大黄鱼ATG5基因的分子特征及促进病毒增殖的作用

为探究大黄鱼自噬相关基因5(LcATG5)在病毒感染中免疫应答中的作用,本实验从大黄鱼中克隆得到了自噬相关基因ATG5(LcATG5),其开放阅读框(ORF)全长828个核苷酸,编码275个氨基酸的蛋白质,预测的分子量为32.3 ku,等电点为5.7。氨基酸序列比对和系统进化分析结果显示,Lc ATG5与其他物种ATG5之间的序列一致性较高,含有1个高度保守的APG5结构域,并且与棘头梅童鱼ATG5的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,LcATG5在所检测的11个组织或器官中均有表达,在血液中表达量最高,在脾脏中表达量最低;LcATG5在来源于大黄鱼头肾组织的原代粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞以及细胞系LYCK细胞中也均有表达,在原代粒细胞中表达量相对较高,而在巨噬细胞中相对较低;病毒类似物poly(I:C)刺激后,这4种免疫细胞中LcATG5的表达水平都显著上调,其在LYCK细胞中变化最为显著,刺激后12 h上调了3.93倍。过表达Lc ATG5的鲤上皮瘤(epithelioma papulosum cyprini,EPC)细胞受鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)感染48 h后,细胞病变效应(cytopathic effects,CPE)明显高于对照组,细胞培养上清中SVCV的滴度为10^(13.82)TCID_(50)/mL,高于对照组10^(9.27)TCID_(50)/mL,同时细胞内SVCV标志基因SVCV-G、SVCV-M和SVCV-P的表达量分别上调了13.77倍、15.72倍和11.39倍,表明Lc ATG5过表达促进了EPC细胞中SVCV病毒增殖,上述结果为深入研究自噬和自噬相关基因在鱼类病毒感染过程中的作用及机制奠定了基础。

伪狂犬病毒gI基因的克隆表达及其对病毒增殖的影响

从伪狂犬病毒 (PRV)国内地方分离Ea株基因组DNA片段中克隆了完整的gI基因 ,序列分析结果表明 ,gI基因编码区全长 1 1 0 1bp ,可编码 3 6 6个氨基酸残基 ,二级结构预测具有典型I型膜蛋白特征。与GenBank中收录的国外Rice株的同源比较发现 ,Ea株gI在核苷酸和氨基酸水平上均存在多处突变 ,尤其是潜在胞浆区中连续两个碱基的缺失导致移码突变 ,致使gI基因的读码框架后移 ,从而导致Ea株gI较rice株长 1 6个氨基酸残基。将gI基因克隆到真核表达载体pcDNA3 1 +中的人巨细胞病毒早期启动子下游 ,构建的真核表达质粒转染PK 1 5细胞 ,间接免疫荧光检测证实gI获得正确表达。进一步测定天然缺失gI的PRV弱毒Bartha株在表达gI细胞系和空白载体转染的对照细胞系中的蚀斑形成单位 (pfu)和组织细胞培养半数感染量 (TCID50 ) ,结果显示 :Bartha株在表达gI细胞系中的pfu和TCID50 分别为对照细胞系的 1 6 4 %和 2 0 0 %。

猪瘟病毒促进细胞自噬并利于病毒增殖

细胞自噬在病毒的增殖、释放中有着重要的作用,目前国内仍然没有猪瘟病毒与细胞自噬相互作用关系的报道。本研究旨在探讨猪瘟病毒Shimen株感染宿主细胞(ST)后对细胞自噬的影响,以及细胞自噬对病毒增殖的作用。通过透射电镜和自噬体标记分子LC3的荧光聚点的观察,直观判断病毒对自噬的影响;并通过Western blot,检测LC3蛋白和P62蛋白的表达量,以及LC3蛋白转化分析,确定猪瘟病毒感染促进细胞自噬发生。利用自噬促进剂雷帕霉素、抑制剂3-MA、自噬体与溶酶体融合阻断剂氯喹(CQ),以及自噬基因Beclin 1、LC3蛋白的干扰,调控自噬来研究自噬对病毒增殖的影响。结果表明,病毒感染细胞促进了细胞自噬的发生,且能形成完整的自噬过程,同时病毒利用细胞自噬来促进自身增殖。本研究为探索猪瘟病毒与宿主细胞相互作用关系增加了新的数据。

鳜亲环蛋白A在传染性脾肾坏死病毒增殖中的作用

为研究鳜亲环蛋白(CypA)在传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)感染中的作用,通过RT-PCR克隆了CypA全长开放读码框(SC-CypA)。结果表明SC-CypA基因全长495 bp,编码164个氨基酸,分子量为17.59 ku。通过Blast比对和同源性进化分析,发现其与人、鼠、原鸡和斑点鲖等物种的CypA具有高度相似性,表明SC-CypA属于CypA家族的成员。环孢素A(CsA)具有免疫抑制作用,是CypA的抑制剂。结果发现,CsA浓度与ISKNV增殖具有一定的剂量依赖关系;CsA作用不同时间对ISKNV均有抑制效果;CsA对ISKNV感染诱导的细胞因子的表达具有调节作用,能抑制IL-1β、IL-8、IL-18和ISG15的表达。研究表明,宿主的CypA对ISKNV的增殖起着重要的作用,通过添加其抑制剂CsA能有效抑制病毒的增殖。

甲肝和麻疹病毒混合感染人胚肺二倍体细胞病毒增殖动态及与细胞相互作用的研究

目的 探讨甲肝病毒 (HAV)和麻疹病毒 (MV)混合感染人胚肺二倍体细胞 2BS株 (2BS)病毒增殖动态及病毒与细胞相互作用的关系 ,为制备甲肝 -麻疹二联活疫苗提供基础资料。方法 将HAV和MV先后感染2BS ,应用细胞病理学、亲和素 生物素系统免疫组化技术和电镜技术检测HAV和MV在 2BS内增殖动态及 2种病毒与细胞的相互关系 ,观察HAV和MV在细胞内的超微结构。结果 HAV和MV能在同一种细胞基质中增殖 ,也能在同一个细胞中增殖 ,但 2种病毒与细胞的相互作用明显不同。

松毛虫病毒增殖新方法

大型围栏和开放式围栏是病毒增殖的两种新方法。大型围栏用塑料薄膜制成 ,长12～ 30m ,宽 1 8～ 2 5m ,四周用木桩固定 ,栏内设置悬挂松枝的桩或木杆 ;开放式围栏是用塑料薄膜围住一片低矮林分 ,面积为 2 0～ 4 0 0m2 。栏内幼虫投放量为 4～ 6kg/m2 ,感染浓度为(1～ 5 )× 10 7PIB/mL ,接种病毒后 13～

氧氟沙星对黄病毒增殖的影响

目的:寻找有效的抗黄病毒药物，为临床应用提供理论依据。方法:运用病毒滴定法和Western blot法，在培养细胞的增殖系中投入抗菌药氧氟沙星(OFLX)，观察其对病毒增殖的影响。结果:用OFLX(10 μg·ml-1)处理后产生的病毒量是对照组的61%，病毒E蛋白量合成减少。结论:OFLX对抑制病毒增殖有一定效果。

植物病毒增殖的数值研究与转基因植株的抗病毒机理

通过计算机模拟病毒增殖过程并结合对基因组ＲＮＡ高级结构的预测，对烟草花叶病毒增殖中的负链特异终止现象给出了理论解释，阐明了植物病毒交叉保护和转基因植物抗病毒机理，所得结论为设计新的研究转基因植物抗病毒机理的实验方案提供了思路．

水泡性口腔炎病毒增殖的初步探讨

自１９５７年Ｉｓａａｃｓ和Ｌｉｎｄｅｎｍａｎｎ发现干扰素至今，已有许多干扰素活性测定方法问世。目前国内外各型干扰素效价测定中，皆乐于使用水泡性口腔炎病毒（ＶＳＶ）作为攻击病毒（１），在本实验室，我们用鸡胚细胞进行ＶＳＶ的增殖，用ＴＣＩＤ５０微量滴定法...

利用小鹅瘟病毒增殖制备GPV沉淀抗原

将小鹅瘟病毒 (GPV)通过家禽胚胎传代增殖 ,取感染胚尿囊液制备了GPV沉淀抗原。其抗原在琼脂扩散反应和对流免疫电泳的试验中能够与小鹅瘟阳性血清出现沉淀线 ,而且与小鹅瘟标准抗原的沉淀线相吻合。所形成的沉淀反应能够被小鹅瘟阳性血清特异性地抑制 ,与其它常见的禽病血清不发生交叉反应。

怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因克隆、亚细胞定位和组织表达分析

通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选到怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因的核心片段,利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因,并采用生物信息学方法和实时荧光定量PCR进行序列分析和器官表达分析。结果表明,怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因cDNA总长度为888 bp,G+C含量为51.58%;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1由295个氨基酸组成,分子量33173.36 u,等电点9.16,为疏水性蛋白;二级结构由α-螺旋(43.73%)、β-片层(21.69%)、无规则卷曲(34.58%)构成;三级结构为单体;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1主要存在于内质网、内质网-质膜、细胞外、细胞质、线粒体和质膜中;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1在进化上与Aegilops tauschii subsp.tauschill(节节麦)、Triticum turgidum subsp.durum(硬粒小麦)、Hordeum vulgare(大麦)的亲缘关系较近,尤其是与Aegilops tauschii subsp.tauschill(节节麦)烟草病毒增殖蛋白1在进化上具有最高的亲缘关系。通过烟草叶片亚细胞定位分析表明,烟草病毒增殖蛋白1定位于细胞质(可能包括细胞膜)和细胞核膜中。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,烟草病毒增殖蛋白1基因在怀玉山三叶青2个栽培种中的表达存在器官特异性,怀玉2号在叶中表达量最高,怀玉1号在茎中表达量最高。怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1具有典型烟草病毒增殖蛋白1的结构特征,氨基酸序列及核酸序列与同源物种相似度高,在进化上高度保守,对进一步揭示该酶生物学功能具有重要意义。

BmCPV病毒增殖的组织病理研究

本研究采用石蜡切片技术,取健康的三龄起蚕经口接种 BmCPV 后不同时间段取中肠后部固定、制片,光学显微镜下观察家蚕中肠圆筒形细胞组织变化,作者认为随病毒的入侵复制增殖,病蚕圆筒形细胞出现的病理变化是与病毒复制增殖、多角体形成相关的,细胞内出现浅染小空白点时正是病毒发生基质与病毒粒子大量产生阶段;细胞松弛、先端膨大变形、出现多空泡时正是多角体逐步增多时期。结合电子显微镜的研究结果,光镜下观察的组织病变进一步说明病毒的复制和多角体的形成都是由细胞顶端部位开始,逐渐向基底部推进,最后新的多角体充满整个细胞,使细胞溃烂破裂,大量多角体和病毒粒子落到肠腔。

怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3基因克隆和功能分析

通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选到怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3基因的核心片段,利用RT-PCR技术克隆该病毒增殖蛋白3基因,并进行序列分析、亚细胞定位、器官表达分析和功能分析。结果表明:怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3基因cDNA总长度为873 bp,G+C含量为44.22%;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3由290个氨基酸组成,分子量33374.79 u,等电点9.72,为疏水性蛋白;二级结构由α-螺旋(57.24%)、β-片层(10.69%)、无规则卷曲(32.07%)构成;三级结构为单体;预测怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3主要存在质膜、液泡膜、内质网中;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3与葡萄烟草病毒增殖蛋白3(GenBank:XP_002275179.1、GenBank:XP_034684444.1)的同源性最高,同源性达到94.83%。通过烟草叶片亚细胞定位分析表明,烟草病毒增殖蛋白3定位于细胞质(可能包括细胞膜)和细胞核膜中。实时定量PCR结果显示,烟草病毒增殖蛋白3基因在怀玉山三叶青2个栽培种中的表达存在器官特异性,怀玉2号和怀玉1号均在叶中表达量最高;烟草病毒增殖蛋白3转基因阳性烟草的三叶青花叶病毒表达量显著高于烟草病毒增殖蛋白3转基因阴性烟草;与烟草病毒增殖蛋白3转基因阴性烟草相比较,烟草病毒增殖蛋白3转基因阳性烟草的净光合速率(P_(n))、气孔导度(G_(s))、蒸腾速率(T_(r))、最大光化学效率(F_(v)/F_(m))、实际光化学量子效率(ΦPSⅡ)、光化学淬灭系数(q_(P))及电子传递效率(ETR)显著下降,而非光化学淬灭系数(NPQ)显著上升。怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3具有典型烟草病毒增殖蛋白3的结构特征,氨基酸序列及核酸序列与同源物种相似度高,进化上高度保守,且可促进三叶青烟草花叶病毒的增殖,降低植株的光合作用效率。

怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因克隆及其功能分析

通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选得到怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因的核心片段,利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术克隆怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因,并对其进行序列分析、亚细胞定位和器官表达分析。结果表明,怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like基因cDNA总长度为828 bp,G+C含量为46.50%;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like由275个氨基酸组成,分子量为30728.97 u,等电点为5.39,为疏水性蛋白;二级结构由α-螺旋(28.36%)、β-片层(20.73%)、无规则卷曲(50.91%)构成;三级结构为单体跨膜蛋白;预测怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like主要存在液泡膜中;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like与葡萄烟草病毒增殖蛋白2A(GenBank:XP_034708140.1、XP_002279170.2)的同源性最高,同源性达到86.79%。通过烟草叶片亚细胞定位分析表明,烟草病毒增殖蛋白2A-like定位于细胞质和细胞核中。实时定量PCR结果显示,烟草病毒增殖蛋白2A-like基因在怀玉山三叶青2个栽培种中的表达存在器官特异性,怀玉2号和怀玉1号均在叶中表达量最高。怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白2A-like具有典型烟草病毒增殖蛋白2A的结构特征,氨基酸序列及核酸序列与同源物种相似度较高,进化上较为保守,且可降低植株的光合作用效率。

猪细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测不同接毒条件对病毒增殖效果的影响

为提高细小病毒(PPV)细胞培养的滴度,本试验通过对猪细小病毒(PPV)感染ST细胞接毒工艺各步骤的比较研究,从不同接毒方式、细胞接种量、病毒感作时间以及接种浓度等方面进行分析,利用猪细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法对病毒滴度进行检测。结果表明:ST细胞覆盖率接近单层时接毒,采用分步法接毒,以103倍稀释病毒接种,接种病毒后感作2h,将接毒后细胞维持液中血清浓度设为2%这5个方面的接毒工艺可提高PPV细胞培养的病毒滴度。

分子伴侣及在病毒增殖中的作用

随着蛋白质研究技术的不断发展,数以百种的蛋白质三维结构已研究的较为清楚,但对于这些蛋白质折叠成天然构象的途径和机制尚知之甚少.通常认为蛋白质的1级结构决定了蛋白质的3级和4级结构,但近年来研究表明,在很多蛋白质的折叠与装配过程中,有其他蛋白质或酶的参与,其中分子伴侣就是目前研究得最多也是研究最热的一种.病毒是细胞内寄生物,分子伴侣与病毒的增殖过程密切相关,从病毒复制的起始、转录的进行、翻译的完成到病毒粒子的装配成熟,甚至病毒在宿主体内的转运都有分子伴侣的参与.随着病毒与分子伴侣相互关系研究的深入,产生了抗病毒的又一可能新途径.

植物病毒增殖的超循环理论与抗病毒植物基因工程

考虑了两个典型的植物病毒ＴＭＶ和ＰＶＹ，从病毒基因组的复制、翻译和组装各个环节的反应方程出发得到了病毒增殖的动力学方程，这组方程是Ｅｉｇｉｎ超循环理论在病毒ＲＮＡ增殖系统中的应用和发展．通过方程可以对植物病毒增殖中的一些现象和转基因植物抗病毒机理给出理论解释．

鸡胚新城疫母源HI抗体及孵化条件对La Sota株病毒增殖的影响

将鸡新城疫La Sota株病毒接种于含有不同水平新城疫母源HI抗体的鸡胚中。在不同的孵化条件下孵育。测定母源抗体及孵化条件对病毒增殖的影响.结果表明,当免疫鸡胚的平均母源HI抗体为7.48log2时,平均病毒增殖滴度为10×7.32log2;而非免疫鸡胚平均母源HI抗体为2.55log_2(2.4～2.7log2)时,病毒增殖滴度平均可达10×8.25log_2。尽管后者比前者略高。但在统计学上无显著性差异.鸡胚接种后84～88小时病毒增殖滴度达到最高水平。在种毒1:40～1:200的稀释范围内,病毒的增殖滴度无明显影响.