改良EMSA法分析人α1(Ⅰ)胶原基因序列特异性DNA结合蛋白

目的 :分析人α1( )胶原基因 5′侧翼区具有较高启动调控活性序列的 DNA结合蛋白。方法 :以原代培养人瘢痕皮肤成纤维细胞为胶原产生细胞 ,采用限制性内切酶消化、DNA混合片段末端标记和增强化学发光的改良电泳迁移率改变实验(EMSA)分析人 α1( )胶原基因 5′侧翼区 - 2 6 8～ + 42 bp序列 DNA结合蛋白。结果 :在胶原产生细胞——人瘢痕成纤维细胞中存在 α1( )胶原基因 - 2 6 8～ + 42 bp序列的 DNA结合蛋白 ,其结合活性具有特异性 ,并能被 Sp- 1,NF- 1,NF- κB识别序列所竞争。结论 :改良 EMSA法可用于分析较长序列的 DNA结合蛋白 ,人 α1( )胶原基因 - 2 6 8～ + 42 bp序列中存在转录因子Sp- 1,NF- 1,NF- κB结合序列 ,这些转录因子结合位点可能与人 α1( )胶原基因 - 2 6 8～ + 42 bp序列的高启动活性有关。

银染法用于EMSA分析检测三链核酸形成

目的 探讨银染法在三链形成的电泳迁移率改变分析 (EMSA)中的可行性 ,从而为三链核酸研究提供有效的非同位素检测方法。 方法 三链形成反应后进行 EMSA分析 ,然后用银染显示电泳形成的 DNA区带。 结果 银染法显示出三链的 EMSA滞后带 ,并揭示三链形成的平台效应。 结论 本文首次表明银染法可用于三链形成的 EMSA分析快速检测 ,且 SOX9基因内含子

转录因子CREB激活介导吗啡依赖SK-N-SH细胞的nNOS及fosB基因表达的调控机制

目的 探讨吗啡依赖的SK- N -SH细胞表达神经元型一氧化氮合酶 (neuronalnitricoxidesynthase ,nNOS)及fosB基因的调控机制。方法 建立吗啡依赖及戒断细胞模型 ,体外合成含cAMP反应元件 (cAMPresponseelement ,CRE)序列的寡核苷酸 ,经硫代磷酸化修饰 ,作为单链寡核苷酸 (CRE transcriptionfactordecoyoligodeoxynucleotide ,CRE decoyODN)。分别采用电泳迁移率改变分析 (electrophoresismobilityshiftassay ,EMSA)及RT -PCR技术 ,检测CRE decoyODN对吗啡依赖及纳络酮急性戒断诱导的CREB的DNA结合活性、nNOS及fosBmRNA表达的影响。结果 吗啡依赖及纳络酮急性戒断使SK- N- SH细胞的CREB的DNA结合活性、nNOS及fosBmRNA明显升高 ,CRE decoyODN可特异抑制上述指标升高。结论 CREB的激活介导了吗啡依赖SK- N

CRE-decoy ODN对大鼠吗啡戒断症状的抑制作用

目的研究以转录因子CREB为靶点的CRE-decoy ODN对大鼠吗啡戒断症状的影响。方法合成全硫代磷酸化ODN。实验分为5组:0.9%氯化钠溶液对照组,侧脑室0.9%氯化钠溶液注射对照组,吗啡依赖组,吗啡戒断组,吗啡戒断CRE-decoy ODN治疗组。制备吗啡身体依赖模型:采用递增剂量皮下注射吗啡建立大鼠吗啡身体依赖模型。0.9%氯化钠溶液对照组和侧脑室0.9%氯化钠溶液注射对照组大鼠注射等体积0.9%氯化钠溶液。对吗啡戒断治疗组大鼠在末次吗啡注射前30h,每只大鼠于左侧侧脑室内注射CRE-decoy ODN 20μg,侧脑室0.9%氯化钠溶液注射对照组、吗啡依赖组和吗啡戒断组每只大鼠则于左侧侧脑室内注射等体积0.9%氯化钠溶液。吗啡戒断大鼠的行为学评定:腹腔注射纳络酮后,由不知情的观测者随即观测大鼠的戒断行为,每15分钟为一时间段,连续观测1h内上述行为的发生频率,最后计算戒断0～60min的总评分。进行体重丢失的戒断评分:体重丢失百分率(ΔW)=纳络酮注射前与注射1h后的体重差/纳络酮注射前体重×100%。结果 CRE-decoy ODN明显抑制吗啡戒断大鼠0～60min戒断症状的总评分,使其从(24.0±0.7)分降至(15.0±0.9)分(P<0.01)。CRE-decoy ODN明显抑制吗啡戒断大鼠0～60min的体重丢失,反映戒断症状综合性指标的体重丢失百分率ΔW从(7.2±1.2)%降至(4.1±0.8)%(P<0.01)。结论 CRE-decoy ODN明显减轻吗啡戒断大鼠的戒断症状。

活血承气汤对小肠缺血再灌注家兔小肠及肺组织NF-κB活性的影响

目的:观察和探讨应用活血承气汤(HXCQ)对小肠缺血再灌注家兔小肠及肺组织NF-κB活性的影响。方法:建立小肠缺血再灌注家兔模型,采用电泳迁移率改变分析方法(electrophoretic mobility shiftassay,EMSA),分析活血承气汤灌胃后不同时段小肠缺血再灌注家兔小肠以及肺组织NF-κB活性的变化。结果:应用活血承气汤后小肠缺血再灌注家兔小肠和肺组织NF-κB活性显著降低。结论:应用活血承气中药可显著减轻小肠缺血再灌注引起的小肠及肺组织损伤。

青蒿素对糖尿病大鼠肾组织NF-κB的DNA结合活性升高的抑制作用

目的探讨青蒿素对实验性糖尿病大鼠肾组织核因子-κB(NF-κB)的DNA结合活性升高的抑制作用。方法选择雄性SD大鼠15只,随机分成正常对照组(A组)、糖尿病组(B组)及青蒿素治疗组(C组),采用腹腔单剂量注射链脲佐菌素(STZ)65 mg/kg方法建立糖尿病大鼠模型。C组给予青蒿素300 mg/(kg·d)腹腔注射。于实验第4周应用电泳迁移率改变分析(EMSA)法检测3组大鼠肾皮质细胞NF-κB的DNA结合活性,并观察实验大鼠肾脏的病理学变化。结果 B组大鼠肾细胞NF-κB的DNA结合活性显著上调;C组NF-κB的DNA结合活性显著较B组下降,肾脏组织的病理学损伤亦减轻。结论青蒿素可明显改善糖尿病大鼠肾脏组织病理学改变,通过抑制糖尿病大鼠肾脏组织细胞NF-κB的DNA结合活性上调可能是相关作用机制之一。

hPOT1基因过表达对HeLa细胞细胞周期和凋亡的影响

目的观察人POT1(protectionoftelomeres1)基因过表达对HeLa细胞细胞周期和细胞凋亡的影响。方法利用本课题组构建的hPOT1基因真核表达重组质粒pcDNA3-hPOT1,经脂质体介导瞬时转染HeLa细胞;通过RT-PCR和EMSA法(电泳迁移率改变分析)检测外源基因的表达效果,流式细胞术分析细胞周期,Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡。结果pcDNA3-hPOT1重组质粒转染HeLa细胞48h后,mRNA和蛋白质分析表明,外源性hPOT1基因能在HeLa细胞中有效表达,HeLa细胞阻滞于细胞周期S期,而对凋亡无明显影响。结论hPOT1基因可能参与了高等真核细胞细胞周期调控过程,但与细胞凋亡无密切关系。

活血承气合剂对小肠缺血再灌注家兔小肠及肺组织NF-κB活性的影响

目的观察和探讨应用活血承气中药对小肠缺血再灌注家兔小肠及肺组织NFκB活性的影响。方法建立小肠缺血再灌注家兔模型,采用电泳迁移率改变分析方法(electrophoreticmobilityshift assay,EMSA),分析服用活血承气合剂后不同时段小肠缺血再灌注家兔小肠以及肺组织NFκB活性的变化。结果应用活血承气中药后小肠缺血再灌注家兔小肠和肺组织NFκB活性显著降低。结论应用活血承气中药可显著减轻小肠缺血再灌注引起的小肠及肺组织损伤。

青蒿素对糖尿病大鼠肾组织AP-1的DNA结合活性升高的抑制作用

目的探讨青蒿素对实验糖尿病大鼠肾组织转录因子活化蛋白-1(AP-1)的DNA结合活性升高的抑制作用。方法将75只实验大鼠分成正常对照组(A组)、糖尿病非治疗组(B组)及青蒿素治疗组(C组),B、C组应用腹腔单剂量注射链脲佐菌素(STZ)65 mg/kg建立糖尿病大鼠模型。C组给予腹腔注射青蒿素300 mg/(kg·d)。于实验进行到第4周时处死各组大鼠,取部分右肾皮质,应用电泳迁移率改变分析(EMSA)法观察青蒿素对实验糖尿病大鼠肾组织AP-1的DNA结合活性的影响,并制备病理切片以观察肾组织的病理学变化。结果 B组大鼠肾细胞AP-1的DNA结合活性较A组显著上升,C组大鼠对肾细胞AP-1的DNA结合活性有显著抑制作用,并显著改善糖尿病大鼠肾脏组织的病理变化。结论青蒿素通过下调糖尿病大鼠肾组织AP-1的DNA结合活性上调而改善糖尿病大鼠肾脏组织病理改变。

人肺癌细胞转录因子——C/EBP和HMG样蛋白的EMSA检测

目的 检测人肺癌细胞中是否存在与Na+ H+ 交换蛋白 1(NHE 1)基因转录相关的重要转录因子———C EBP和HMG样蛋白。方法 采用电泳迁移率改变分析法 (EMSA)检测人肺癌细胞株核蛋白中C EBP和HMG样蛋白的表达及其水平。结果 EMSA检测到A5 49细胞和转染NHE 1反义载体的A5 49细胞均有转录因子C EBP和HMG样蛋白的表达 ,且后者表达水平高于前者 ;采用 5 0倍未标记的片段能完全抑制相应转录因子与32 P标记的相同片段的结合。结论 A5 49细胞核蛋白中存在能与C EBP结合序列和Poly(dA∶dT)区结合的转录因子 ,即C EBP和HMG样蛋白 ,后者的表达水平高于前者。特异性竞争抑制试验表明外源性特异DNA片段能抑制相同片段与转录因子的结合。

CREB诱骗寡核苷酸抑制吗啡依赖诱导SK-N-SH细胞神经元型一氧化氮合酶及fosB基因表达上调

目的研究转录因子CREB的结合位点cAMP反应元件(cAMPresponseelement,CRE)的诱骗寡核苷酸(CREtranscriptionfactordecoyoligodeoxynucleotide,CREdecoyODN)对吗啡依赖SKNSH细胞的神经元型一氧化氮合酶(Neuronalnitricoxidesynthase,nNOS)及fosBmRNA表达上调的抑制作用。方法建立吗啡依赖SKNSH细胞模型,体外合成含CRE序列的寡核苷酸,作为CREdecoyODN,与阳离子脂类N[1(2,3dioleoyloxy)propyl]N,N,Ntrimethylammoniummethylsulfate(DOTAP)混合后导入细胞。采用放射自显影检测细胞内参入的CREdecoyODN。采用电泳迁移率改变分析(Electrophoresismobilityshiftassay,EMSA)及RTPCR技术,分别检测CREdecoyODN对吗啡依赖诱导的CREB的DNA结合活性、nNOS及fosBmRNA表达的影响。结果CREdecoyODN可在细胞内稳定存在,特异抑制吗啡依赖SKNSH细胞CREB的DNA结合活性升高、nNOS和fosBmRNA表达上调。结论CREdecoyODN通过特异抑制吗啡依赖SKNSH细胞的CREB的DNA结合活性而下调nNOS及fosBmRNA表达。

电刺激小脑顶核对缺血／再灌注大鼠脑组织内NF-κB活性及其活化的影响

目的观察Wistar大鼠局灶脑缺血/再灌注后,脑内核因子-κB(NF-κB)活性及其活化的基本规律,并探讨电刺激小脑顶核(FNS)对其影响。方法成年雄性Wistar大鼠27只,随机分为正常组、单纯局灶脑缺血/再灌注组(模型组)和局灶脑缺血/再灌注+电刺激小脑顶核治疗组(FNS治疗组)。采用线栓法制备右侧大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,缺血时间均为2 h,根据再灌注时间分为缺血2 h/再灌注3,6,1 2和24 h组。模型组不给予任何干预处理,FNS治疗组在缺血2 h再灌注即刻给予FNS治疗1 h。用Western blot法捡测缺血脑组织核抽提物中NF-κB p65蛋白的表达,用电泳迁移率改变分析法(EMSA)检测核抽提物中NF-κB DNA的结合活性。结果正常组大鼠脑组织核抽提物中有少量NF-κB p65蛋白,NF-κB DNA结合活性较弱。模型组再灌注各时间点,即再灌注3,6,12和24 h．NF-κB p65蛋白含量均高于正常组,其中再灌注6 h和12 h均显著高于正常组(P＜0．05)。模型组NF-κB p65蛋白含量变化趋势为：再灌注3 h＜再灌注6 h＜再灌注12 h,再灌注12 h达峰值,各组间差异具有统计学意义(P＜0．05)；再灌注24 h时NF-κB p65蛋白含量明显低于再灌注6 h和12 h(P＜0．05)。模型组NF-κB DNA结合活性除再灌注3 h外,其余3个时间点均显著高于正常组(P＜0．05)；模型组再灌注3 h时,NF-κB DNA结合活性明显弱于组内其余3个时间点(P＜0．05),这3个时间点均为高活性状态,组内差异无统计学意义(P＞0．05)。FNS治疗组NF-κB p65蛋白含量及NF-κB DNA结合活性的变化趋势与模型组相似。其中,再灌注6 h和12 h时,FNS治疗组NF-κB p65蛋白含量明显低于模型组相应时间点(P＜0．05)；再灌注6,12和24 h时,FNS治疗组NF-κB DNA结合活性也明显低于模型组相应时间点(P＜0．05)。结论大鼠局灶脑缺血/再灌注后缺血脑组织中NF-κB活化明显,活性增强；FNS可下调NF-κB活化程度,抑制NF-κB DNA结合活性,这可能是FNS具有“抗炎”作用的重要机理之一。

姜黄素对糖尿病大鼠肾组织NF-κB的DNA结合活性升高的抑制作用

目的探讨姜黄素对糖尿病大鼠肾组织核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的DNA结合活性升高的抑制作用。方法将大鼠随机分为正常对照组(A组)、糖尿病组(B组)及姜黄素治疗组(C组),采用腹腔单剂量注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)65mg/kg建立糖尿病大鼠模型。治疗组给予姜黄素30mg·kg-1·d-1腹腔注射。实验第4周各组分别宰杀5只大鼠,取部分右肾皮质,采用电泳迁移率改变分析(electro-phoresis mobility shift assay,EMSA)检测姜黄素对糖尿病大鼠肾组织NF-κB的DNA结合活性升高的影响,并观察肾组织的病理变化。结果糖尿病大鼠肾组织NF-κB的DNA结合活性明显升高,姜黄素对其有显著抑制作用,并改善糖尿病大鼠肾脏病变。结论姜黄素通过抑制糖尿病大鼠肾组织NF-κB的DNA结合活性升高而减轻糖尿病大鼠肾脏病变。

姜黄素对糖尿病大鼠肾组织AP-1的DNA结合活性升高的抑制作用

目的探讨姜黄素对糖尿病大鼠肾组织转录因子活化蛋白-1(activator protein-1,AP-1)的DNA结合活性升高的抑制作用。方法大鼠随机分为正常对照组(A组)、糖尿病组(B组)及姜黄素治疗组(C组),采用腹腔单剂量注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)65mg/kg建立糖尿病大鼠模型。治疗组给予姜黄素30mg/kg.d腹腔注射。实验第4周各组分别宰杀5只大鼠,取部分右肾皮质,采用电泳迁移率改变分析(elec-trophoresis mobility shift assay,EMSA)检测姜黄素对糖尿病大鼠肾组织AP-1的DNA结合活性的影响,并观察肾组织的病理变化。结果糖尿病大鼠肾组织AP-1的DNA结合活性明显升高,姜黄素对其有显著抑制作用,并减轻糖尿病大鼠肾脏病变。结论姜黄素通过抑制糖尿病大鼠肾组织AP-1的DNA结合活性升高而减轻糖尿病大鼠肾脏病变。