辣椒果实发育相关基因的电子克隆及生物信息学分析

以cDNA-AFLP分析辣椒果实发育获得的长度为193 bp的TDF_(9-68-11)为研究对象,采用电子克隆、PCR验证和生物信息学分析等方法,研究了辣椒果实发育相关基因的电子克隆及生物信息学功能分析,以期为辣椒果实发育相关基因的研究提供参考依据。结果表明:经过电子克隆最终获得长为1 167 bp的拼接序列,设计引物PCR扩增和测序获得全长714 bp的序列,与拼接序列高度一致;该序列编码分子量为17.96 kD氨基酸链,其等电点为7.76偏中性;氨基酸链具有跨膜特性,可能存在5个磷酸化位点,该氨基酸链二级结构含有的α螺旋占42.3%、延伸链占19.6%、β转角占12.2%,以及26.4%的随机卷曲结构。氨基酸序列比对可以初步推断该氨基酸序列的功能与果实发育中醇脱氢相关生化反应有关。

长穗偃麦草 ThPLA 基因的电子克隆和生物信息学分析

本研究基于长穗偃麦草高通量测序信息,利用电子克隆方法获得长穗偃麦草磷脂酶基因(ThPLA),结合生物信息学分析方法,从氨基酸理化性质、保守结构域、高级结构、亲水性/疏水性、跨膜结构域、同源性分析及功能表达等方面对该基因gDNA和编码蛋白进行了预测和分析。结果表明,ThPLA基因全长1620 bp,编码539个氨基酸;与粗山羊草、野生二粒小麦、水稻和玉米的PLA蛋白亲缘关系最近;亚细胞定位和GO term预测ThPLA蛋白质位于叶绿体;综合基因表达预测和转录组数据结果,该基因可能在植物根部对盐胁迫做出响应。

灵芝LaeA基因的电子克隆、表达及生物信息学分析

为通过电子克隆得到灵芝LaeA基因序列,分析其基因序列信息,并初步探究其调控功能。采用电子克隆的方法,以已知桔青霉的LaeA蛋白序列为模板,在灵芝的EST数据库中进行序列相似性搜索比对(Blast),经序列拼接、序列验证和序列延伸等电子克隆方法获得灵芝LaeA基因的cDNA序列;采用生物信息学软件对LaeA基因编码蛋白质的基本理化性质、疏水性/亲水性、亚细胞定位、信号肽、二级结构、三级结构及进化关系等方面进行了预测和分析。结果表明,LaeA基因全长1 134 bp,编码378个氨基酸,蛋白分子质量为42.895 3 ku,存在于细胞质中,是亲水性蛋白;LaeA蛋白结构主要由47.88%无规则卷曲、33.33%α-螺旋和18.78%延伸链组成,有S-腺苷甲硫氨酸结合位点,属于AdoMet_MTases超家族蛋白;系统进化分析结果显示,LaeA蛋白与云芝、污叉丝孔菌等白腐担子菌类的亲缘关系较为亲近;qRT-PCR结果表明,LaeA基因在灵芝细胞液体静置培养过程中的表达量显著高于振荡培养方式。推测LaeA蛋白作为1种甲基转移酶蛋白,通过参与组蛋白的甲基化修饰,进而影响基因簇的表达水平。

人参UDP-阿拉伯糖变位酶基因电子克隆及分析

UDP-阿拉伯糖变位酶是阿拉伯糖合成过程的关键酶,在植物形态建成和逆境胁迫响应过程中起着重要的作用.UDP-阿拉伯糖变位酶可使UDP-Araf和UDP-Arap相互转换,参与包括阿拉伯糖在内的多糖合成.以玉米UDP-阿拉伯糖变位酶氨基酸序列作为探针,通过电子克隆的方式,对人参EST数据库进行检索,获得具有高度同源性的cDNA序列,采用DNAMAN软件对其进行拼接和组装,最终获得一条长为1445 bp的cDNA序列.利用相关软件对人参UDP-阿拉伯糖变位酶基因进行生物信息学分析.结果表明:人参UDP-阿拉伯糖变位酶蛋白为稳定的亲水性蛋白,该蛋白上的磷酸化修饰有33处,无跨膜螺旋区,不存在信号肽,为非分泌蛋白.该蛋白含有无规则卷曲、α螺旋、延伸链、β折叠二级结构,其中无规则卷曲结构最多.人参UDP-阿拉伯糖变位酶的氨基酸序列与凤仙花同源性较高,与石榴花同源性较低.分析结果能为人参后续相关研究提供一定的参考依据.

水稻功能基因的电子克隆策略

电子克隆是随着基因组计划和 EST计划实施发展起来的 ,利用生物信息学手段进行基因克隆的新方法。已经公布的水稻基因组序列框架图 ,使得水稻的电子克隆路线得以实施。介绍了水稻电子克隆的基本原另、应用实例、相关的生物信息资源。

水稻葡萄糖-6-磷酸脱氢酶cDNA的电子克隆

电子克隆是基因克隆的新策略。以小麦胞质葡萄糖 6 磷酸脱氢酶cDNA (Tagpdl克隆 )序列为信息探针 ,在GenBank水稻nr数据库中找到高度同源的水稻基因组序列 ,通过人工序列拼接及RT PCR确认得到了水稻该基因的全长cDNA序列 ,命名为OsG6PDH。OsG6PDH与小麦Tagpdl克隆的DNA一致率为 88% ,推导的氨基酸序列与小麦、番茄、烟草的胞质葡萄糖 6 磷酸脱氢酶基因的一致率分别为 89%、79%、80 %。经RT PCR表达谱分析 ,OsG6PDH在水稻幼穗、胚、根、叶中都有表达 ,在幼穗与根中表达略高。另外 。

人类TECTB基因的电子克隆

用小鼠和鸡的 β tectorin基因 (Tectb)的编码区序列对NCBI数据库进行Blastn比较 ,得到一个相似性很高的人的gDNA序列 (GenBank :AL15 7786 ) ,用GENSCAN、MZEF程序和Blast2sequence程序分析AL15 7786 ,推测AL15 7786中包含一个编码区由 10个外显子构成的基因———TECTB基因。人TECTB基因的开放阅读框为 990bp ,推测编码32 9个氨基酸。人TECTB基因与小鼠的Tectb基因在 990bp有 88 1%的一致性 ,在 32 9个氨基酸有 94 2 %的一致性。用Electronic PCR将人TECTB基因定位于 10q2 5。

人类新基因C17orf32的电子克隆和编码区序列RT-PCR验证

利用生物信息学与实验验证的技术路线 ,成功地克隆了人类新基因C17orf32的cDNA (GenBank登记号 :AY0 74 90 7和TPA :BK0 0 0 2 6 0 ) ,发现C17orf32的完整开放阅读框架 (ORF ,31～ 6 5 7bp)cDNA (6 2 7bp)与人类假定基因LOC12 4 919ORF (2 5～ 80 7bp)的 2 5～ 6 5 1位只有一个碱基不同 .经RT PCR验证并cDNA测序、人类表达序列标签 (EST)数据库的BLAST检索和基因组成规律分析三方面的结果 ,均支持C17orf32的序列 ,而不支持LOC12 4 919的编码序列 .C17orf32基因组序列全长 4 6 10kb ,含有 6个外显子和 5个内含子 ,cDNA序列全长 16 79bp ,ORF横跨全部 6个外显子 .该基因ORF翻译起始处符合Kozak规则 ,ORF起始码上游同一相位有终止码 ,ORF后有 2个加尾信号和PolyA尾 .C17orf32基因的成功克隆表明 ,NCBIGENOMEAnnotationProject在 2 0 0 1年 12月预测的人类假定蛋白XP- 0 5 886 5编码基因LOC12 4 919的模式参考序列XM- 0 5 886 5中存在偏差 ,即在C17orf32基因cDNA的 4 0 6与 4 0 7位碱基之间错误插入一个碱基G ,从而导致在插入位点后 ,ORF编码 12 5位氨基酸以后蛋白质序列的改变 ,出现 2 6 0个氨基酸的多肽 .因此 ,应慎重看待计算机注释的人类基因组编码序列 .

电子克隆技术及其在植物基因工程中的应用

电子克隆是随着基因组计划和EST计划的实施而发展起来的,是利用生物信息学手段进行基因克隆的新方法。它具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优点。因此,电子克隆技术必将成为植物基因工程中获得新基因的重要手段。阐述了电子克隆应用所依据的数据库与生物信息资源,介绍了利用电子克隆获得功能基因的方法,及其在植物基因工程中的应用现状与前景。

蜜蜂(Apis mellifera)腺苷酸转移载体基因cDNA的电子克隆

以果蝇腺苷酸转移载体基因cDNA序列为信息探针,对蜜蜂EST数据库进行同源检索筛选,克隆了蜜蜂腺苷酸转移载体基因(Am ant)的cDNA序列(GenBank登记号为AY332626),该基因全长1 251bp。经RT-PCR克隆、序列分析验证,结果表明与电子克隆序列完全一致;该基因具有完整的开放阅读框架(ORF),编码蛋白为300个氨基酸,通过对人、果蝇、家蚕及烟草天蛾的腺苷酸转移载体蛋白序列比较,发现该基因具有高度的保守性;说明根据物种间同源基因序列,进行跨物种EST数据库的同源检索筛选、拼接,是基因克隆的一条有效途径。

小麦TaLSD1锌指蛋白基因的电子克隆及序列分析

采用电子克隆与RT-PCR相结合的技术,在条锈菌(Pucciniastriiformis f.sp.tritici)侵染的小麦中克隆了一个LSD1型锌指蛋白基因,命名为TaLSD1(GenBank登录号为EF553327)。序列分析表明,该基因全长1024bp,编码生成1个包含3个保守LSD1型锌指结构(CxxCxRxxLMYxxGASxVxCxxC)且长度为146个氨基酸的多肽。进化树分析表明,TaLSD1与水稻(Oryza sativa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和芜菁(Brassica rapa)中部分含有3个保守LSD1型锌指结构的同源基因亲缘关系较近,而与其它包含不同数目的LSD1型锌指结构基因亲缘关系较远。推测TaLSD1在进化中丢失了部分序列,进而执行新的功能。半定量RT-PCR结果显示,该基因在亲和以及非亲和组合中的表达模式很相似,均表现在前期基因表达被抑制而后期恢复正常。初步推测TaLSD1在转录水平上的表达受光诱导,同时,作为一个细胞程序性死亡的负调控因子在小麦与条锈菌互作过程中起作用。

桃果实磷脂酶Dα基因的电子克隆及序列分析

【目的】克隆桃果实中的磷脂酶Dα基因,并对其进行序列分析和低温表达模式分析。【方法】采用电子克隆与RT-PCR相结合的方法分离桃果实PLDα基因cDNA全长序列;半定量RT-PCR和Northern杂交检测目的基因在桃果实低温贮藏过程中的表达情况。【结果】成功获得全长为2859bp的桃果实PLDα基因序列,该序列具有完整的开放阅读框架(ORF,172～2604bp),编码810个氨基酸。对ORF进行的RT-PCR验证结果与电子克隆序列一致。序列分析显示,桃果实PLDα基因编码的氨基酸序列与草莓、番茄、葡萄等物种的磷脂酶Dα氨基酸序列之间具有高度的保守性,含有N端C2结构域及两个保守的活性中心。半定量RT-PCR和Northern杂交分析显示,桃PLDα基因在低温贮藏过程中被诱导表达。【结论】本研究首次通过电子克隆的方法获得了桃果实PLDα基因的全长序列,揭示了其序列特征,并初步明确了其在桃低温贮藏期间的表达模式。结果证明基于EST数据库的电子克隆已经是获取植物新基因的有效途径,同时为更深入研究桃果实的耐冷性及低温贮藏方法奠定了基础。

大豆吡哆醇生物合成蛋白基因(PDX)的电子克隆和进化分析

电子克隆（In silicocloning）是随着基因组计划和EST计划实施而发展起来的利用生物信息学手段进行基因克隆的新方法。根据物种间同源基因相对保守的特点,以拟南芥（Arabidopsis thaliana）吡哆醇生物合成蛋白cDNA序列为信息探针,对大豆（Glycine max）EST数据库进行同源搜索和序列拼接,获得了1 280 bp长的大豆吡哆醇生物合成蛋白的基因序列（GenBank登陆号为DQ139265）。经过RT-PCR扩增、基因组PCR扩增、分子克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆序列完全一致。该基因具有完整的开放阅读框架（ORF,20~955 bp）,编码311个氨基酸。通过与水稻、日本百脉根、烟草、截形苜蓿等物种的吡哆醇生物合成蛋白序列比对,发现该基因具有高度的保守性。表明根据物种间同源基因序列,对跨物种间EST数据库进行同源检索、筛选、拼接,是克隆基因的有效途径。

运用基因组和EST数据库进行电子克隆分离杨树功能基因的策略

杨树是重要的造林绿化树种,也是主要的工业用材树种,还是高大林木的模式树种。进行杨树功能基因的挖掘、克隆和功能的研究,是当前杨树基因组学的首要任务之一,不仅可为杨树品种改良和基因资源的有效利用奠定基础,而且对探讨林木的生理及遗传特性分子机制也具有重要的理论意义。电子克隆是近年来伴随着基因组计划和EST计划发展起来的基因克隆新方法,具有成本低、速度快、技术要求低和针对性强等优点。丰富的杨树EST数据和公布的杨树基因组序列框架图,使得利用电子克隆技术开展杨树功能基因的分离和鉴定已经成为可能。本文阐述了电子克隆分离杨树功能基因的基本方法、相关的生物信息资源,并讨论了电子克隆技术存在的问题和未来发展。

大豆脱氢抗坏血酸还原酶基因的电子克隆及进化分析

利用生物信息学和实验验证的技术路线,以拟南芥脱氢抗坏血酸还原酶基因cDNA序列为信息探针,对大豆EST数据库进行同源搜索,经同源性比对和序列组装,获得全长为955bp的大豆脱氢抗坏血酸还原酶基因的cDNA序列(GenBank登录号为DQ006810),经RT-PCR扩增,分子克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆完全一致。该cDNA序列具有完整的开放阅读框架(ORF,36bp-815bp),推测编码蛋白为259个氨基酸。通过与几种植物脱氢抗坏血酸还原酶蛋白序列的比较,发现该基因具有较高的保守性。结果表明根据物种间同源基因序列,对跨物种间EST数据库进行同源检索筛选,拼接,是新基因克隆的一条有效途径。

应用EST和电子克隆策略研究血吸虫表达基因谱

目的开展血吸虫表达基因谱的研究,寻找新的疫苗候选分子和药物靶标。方法应用表达序列标签(EST)和电子克隆策略。结果获得了552个EST序列和487个电子延伸序列,其中104个EST序列在延伸前未表现同源性,而延伸后表现出有意义的同源性;获得了日本血吸虫基因表达谱的信息以及发现了有潜在药物和疫苗价值的新基因序列。结论本研究为日本血吸虫基因表达谱的研究提供更有效的研究思路。

猪TDRP1基因的电子克隆及生物信息学分析

利用生物信息学和比较基因组学方法,对猪TDRP1基因的结构、表达及功能进行分析,结果表明:(1)电子克隆获得猪TDRP1基因cDNA部分序列共776bp,包括119bp的5′UTR、561bp的编码区和96bp的3′UTR,共编码合成187个氨基酸多肽;(2)猪TDRP1基因CDS序列与人、小鼠和大鼠的同源性分别为85%、76.1%、77.1%.编码合成的猪TDRP1蛋白与人、小鼠、大鼠之间的同源性分别为82.5%、71.1%和70.1%;(3)猪TDRP1蛋白的相对分子质量为20489.8,不含信号肽,为1个可溶性蛋白,同时也是1个非分泌性蛋白,存在4个二级结构区段;(4)基于cDNA及EST数据库的检索显示,猪TDRP1基因至少在卵巢和甲状腺等组织中表达.

人和大鼠自噬相关新基因WIPI-3的电子克隆和序列分析

目的:人和大鼠WIPI-3基因的电子克隆和序列分析。方法:综合运用基因电子拼接和比较基因组分析等生物信息学手段进行新基因的电子克隆和注释。通过拼接CR593190、NM_019613和BC000974 cDNA序列获得人WIPI-3 cDNA全长序列,通过拼接EST序列CB727439、CB737031、BF557312、BG663387和预测的CDS获得大鼠WIPI3基因的cDNA序列。结果:成功克隆了人和大鼠自噬相关新基因WIPI-3的cDNA,上述两个新基因序列均得到了人类基因组序列和EST序列的双重支持,另外经RT-PCR验证电子克隆的基因序列也是正确的,而且序列均已被GenBank收录,其编号分别为:AM182326和NM_001039587。其中,人WIPI-3基因修正了目前基因库中注释的WIPI-3序列,而大鼠基因则是国际上首次克隆,并被确定为参考序列。结论:基因电子拼接结合种属同源基因比较分析,可大大提高电子克隆的精确性,这种方法可有效用于新基因的克隆和注释。

陆地棉GhNIP5.1基因的电子克隆及生物信息学分析

水通道蛋白（Aquaporin，AQP）是古老的通道蛋白MIP（Membrane intrinsic protein）家族成员之一，是广泛存在于动植物和微生物中，负责转运水分子和某些小分子物质的一类膜嵌入式蛋白。1992年，第一个植物水通道蛋白从拟南芥中分离获得，由于其定位在液泡膜，因此被命名为液泡膜内在蛋白（TIP）。

猪LBP基因电子克隆及生物信息学分析

利用电子克隆技术,以人脂多糖结合蛋白(LBP)基因(NM_004139)为种子序列,克隆猪LBP基因。结果表明:所克隆的LBP基因开放阅读框长为1 446bp,编码481个氨基酸。推导其氨基酸序列与人、小鼠、大鼠、牛、狗的相似性分别为74.2%、64.8%、63.2%、77.1%和74.6%。进化树分析显示,猪与牛LBP基因进化距离最近,与大鼠最远。生物信息学分析表明,所克隆的猪LBP蛋白分子大小为53.036 7ku,理论等电点为6.43;亚细胞定位预测猪LBP属于分泌蛋白,主要在线粒体(44.4%)和高尔基体(22.2%)中表达;N端存在信号肽,且在25～26位氨基酸可能存在裂解位点。N端的疏水性较强,且位于信号肽处,最大疏水性值为2.478,最大亲水性值为1.956;由胞外区(1～6位氨基酸)、跨膜区(7～29位氨基酸)和胞内区(30～481位氨基酸)3个部分组成的膜蛋白,有9个Ser、8个Thr和2个Tyr,可能成为蛋白激酶磷酸化的位点;LBP膜外区蛋白由多个α螺旋,膜内区由多个β折叠构成,α螺旋和β折叠平行交替排列,构成一个弯曲螺旋状结构;在33～256和271～474位氨基酸残基之间分别有1个BPI1和BPI2的保守结构域。