,对抽提纯化过程中超声波、氯仿、洗涤液等多种因素进行系统的比较。结果 病毒液的体积与超声波功率相匹配破碎效果较好 ;用PBS及NS作洗涤液比MEM效果好 ;氯仿的质量也是影响抽提效果的重要因素。结论 氯仿抽提纯化HAV过程中多种因素均会对其活性产生影响 ,需探索一个合适条件 。

基于基因C型鸭甲肝病毒VP1重组蛋白的鸭甲肝病毒抗体ELISA检测方法的建立

以纯化的基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)VP1重组蛋白作为包被抗原,建立检测DHAV-C抗体的间接ELISA方法。结果表明,试验的最佳条件:用pH9.6、0.05 mol·L-1的碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释成5μg·mL-1,4℃包被过夜,抗体稀释度为1∶100,HRP酶标羊抗鸭IgG稀释度为1∶5 000,封闭液为含10%脱脂乳的0.01mol·L-1 PBS,37℃封闭2h,血清稀释液为含1%BSA的PBS,抗体反应时间为60min,酶标羊抗鸭IgG反应时间为30min,底物作用时间为15min,临界值为OD450nm≥0.474。该方法重复性好,批内变异系数为2.03%~2.95%,批间变异系数为3.28%~7.38%,与鸭圆环病毒(DUCV)、鸭乙型肝炎病毒(DHBV)、鸭瘟病毒(DPV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、鸭抗大肠杆菌、鸭抗金黄色葡萄球菌、鸭抗沙门菌、鸭抗禽多杀性巴氏杆菌以及鸭疫里默杆菌阳性血清无交叉反应,而与基因A型鸭甲肝病毒(DHAV-A)阳性血清有交叉反应,表明该方法可以作为检测DHAV-C和DHAV-A抗体的通用ELISA方法。与中和试验相比,阳性血清检测符合率为80%,阴性血清检测符合率为100%。初步临床应用表明:该方法可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体消长的检测。本研究基于DHAV-C VP1重组蛋白建立的间接ELISA方法可用于基因A型和C型鸭甲型肝炎的血清流行病学调查和抗体检测。

一例鸭1型甲肝病毒和11型鸭疫里默氏杆菌混合感染的诊断及其病原的分离鉴定

为确定引起2015年6月底福州仓山区某一养鸭场10日龄左右麻鸭发病死亡的病原,无菌采取病死鸭的肝脏、脾脏、脑等组织,经病毒分离、细菌分离纯化、PCR检测、血清学检测、药物敏感性试验,结果检测并分离到鸭1型甲肝病毒和11型鸭疫里默氏杆菌,该鸭1型甲肝病毒分离株与MPZJ1206株和GD株同源性最高,均为98.7%。结果表明,该病例为鸭甲肝病毒1型和11型鸭疫里默氏杆菌混合感染。

甲肝病毒TaqMan PCR检测方法的建立

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法,对甲肝病毒核酸进行检测。方法根据GenBank发表的HAV全基因组序列资料分析结果,在其保守区段设计HAV特异性引物和探针,优化引物、探针浓度,与最佳退火温度,并考察检测体系的特异性、敏感性与重复性。结果本研究体系的引物和探针浓度为0.8μmol/L和0.6μmol/L,退火温度为52℃时,具有良好的特异性与敏感性,检测灵敏度可达0.1TCID50。同一样品重复检测3次,Ct值的变异系数均小于5%。结论本研究建立的HAV TaqMan RT-PCR方法特异、敏感、快速且有效减少交叉污染的概率,为临床及水产品中的甲肝病毒的早期快速检测提供了一种新方法。

基因C型鸭甲肝病毒竞争ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测基因C型鸭甲肝病毒（DHAV-C）血清抗体的方法,本研究以纯化的DHAV-C作为包被抗原,抗DHAV-C单克隆抗体（MAb）5E3-9与待检血清竞争结合抗原,采用方阵法确定包被抗原、MAb及待检血清的最佳工作浓度,经过对反应条件的优化,建立了DHAV-C抗体的竞争ELISA检测方法。该方法仅对DHAV-C血清检测为阳性,与DHAV-A、鸭圆环病毒、鸭乙型肝炎病毒等相关病原的鸭阳性血清无交叉反应。敏感性试验表明,标准阳性血清1：128倍稀释时,检测结果仍为阳性,比中和试验灵敏性更高。批内批间变异系数分别为4.64%~5.21%和6.02%~8.68%,具有良好的重复性。与中和试验比较,阳性符合率为100%（15/15）,阴性符合率为77.8%（14/18）。本研究基于纯化的DHAV-C及其特异性MAb建立的MAb竞争ELISA检测方法可以用于DHAV-C流行病学调查以及抗体的检测。

胰腺炎型鸭1型甲肝病毒结构蛋白VP1基因的克隆和表达

通过RT-PCR方法扩增出MPZJ1206株胰腺炎型鸭1型甲肝病毒结构蛋白VP1基因,将其与原核表达载体pGEX-6P-1连接获得重组表达质粒pGEX-VP1,进行条件优化诱导表达,将表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析。结果表明,分子量约为52kDa的重组目的蛋白得到表达。该研究为开发胰腺炎型鸭1型甲肝病毒诊断方法和研究VP1蛋白功能奠定基础。

鸭1型甲肝病毒亚型的鉴定

为了明确引起雏鸭胰腺炎的新型鸭1型甲肝病毒（duck hepatitis A virus 1,DHAV-1）的分类地位,通过鸭胚血清交叉中和试验测定并分析其与经典的肝炎型DHAV-1的抗原相关性。经血清交叉中和试验测得抗胰腺炎型DHAV-1阳性血清对胰腺炎型DHAV-1、经典的肝炎型DHAV-1的中和效价分别为1∶169.8、1∶91.2,而抗肝炎型DHAV-1阳性血清对经典的肝炎型DHAV-1、胰腺炎型DHAV-1的中和效价分别为1∶125.9、1∶89.1。参照同属小RNA病毒科的口蹄疫病毒血清型、亚型的划分标准,计算得出胰腺炎型DHAV-1与经典的肝炎型DHAV-1间的抗原亲源值（R）为0.62,介于0.32-0.7之间,表明胰腺炎型DHAV-1与经典的肝炎型DHAV-1相比其抗原性发生了较大变异,定名为鸭1型甲肝病毒亚型（DHAV-1a）。