川东北地区腹泻牛群中牛病毒性腹泻病毒的分子流行病学调查及病毒分离鉴定

为了掌握川东北地区腹泻牛群中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的感染情况和主要流行基因型及亚型,采用RT-PCR方法对采集于川东北地区临床腹泻牛粪便样品进行了病原学检测。根据5'-UTR基因序列进行遗传变异分析和基因分型鉴定,并对RT-PCR阳性样品进行了病毒的分离鉴定。结果显示:97份腹泻样品中BVDV平均阳性感染率为9.28%,达州市的阳性率最高(13.04%)、巴中市的阳性率最低(5.26%)。在5'-UTR基因系统进化树中9份阳性样品均为BVDV-1型,包括BVDV-1a(n=2)和BVDV-1b(n=7),经细胞培养、RT-PCR检测、间接免疫荧光检测共分离鉴定出2株致细胞病变型BVDV。表明川东北地区腹泻牛群中均存在BVDV感染,流行的优势基因亚型为BVDV-1b,丰富了BVDV的分子流行病学资料,为川东北地区BVDV的综合防控提供了理论基础。

福建省甲型H1N1流感病毒分离及首例分离株全基因组序列分析

目的分离甲型H1N1流感病毒,分析福建省首例病毒分离株全基因组序列和遗传特征,为研究病毒进化、致病性、流行规律提供科学依据。方法采用MDCK细胞和Real-time PCR法进行病毒分离、鉴定;提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增其8个基因片段,测定核苷酸序列,利用生物信息软件拼接全基因组序列;分析重要基因位点,利用GENBANK中相关序列对首例病毒分离株A/Fujian/01/2009(H1N1)进行基因进化树分析。结果从82例甲型H1N1流感确诊病例标本中分离出50株甲型H1N1流感病毒,第一代分离阳性率60.98%。在福建省首次获得甲型H1N1流感病毒株及全基因组序列。基因组序列分析证明:该毒株与2009年大流行株高度同源,其基因组存在四源重组现象;氨基酸位点分析其对达菲药物敏感,对金刚烷胺类药物耐药;相对于猪流感代表株A/Swine/Iowa/15/1930(H1N1)存在6个HA抗原决定簇位点变异。结论MD-CK细胞对甲型H1N1流感病毒具有较高敏感性;福建省首例甲型H1N1流感病例分离病毒株与北美流行株高度同源;相对于以往古典型猪流感代表株出现了HA蛋白抗原性漂移;为今后进一步开展甲型H1N1流感病毒分子生物学研究奠定基础。

中国部分地区2005-2007年猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株ORF5基因和Nsp2基因遗传变异分析

【目的】为分析2005-2007年间中国部分省区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的分子生物学特征,了解其遗传演化规律,查明中国目前PRRSV流行毒株现状。【方法】应用病毒分离方法从中国4个省份在2005-2007年间采集的81份疑似蓝耳病病料中分离到36株猪繁殖与呼吸综合征病毒,应用RT-PCR方法对36株PRRSV现地分离株的ORF5基因和Nsp2基因进行扩增和序列分析。【结果】36株现地分离株均属于美洲型PRRSV,ORF5基因全长均为603bp,未发现有基因缺失或插入,编码约200个氨基酸,分离株推导氨基酸序列变异主要发生在9～39位;36个分离株中有15株PRRSVNsp2基因全长为2940bp,21株PRRSVNsp2基因全长为2850bp;发生Nsp2缺失的PRRSV在Nsp2基因第481位、532～560位发生了不连续缺失,共缺失30个氨基酸。与GeneBank中收录的14个PRRSVORF5、Nsp2基因进行核苷酸及氨基酸序列比较和分析,系统进化关系显示,除B02-2005株可能与疫苗株有关外,多数现地分离株与Ch-1a株遗传距离较近,不同年份分离到的毒株与早期PRRSV分离株的同源性逐年降低。【结论】根据氨基酸变异情况对PRRSV现地分离株进行亚群聚类分析,发现36株现地分离株分别归属于以VR-2332为代表的4亚群,以BJ-4为代表的1亚群和以Ch-1a为代表的2亚群。进化关系表明PRRSVORF5、Nsp2基因及其推导的氨基酸序列均发生了较大变异,不同地区PRRSV分离株的遗传关系存在交叉现象,地域特征不明显。

我国2000～2001年J亚群禽白血病病毒分离株gp85基因的序列比较

以相当于 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)原型株 HPRS- 10 3基因组碱基 #5 394～ #5 416及 #7811～ #7794的 1对引物做 PCR,在 2 0 0 0～ 2 0 0 1年从山东、河南和宁夏分离的 8株 AL V- J中 ,有 6株可以扩增出含 gp85基因的 2 .2 kb左右的特异性片段。对其中 5株的扩增片段做了序列分析 ,结果表明 ,这 5个毒株的囊膜糖蛋白 gp85与原型株 HPRS-10 3有 93.4%～ 96 .8%的同源性 ,与我国最早的分离株 SD990 2有 93.7%～ 98.7%的同源性 ,它们相互之间的同源性为 91.2 %～ 98.7%。由此说明 ,我国 AL V- J的 gp85基因正在不断发生变异。

蛋清样品用于禽白血病病毒分离的效果评估

为评估蛋清样品在禽白血病病毒(ALV)分离中的作用,从广东某地方鸡种群采集种蛋1673个,经ALV p27抗原ELISA检测,将阳性蛋清分为5个不同S/P值区间(A≥2.0,1.5≤B<2.0,1.0≤C<1.5,0.5≤D<1.0,0.2≤E<0.5)并设立对照区间(F<0.2),分别同时接种DF-1细胞和CEF细胞进行病毒分离,通过PCR方法对其中20份DF-1细胞培养物p27抗原阳性样品进行亚群鉴定。从送检种蛋蛋清共检出ALVp27阳性样品107份,阳性率为6.4%(107/1673);不同S/P值区间蛋清病毒分离情况分别为:A区间CEF和DF-1细胞病毒分离率均为100%(27/27);B区间为80%(16/20,CEF)和75%(15/20,DF-1细胞);C区间为55.6%(10/18,CEF)和33.3%(6/18,DF-1细胞);D区间为36.4%(8/22,CEF)和9.1%(2/22,DF-1细胞);E区间为5%(1/20,CEF)和0%(0/20,DF-1细胞);对照组F区间为8.3%(1/12,CEF)和0%(0/12,DF-1细胞)。PCR结果显示,20份样品中均有ALV-J感染,其中6份为ALV A&J共感染。结果表明从蛋清样品可以分离出外源性和内源性ALV;从ALVp27抗原ELISA高S/P值的蛋清易分离出外源性ALV;低S/P值的阳性蛋清样品很可能是由内源性ALV引起,这给临床上禽白血病的净化检测造成一定的"误诊";该地方鸡种群不仅存在至少两个亚群外源性ALV,也有内源性ALV。

蛋鸡网状内皮组织增生病病毒分离鉴定

山东某鸡场饲养的10000只父母代海兰蛋种鸡于育成前期出现进行性消瘦、生长发育不良等症状;剖检以腺胃肿胀、淋巴器官萎缩为特征,至70日龄发病率达90%;经ELISA方法检测抗体及间接免疫荧光原位病原检测证明该病与网状内皮组织增殖病病毒(REV)感染有关。取7只病鸡肝脏研磨处理后接种鸡胚成纤维细胞(CEF),用REV单抗11B118进行间接免疫荧光检测,结果均呈阳性;根据REV-HA株前病毒基因组DNA env囊膜糖蛋白基因序列设计引物,提取阳性CEF基因组DNA作为模版,PCR扩增后得到438 bp的目的片段;PCR产物测序结果比对显示,该毒株与其他中国野毒株的同源性高于与REV-HA株的同源性。综合诊断判定该病可能与鸡群早期感染致病力较强的REV有关。

江西省汉坦病毒分离及其S和M基因特征分析

目的对2011年江西省采集的鼠肺标本进行汉坦病毒的分离鉴定,了解分离病毒株的基因特征。方法采用Vero-E6细胞对阳性鼠肺标本进行病毒分离,采用直接免疫荧光法和RT-PCR方法对毒株进行鉴定。扩增分离株的S、M片段基因进行克隆测序。运用DNAstar软件包和MEGA3.1软件对序列进行分析。结果从15份标本分离到2株来自褐家鼠的汉城型汉坦病毒。对其中1株病毒的S、M片段进行了克隆和序列测定,其中S片段含1 772个核苷酸,编码429个氨基酸;M片段含3 651个核苷酸,编码1 133个氨基酸。经核苷酸和氨基酸同源性分析,新分离株与国内外汉城型病毒核苷酸同源性94.8%~98.0%,氨基酸同源性98.2%~99.6%。与汉城型标准株80-39株相比,S片段仅1个氨基酸位点发生变异;M片段有9个氨基酸位点发生变异,糖基化位点的数目和位置没有发生变化。结论从江西省褐家鼠分离到两株汉城型病毒,病毒基因变异较小,型别相对稳定。

广东地区鸽禽Ⅰ型副黏病毒分离株生物学特性研究

鸽禽Ⅰ型副黏病毒（Avian Paramyxovirus TypeⅠ，PA／PMV—Ⅰ）感染，因其病原及症状均与鸡新城疫（ND）十分相似，通常又称之为鸽新城疫，或鸽瘟，是鸽的一种急性烈性传染病。近年来我们从广东的深圳、东莞、广州市郊等地区发病鸽群中分离并鉴定到23株禽Ⅰ型副黏病毒，对其中6株病毒进行生物学特性研究。

猪流行性腹泻病毒分离鉴定与实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

采用Vero-76细胞系从临床样品小肠内容物中分离到1株猪流行性腹泻病毒(PEDV),通过RT-PCR进行了鉴定。针对PEDV,参照保守的M基因序列设计了特异性引物和探针,建立了针对PEDV特异性的实时荧光定量RT-PCR检测方法(PEDV-rRT-PCR)。所建立的方法特异性强,与传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪细小病毒等猪主要病原体无交叉反应;方法灵敏度高,检测灵敏度达到重组质粒10-8稀释度(约20cop);重复性好,组内变异系数≤0.26%。20份田间样品检测结果表明,所建立的PEDV-rRTPCR方法快速、灵敏,检测结果准确可靠,适合用于PEDV的快速检测和流行病学调查。

上海市定点监测猪群伪狂犬病病原学调查与病毒分离鉴定

为了解上海市定点监测猪群伪狂犬病病毒(PRV)感染情况,对2014—2015年来自兽医疾病诊断中心、种猪场、屠宰场和规模场的1 863份样品进行PRV荧光定量PCR检测。结果显示,共检出48份PRV核酸阳性,总阳性率为2.6%(48/1 863),其中2014年为4.3%(39/898),2015年为0.9%(9/965),呈现大幅下降趋势,表明上海市通过加强PR免疫,淘汰散养和中小型养殖场,加强种猪场PR净化等措施,使本市猪群的PRV感染得到了有效控制。对部分阳性样品用BHK-21细胞进行PRV分离鉴定,共获得12株病毒,并对其中1株毒株进行了病毒毒价测定,获得了稳定的毒价,这为下一步的动物试验奠定了良好基础。

江西省高安市两株汉城病毒分离鉴定及全基因组序列分析

目的对2021年江西省高安市采集的鼠肺样本进行肾综合征出血热汉坦病毒分离鉴定及全基因组序列进行分析。方法采用Vero-E6细胞分离肾综合征出血热汉坦病毒,采用实时荧光RT-PCR法和直接免疫荧光法对分离株进行鉴定,采用高通量测序技术对分离株进行全基因组测序,采用CLC、MEGA7.0等软件对基因组序列进行分析。结果从褐家鼠和罗赛鼠各分离到1株汉城病毒(Seoul orthohantavirus,SEOV),分别命名为GAW30/2021、GAW50/2021。2株分离株的3个基因片段大小相同,每个基因编码区长度一致。分离株S、M、L基因分别含1773、3651、6530个核苷酸,分别编码429、1133、2151个氨基酸。2株分离株3个基因核苷酸序列同源性分别为99.7%、99.0%、99.4%、氨基酸序列同源性分别为99.8%、99.7%、99.9%。2株分离株与国内外SEOV参考株全基因组核苷酸同源性为84.3%~94.9%,氨基酸同源性为96.1%~99.8%,在系统进化树上独立分枝。2株分离株与SEOV疫苗株基因组氨基酸同源性为97.6%~99.1%;核蛋白和糖蛋白免疫表位氨基酸序列与疫苗株一致。结论首次在江西省高安市鼠肺样本中分离到2株SEOV变异株,目前疫苗对变异株仍具有保护力。

多重PCR方法鉴定人巨细胞病毒临床病毒分离株

目的:应用多重PCR技术鉴定体外培养、分离获得的人巨细胞病毒(HCMV)临床病毒株。方法:以先天性感染HCMV的新生儿为研究对象,采集尿液标本进行病毒分离,将分离获得的临床低传代病毒感染HELF细胞,提取病毒DNA,针对较保守基因IE和LA,设计两对引物,同时扩增IE和LA基因,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析。结果:成功分离获得2株HCMV临床低传代病毒株(D2、D3),经多重PCR同时扩增出209bp(IE)和401bp(LA)目的片段。结论:多重PCR可以作为病毒分离后,基础研究中鉴定HCMV临床病毒株的一种方法。

禽白血病p27抗原检测阳性与病毒分离的相关性比较

本试验以80只300日龄的A品系蛋鸡为试验对象,分5个日龄段按翅号采集蛋清、泄殖腔棉拭子,无菌抗凝血和血清。用ALV p27抗原检测试剂盒检测蛋清和泄殖腔棉拭子。将无菌抗凝血分离血浆接种DF-1细胞,培养一周后用同样方法检测上清收集液,分析该群鸡只在不同日龄段泄殖腔棉拭子阳性、蛋清样本阳性和病毒分离阳性之间的相关性。用ALV-Ab抗体试剂盒检测各日龄段血清的抗体水平。此外,选取某一日龄段蛋清和泄殖腔拭子样本用4个不同厂家的ALV p27抗原检测试剂盒进行检测比较。结果表明,5个日龄段泄殖腔棉拭子平均阳性率为61%,蛋清样本平均阳性率为72.6%,病毒分离平均阳性率为48.8%。5个日龄段ALV的抗体阳性率一直为零;4个厂家的ELISA试剂盒对同一批样本的检测结果表明,IDEXX试剂盒的敏感度最高。本试验为外源性鸡白血病病毒检测及鸡白血病净化其方法的应用、试剂盒的选择、减少判定的误差、提高净化效果提供了一定的科学依据。

水禽流感病毒分离株A/Duck/Yangzhou/233/02(H6N2)膜蛋白基因遗传进化分析

采用常规的血清学收验和特异性RT-PCR方法对华东地区家养水禽中流感病毒的带毒状况进行两年多的监测,分离鉴定出多株H6亚型禽流感病毒。对其中的一株A/Duck/Yangzhou/233/02(H6N2)(简称DkYZ23302)(H6N2)的表面膜蛋白基因进行了序列测定,并与GenBank中收录的其它序列进行了比较,遗传进化结果表明DkYZ23302的血凝素基因(HA)与近年香港分离的鸭源毒株DkHK346199(H6N1)、中国台湾鸡源毒株CkTaiwanna398的亲缘关系最近;而神经氨酸酶基因(NA)遗传进化分析结果表明DkYZ23302(H6N2)的NA基因起源于禽源H9N2亚型流感病毒,这可能是不同亚型禽流感病毒在水禽体内发生基因重配的结果。DkYZ23302(H6N2)的HA推导的氨基酸剪切位点序列为P-Q-I-E-T-R-D,为典型低致病性禽流感病毒的特征序列,与对SPF鸡的致病力试验相吻合。

小鼠诺如病毒分离鉴定及病毒衣壳蛋白基因序列分析

目的了解广东地区小鼠诺如病毒（murine norovirus,MNV）的分子遗传特征和进化来源。方法采用小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞对RT-PCR检测为阳性的小鼠样本进行病毒分离,通过细胞病变、RT-PCR、间接免疫荧光试验、测序方法对病毒分离株进行鉴定。应用RT-PCR技术针对15株MNV分离株的VP1基因的1626个核苷酸片段进行基因扩增,将扩增产物连接在pMD18-T载体后转化到大肠杆菌中进行克隆。通过氨苄青霉素平皿筛选,将鉴定为阳性的克隆菌进行核苷酸序列测定及序列分析。将这15株MNV分离株与从GenBank获得的19株MNV参考株进行序列比较分析,基于VP1基因的1626核苷酸片段构建系统发生进化树,一起进行分子流行病学研究。结果从80个小鼠样本中分离到了15株MNV病毒,通过细胞病变试验、RT-PCR试验、间接免疫荧光试验和测序分析鉴定确认分离到的病毒为MNV。序列分析结果显示MNV分离株的VP1蛋白基因全长均为1626个核苷酸,广东地区15株MNV分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别在89.7%~100%和94.8%~100%之间,15株MNV分离株与其他19株MNV参考毒株核苷酸和氨基酸同源性分别在87.5%~92.9%和92.4%~98.2%之间。进化树分析表明来自设施A和设施D的13株病毒之间的亲缘关系较近,同属一个进化分支。来自设施B的ZD-1毒株和设施C的ZYY-163毒株与来自广东（K162）、日本（S7-P2、S7-PP3）、韩国（K4）和德国（Berlin/04/06/DE、Berlin/05/06/DE）同属另一个进化分支。结论成功分离到15株MNV病毒。遗传进化分析表明广东地区的MNV分离株来源并不相同,来自设施B和设施C的MNV分离株与国外分离株的亲缘关系较近,而来自设施A和设施D的13株MNV分离株可能是本地固有的毒株。

母猪猪痘的诊断及病毒分离

为确定江西某猪场部分母猪陆续发生皮肤痘斑的病原,根据猪痘病毒(AF410153.1)基因序列设计1对引物,采用PCR方法从发病母猪皮肤痘痂中扩增到猪痘病毒P35基因,与猪痘病毒参考毒株(AF410153.1)P35基因的核苷酸同源性为98%,说明该场母猪皮肤出现的痘斑是由猪痘病毒引起。利用PK15细胞从皮肤痘痂中分离到1株猪痘病毒,该毒株能在PK15细胞中连续传代,不产生严重的细胞病变(CPE)。采用间接ELISA方法对该场的10头母猪和8头肥猪血样进行猪痘病毒抗体检测,母猪和肥猪血清中猪痘病毒抗体阳性数分别为5头和4头,阳性率为50%。

胶体金法与病毒分离鉴定在流感诊断中的比较

[目的]比较流感病毒胶体金法快速诊断试剂盒与病毒分离鉴定方法在临床诊断应用中的优劣。[方法]采集临床流感样病人(ILI)鼻拭子标本,分别使用流感病毒胶体金法快速诊断试剂盒及病毒分离鉴定方法予以检测。[结果]2006年1月—2007年3月对851份样本进行现场快速检测,流感抗原阳性标本189份,阳性率为22.21%,其中A型为164份,B型为25份。在851份鼻拭子标本中分离到133株流感病毒株,其中125份为流感快速检测阳性标本。流感胶体金法快速检测试剂的灵敏度为93.98%,特异度为91.09%。[结论]采用胶体金法流感快速诊断试剂对早期流感样病人进行检测,能及时区别流感与其他上呼吸道感染,在临床诊治和流感爆发疫情处理上具有重要意义。