猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬并增强病毒复制的研究

为研究猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)感染细胞是否诱导自噬及自噬对病毒复制的影响,本研究将SADS-CoV(MOI 0.1)接种Vero E6细胞培养36 h后,经透射电子显微镜观察可见,SADS-CoV感染的细胞中出现了包裹胞浆的自噬体样双层膜结构,证实SADS-CoV可以诱导Vero E6细胞发生自噬。构建pEGFP-LC3的真核表达质粒并经双酶切及测序鉴定正确后转染Vero E6细胞,24 h后以SADS-CoV感染,24 h后经激光共聚焦显微镜观察可见,与阴性对照组细胞相比,感染SADS-CoV的细胞出现绿色荧光的点状聚集。进一步将SADS-CoV(MOI 0.1)感染Vero E6细胞不同时间后通过western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和p62表达水平的变化,结果显示,与阴性对照组相比,SADS-CoV感染组LC3-Ⅱ的表达水平升高,LC3-Ⅱ/GAPDH比值呈上升趋势,而p62蛋白表达水平则显著降低(P<0.05),表明SADS-CoV感染能够诱导Vero E6细胞产生完整的自噬应答。为了探究自噬对病毒复制的影响,本研究分别采用自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂Rapamycin处理Vero E6细胞后以SADS-CoV感染,于感染后不同时间收获细胞,通过western blot和病毒滴度(TCID_(50))测定检测SADS-CoV N蛋白表达水平的变化。结果显示,与仅感染病毒的对照组相比,采用3-MA处理Vero E6细胞后SADS-CoV N蛋白的表达水平及TCID_(50)均显著降低(P<0.05),而采用Rapamycin处理后SADS-CoV N蛋白的表达水平及TCID_(50)则均显著升高(P<0.05)。针对ATG5基因设计3条特异性的ATG5 si RNA(siATG5-1/2/3),将干扰效率较好的siATG5-1转染Vero E6细胞后再以SADS-CoV感染,24 h后检测病毒滴度并利用western blot检测SADS-CoV N蛋白表达水平的变化。结果显示,与未转染siATG5的3组阴性细胞相比,转染细胞中SADS-CoV N蛋白的表达水平及病毒滴度均显著降低(P<0.05)。本研究首次表明SADS-CoV感染可以诱导宿主细胞自噬并促进病毒的复制,该结果为深入研究SADS-CoV感染与其致病机理以及防控该病毒的感染奠定了基础。

猪圆环病毒2型ORF1部分位点突变对病毒复制能力的影响

猪圆环病毒2型(PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征,导致仔猪逐渐消瘦。PCV2 ORF1表达的Rep蛋白及其剪切体Rep′是PCV2复制所需的重要蛋白。为了研究PCV2 ORF1部分位点对PCV2复制能力的影响,本试验通过构建PCV2 ORF1区域点突变双拷贝感染性克隆质粒,在无PCV2污染的PK-15细胞中进行病毒拯救,使用荧光定量PCR检测不同位点突变病毒培养不同代次上清液的Ct值。结果:将PCV2 Rep的17 aa、19 aa、20 aa和21 aa突变为丙氨酸后病毒无法成功拯救,2 aa突变后严重影响病毒的复制能力,3 aa、5 aa和18 aa突变后病毒的复制能力增强且细胞病毒载量高于PCV2原毒株,推测17 aa、19 aa、20 aa和21 aa是影响PCV2复制的关键作用位点。本研究结果为未来PCV2复制相关研究提供了试验依据。

IRES核心区12-bp非连续插入突变对猪塞内卡病毒复制和细胞嗜性的影响

【背景】塞内卡病毒(senecavirus A,SVA)是新近暴发的一种引起猪特发性水疱病及仔猪死亡的小核糖核酸病毒。该病毒基因组5′非编码区(untranslated region,UTR)中的内部核糖体进入位点(IRES)元件在病毒复制过程中发挥重要作用。2017年我国出现IRES核心区Domain II 12个碱基非连续插入的自然突变SVA毒株,在病毒复制和致病性方面存在明显改变。【目的】探讨IRES Domain II区域发生的突变对SVA的复制及细胞嗜性的影响,为进一步了解SVA致病机制奠定基础。【方法】以实验室前期构建的含HeN-1/2018株全基因组感染性克隆pHeN-1/2018为基础,通过定点突变的方式,逐步将其IRES Domain II核心区域308—317 nt的9个碱基(ACTCAAGCG)替换为GD04/2017株基因组308—328 nt的21个碱基(CACGCCTGCCGATAGACGATT),构建重组载体pHeN-1/2018-i12并进行了病毒拯救。随后,利用病毒基因组克隆测序、间接免疫荧光试验和Western blot试验对所拯救病毒进行鉴定,同时验证了IRES核心区12个碱基插入突变对SVA病毒体外复制能力和细胞嗜性的影响。【结果】将构建完成的重组载体pHeN-1/2018-i12转染细胞,盲传至P2代,获得致使感染细胞病变明显、病变时间稳定的IRES突变病毒rHeN-1/2018-i12。病毒连续传代后测序结果表明rHeN-1/2018-i12遗传稳定,P5代病毒基因组序列未发生碱基突变,P10代病毒IRES区域没有出现突变现象。用低代次的突变病毒rHeN-1/2018-i12体外感染本体动物猪源细胞系PK-15和IBRS-2,及仓鼠源细胞系BHK-21,进行细胞感染试验,结果表明rHeN-1/2018-i12与亲本毒株rHeN-1/2018在PK-15、IBRS-2和BHK-21中均能导致明显的细胞病变,表现出相似的生长曲线趋势,表明IRES核心区Domain II 12个碱基突变不能够改变对上述细胞的嗜性;但SVA突变病毒和亲本株在不同细胞中的病变时间及病毒滴度上存在较大的差异,rHeN-1/2018-i12株在细胞中生长能力较其亲本株rHeN-1/2018差,诱使细胞病变的时间较晚,在感染24 hpi,两者病毒滴度相差可达10倍。【结论】本研究基于SVA反向遗传操作系统构建并拯救SVA IRES突变毒株,确定了IRES突变对SVA生物学特性的影响,有助于我们更好地了解SVA致病机制,拓宽我们对病毒IV型IRES功能的认识。

干扰素刺激基因ISG15对猪流行性腹泻病毒复制的作用及机制分析

【目的】探究干扰素刺激基因ISG15在猪流行性腹泻病毒(PEDV)复制中所发挥的作用及机制。【方法】利用实时荧光定量PCR检测ISG15基因组织表达谱及肠道组织差异表达情况,同时以猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)为研究模型,检测PEDV CV777毒株感染细胞不同时间点PEDV M基因mRNA和N蛋白表达量,并从RNA和蛋白水平检测ISG15表达变化;分别构建猪ISG15基因干扰和过表达细胞,通过实时荧光定量PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验检测ISG15基因表达对PEDV复制水平的影响;对ISG15基因过表达前后进行转录组测序分析,筛选其下游调控基因及信号通路。【结果】ISG15基因在仔猪肠道组织中特异性高表达,其中空肠和回肠中表达量极显著高于其他组织(P<0.01);PEDV感染组十二指肠、空肠及回肠中ISG15基因表达量显著或极显著高于健康组(P<0.05;P<0.01);M基因mRNA和N蛋白表达量出现上升趋势,与0 h相比,ISG15基因表达水平在24 h出现极显著上调(P<0.01);ISG15基因过表达后PEDV复制出现显著或极显著下降(P<0.05;P<0.01),而ISG15基因干扰后PEDV复制出现极显著上调(P<0.01);转录组测序发现,过表达ISG15基因前后存在1 532个差异表达基因,且其主要富集在自噬、MAPK、内吞等信号通路中。【结论】本研究揭示了PEDV感染过程中ISG15基因的调控功能及作用机制,发现ISG15基因上调可显著抑制PEDV复制,增进了对PEDV与宿主细胞互作分子机制的认识。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白纳米抗体的筛选及其对病毒复制的抑制效应

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白的特异性纳米抗体,并探究其对病毒复制的抑制效应。使用原核表达系统将PRRSV-GP5蛋白大量表达后经镍柱亲和层析法纯化,使用所获的重组GP5蛋白免疫羊驼,并于第0、14、28、42天时采血,检测羊驼体内抗体效价后分离全血淋巴细胞,提取细胞总RNA,反转录后使用巢式PCR扩增出重链抗体可变区(VHH)片段,并与pCANTAB-5E载体相连后转化入TG1感受态细胞,利用噬菌体展示技术构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库。经连续三轮特异性噬菌体的筛选与富集后,淘选出与PRRSV-GP5蛋白高结合力的纳米抗体,通过间接ELISA方法鉴定其反应原性,后将所获的纳米抗体基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,利用Lipofectamine3000转染至Marc^(-1)45细胞内,与PRRSV分别共孵育0、24、36、48、60、72 h,以探究所筛针对PRRSV-GP5蛋白的纳米抗体于胞内对病毒复制与转录产生的影响。结果表明,成功对PRRSV-GP5蛋白进行原核表达并纯化,得到浓度为2.16 mg·mL^(-1)的重组蛋白,对羊驼三次免疫14 d后,其体内抗体效价高达1∶819200,构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库,库容量达2.93×107 CFU·mL^(-1),插入率为98%。经对噬菌体抗体文库连续三轮淘选富集后,最终获得2株不同氨基酸序列的纳米抗体。间接ELISA结果显示,2株纳米抗体均与PRRSV-GP5蛋白具有良好的亲和力。将2株纳米抗体转染至Marc^(-1)45细胞内,它们分别于36与60 h时显著阻碍PRRSV的复制与转录,展现出了较好的阻碍病毒复制的能力。本研究首次筛选出针对PRRSV-GP5蛋白的特异性纳米抗体,且经验证所筛纳米抗体具备抑制PRRSV在细胞内复制的能力,研究结果为抗PRRSV新型药物的研发奠定了试验依据与物质基础。

E3泛素连接酶FBXL8对A亚群禽白血病病毒复制的影响

【目的】制备鸡E3泛素连接酶FBXL8多克隆抗体,探究鸡源FBXL8对A亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup A,ALV-A)在鸡胚成纤维细胞(DF-1)内复制的影响。【方法】以DF-1细胞cDNA为模板,通过PCR扩增FBXL 8基因,构建鸡源FBXL8原核表达重组质粒pET-28a-FBXL8,将其转化大肠杆菌表达菌株RIL进行诱导表达及纯化,将表达产物His-FBXL8免疫10月龄新西兰大白兔制备多克隆抗体,利用Western blotting和间接ELISA分别检测抗体特异性及效价;针对已公布的FBXL 8基因序列设计过表达引物及靶向FBXL 8基因的干扰序列,构建过表达质粒psi-flag-FBXL8及干扰质粒pLKO.1-FBXL8-shRNA,使用Western blotting检测其表达效果。将构建成功的过表达质粒和干扰质粒转染DF-1细胞,24 h后感染ALV-A,通过半定量PCR、Western blotting分别检测ALV-A的结构蛋白P27、GP85表达水平。【结果】PCR成功扩增出大小为1182 bp的FBXL 8基因片段,并成功构建FBXL8原核表达重组质粒pET-28a-FBXL8,诱导表达的融合蛋白His-FBXL8大小为43 ku。Western blotting和间接ELISA结果显示,制备的FBXL8兔多克隆抗体可特异性识别外源蛋白,且抗体效价为1∶64000。成功构建了FBXL8过表达质粒和干扰质粒,其在DF-1细胞中能够实现对FBXL8的过表达和敲低。半定量PCR和Western blotting检测结果显示,过表达FBXL8可抑制ALV-A复制,而敲低FBXL8则促进其复制。【结论】本研究制备的FBXL8多克隆抗体具有良好特异性及反应性;在DF-1细胞中,FBXL8负向调控ALV-A复制,研究结果为进一步深入探究FBXL8生物学特性提供了重要参考,并为揭示FBXL8抗ALV-A感染分子机制奠定了基础。

SYNPO2蛋白在狂犬病病毒复制过程中的功能初探

目的探明SYNPO2蛋白对狂犬病病毒复制的影响。方法通过免疫印迹分析病毒感染后SYNPO2蛋白的差异表达情况;构建SYNPO2基因真核表达载体和shRNA干扰载体,转染SK-N-SH细胞后进行病毒感染,免疫印迹分析过表达或干扰SYNPO2对病毒蛋白表达的影响,荧光定量PCR分析过表达或干扰SYNPO2对病毒基因组复制和转录水平的影响,病毒滴度测定分析过表达或干扰SYNPO2对感染性病毒粒子释放能力的影响;SYNPO2真核表达载体转染SK-N-SH细胞后进行病毒感染,或与构建成功的病毒M基因真核表达载体共转染SK-N-SH细胞,间接免疫荧光实验结合激光共聚焦拍照技术分析SYNPO2与M蛋白在病毒感染或真核表达细胞中的亚细胞定位情况。结果狂犬病病毒感染可诱导SYNPO2蛋白的下调表达;SYNPO2过表达可促进病毒M蛋白表达,但未影响病毒基因组的复制、转录及感染性病毒粒子释放的能力;干扰SYNPO2则在未影响病毒基因组复制和转录的情况下显著抑制了病毒M蛋白的表达和感染性病毒粒子的释放;进一步经共定位分析发现SYNPO2与病毒M蛋白存在明显共定位现象。结论确定了SYNPO2蛋白对狂犬病病毒复制起着正向调控作用,为挖掘狂犬病治疗潜在的药物靶标奠定基础数据。

黄曲霉毒素B1对仔猪体内流感病毒复制、器官损伤和肠道菌群的影响

【背景】黄曲霉毒素B1(AFB1)是由寄生曲霉菌产生的次级代谢产物,广泛存在于世界各地受污染的食品和饲料中,被认为是影响人类和动物健康的主要风险因素之一。猪流感病毒(SIV)是目前世界上传播最为广泛的病毒之一,其复制易受环境和营养等多种因素影响。然而,饲料中AFB1污染与SIV感染的关系尚不明确。【目的】探究AFB1暴露对SIV感染的仔猪体内SIV复制、器官损伤和肠道菌群的影响,为研究霉菌毒素中毒机制奠定基础,也为探讨其他感染性疾病易感性增加原因提供参考。【方法】选取保育期雄性仔猪32头,随机分为4组(每组8头),在试验开始第1和第4天分别滴鼻接种低致病性SIV病毒稀释液,建立SIV感染仔猪(本体动物)模型。每天新鲜稀释AFB1,按照0、10、20和40μg·kg^(-1)(饲料)浓度灌服给仔猪,持续21 d。分别在第7、14和21天饲喂前对仔猪进行称重,然后应用多种技术手段检测各组仔猪器官脏器指数、剖检变化和病理特征,并在此基础上,进一步使用免疫印迹分析肺部SIV的核衣壳蛋白(NP)的表达情况以及16S rRNA检测肠道菌群变化,阐明AFB1暴露对SIV感染、脏器损伤和肠道菌群的影响。【结果】暴露于40μg·kg^(-1)AFB1的仔猪较对照组仔猪(无AFB1)体增重显著降低(P<0.01),NP蛋白表达以及肺脏指数显著升高(P<0.01),而脾脏指数显著降低(P<0.01)。剖检结果显示,暴露于40μg·kg^(-1)AFB1仔猪的脾脏、肝脏和肺脏损伤严重。H.E染色也表现出相似的结果,与SIV对照组相比,40μg·kg^(-1)AFB1处理组仔猪脾脏出现淤血,红白髓界限不清;肝组织出血、炎症细胞浸润;肺脏小肺泡融合成形态不规则的大肺泡,肺泡间质增厚,炎性细胞浸润增多;此外,肠绒毛形状不规则,结缔组织松散,有淋巴细胞浸润。16S rRNA测序结果显示,暴露于40μg·kg^(-1)AFB1显著提高了仔猪肠道放线菌门和梭状芽孢杆菌的相对丰度,降低了乳酸菌属和拟杆菌属的丰度。【结论】AFB1暴露降低了SIV感染仔猪的体增重,促进SIV复制,加剧了肺组织等器官损伤,并引起肠道菌群紊乱,该发现为研究AFB1的毒性作用机制提供理论参考依据。

DEAD-box解旋酶21对猪传染性胃肠炎病毒复制的调控作用

旨在探究DEAD-box解旋酶21(DDX21)对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)复制的调控作用。首先通过蛋白免疫印迹(Western Blot)分析了TGEV感染对DDX21表达的影响;进一步构建了猪DDX21真核表达质粒以及建立稳定敲低DDX21的PK-15细胞系,运用荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹、间接免疫荧光(IFA)和半数细胞培养物感染量(TCID 50)探究外源过表达DDX21及敲低DDX21对TGEV体外复制的调控作用;构建一系列DDX21截短突变体真核表达质粒,鉴定了DDX21调控TGEV增殖的关键功能域。Western Blot分析显示,在TGEV WH-1株感染早期,PK-15细胞内源性DDX21蛋白的表达水平显著上调;RT-qPCR、Western Blot、IFA和TCID 50试验显示,超表达DDX21可以显著提高TGEV N基因的mRNA水平、N蛋白的表达及病毒滴度,且呈剂量依赖性,其601-784 aa区域是其影响TGEV复制的关键;与阴性对照相比,在相应DDX21敲低细胞系中TGEV的增殖显著被抑制,而回补试验逆转了DDX21敲低细胞系中TGEV的滴度。该研究首次揭示了猪DDX21对TGEV增殖的促进作用并鉴定了其调控TGEV复制的关键结构域,为今后研究DDX21蛋白的功能及TGEV的致病机理提供了理论依据。

eEF1A1调控水疱性口炎病毒和单纯疱疹病毒复制的初步研究

目的 探讨真核翻译延伸因子1A1(eEF1A1)对水疱性口炎病毒(VSV)和单纯疱疹病毒(HSV-1)复制的影响,以确定一个广谱抗病毒新靶点。方法 在人皮肤成纤维细胞(BJ-5ta)中转染小干扰RNA(sieEF1A1)抑制eEF1A1表达,同时设置阴性对照组,用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)与Western印迹法检测转染效率,制备eEF1A1基因沉默的细胞模型。用VSV感染细胞模型,检测细胞内VSV的基因拷贝数和蛋白水平;用HSV-1感染细胞模型,检测细胞内HSV-1的mRNA水平和蛋白水平。用聚胞苷酸[poly(I:C)]或脱氧核糖核酸钠盐(HT-DNA)分别转染细胞模型,RT-qPCR检测干扰素β(IFN-β)、趋化因子10(CXCL10)和干扰素刺激基因56(ISG56)的mRNA水平,Western印迹法检测干扰素调节因子3(IRF3)和TANK结合激酶1(TBK1)蛋白磷酸化水平。结果 与阴性对照组相比,eEF1A1基因沉默组eEF1A1的mRNA水平和蛋白水平显著降低(P<0.01),eEF1A1基因沉默的细胞模型构建成功。与阴性对照组相比,eEF1A1基因沉默组的VSV基因拷贝数下降70%~80%,VSV蛋白水平显著降低(P<0.01);HSV-1的mRNA水平下降50%~60%,HSV蛋白水平显著降低(P<0.01)。poly(I:C)或HT-DNA刺激后,与阴性对照组相比,eEF1A1基因沉默组的IFN-β、ISG56和CXCL10的mRNA水平以及IRF3与TBK1的蛋白磷酸化水平无显著差异。结论 eEF1A1调控VSV和HSV-1病毒复制,提示eEF1A1对RNA病毒和DNA病毒具有潜在的广谱调控作用,且可能不通过胞内核酸识别激活的免疫通路。

人β防御素3对绿色荧光蛋白标记水疱性口炎病毒复制的作用

目的探讨人β防御素-3(HBD3)对绿色荧光蛋白(GFP)-水疱性口炎病毒(VSV)病毒株复制的作用。方法取对数生长期非洲绿猴肾细胞(Vero)分为Control组、1.00感染复数(MOI)组、0.10 MOI及0.01MOI组,Control组为无病毒对照组,后3组Vero细胞用1.00 MOI、0.10 MOI、0.01MOI VSV-GFP感染,采用噬斑形成实验观察感染第3天时各组Vero细胞存活情况,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测感染24 h时1.00、0.10及0.01 MOI组Vero细胞内病毒基质蛋白(M)和GFP信使RNA(mRNA)表达;取对数生长期人非小细胞肺癌细胞(A549)分为未处理组、VSV-GFP组及VSV-GFP+HBD3组,采用Imag J软件对各组镜下A549荧光进行相对定量分析,使用RT-PCR检测各组A549细胞内M和GFP mRNA表达。结果随着病毒滴度的增加,Vero细胞内空斑形成数目增多;Vero细胞内M和GFP mRNA表达表现为0.01 MOI组<0.10 MOI组<1.00 MOI组(P<0.05);VSV-GFP+HBD3组A549细胞单位面积内的荧光强度较VSV-GFP组减弱(P<0.05),M和GFP mRNA表达较VSV-GFP组降低(P<0.05)。结论HBD3可抑制VSV-GFP进入细胞后的病毒复制。

口蹄疫等病毒可操纵细胞加速病毒复制

小RNA病毒能够在人类和动物中引起不同传染性疾病,其进化出多种策略来操纵细胞自噬和凋亡以促进病毒复制和致病,但宿主细胞凋亡和自噬影响病毒复制和致病的机制尚不清楚。近日,中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队解析了一种小RNA病毒的结构蛋白诱导自噬促进病毒复制增强致病性的作用机制。相关研究成果发表在《自噬(Autophagy)》上。

乙肝辨证分型与病毒复制关系的初步研究

通过大样本的临床调查研究 ,初步探讨乙型慢性病毒性肝炎患者辨证分型与病毒复制程度之间的关系。采用临床流行病学———回顾性研究的方法。结果 ,本次调查资料经数据完整性、诊断规范化、辨证标准化初步筛选。 2 82例乙型慢肝患者 ,各证型的分布为肝郁脾虚 >肝胆湿热 >瘀血阻络 >肝肾阴虚 >脾肾阳虚 ,其中以肝郁脾虚证和肝胆湿热证为其常见证型 ,占所调查对象的 84 75 % ;肝郁脾虚证患者以HBsAg(+)、HBeAb(+)为主 ,病毒处于低复制阶段 (R1=0 938,P <0 0 1) ;而肝胆湿热证多见两种表型(R2 =0 799,P <0 0 1) ,即HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)、HBV DNA(+)或HBsAg(+)、HBcAb(+)、HBV DNA(+) ,提示病毒复制高度活跃。肝胆湿热证与病毒高复制状态具有显著相关性。

HBV病毒复制机制及慢性乙型肝炎药物靶点

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一种严重影响公共卫生与人体健康的全球性流行性疾病,尽管乙肝防治已有很大提高,但仍缺乏高效的药物与手段。研究表明,肝损伤、肝衰竭程度与HBV及宿主免疫系统相互作用存在复杂关系。因而详细地探明HBV生命周期和感染过程,为研究HBV药物靶点和制定新的抗病毒策略提供前期坚实的基础,意义重大。该文详细介绍HBV病毒复制机制,并系统地阐述近年来新发现的和潜在的药物靶点,为制备新型的抗HBV药物提供参考。

细胞免疫功能对乙型肝炎病毒复制及抗病毒治疗的意义

目的分析乙型肝炎病毒(HBV)复制、转归及变异与细胞免疫功能的关系。方法检测37例慢性乙型肝炎(乙肝)患者(慢性乙肝组)、20例HBV携带者(无症状携带组)、36例乙肝肝硬化患者(乙肝肝硬化组)及24例健康体检者(正常对照组)的外周血T细胞亚群,分析HBV不同感染状况者T细胞亚群的差异;用实时荧光定量PCR法检测HBV感染者HBV-DNA水平和拉米夫定相关变异(YMDD)。结果 (1)与正常对照组比较,无症状携带组和慢性乙肝组的CD3+、CD4+T细胞的百分比和计数均显著降低(P<0.05),无症状携带者的CD8+T细胞计数亦显著低于正常对照组(P<0.05),而两组的CD8+T细胞百分比及CD4+/CD8+比值与正常对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);乙肝肝硬化组CD4+T细胞百分比与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),但CD4+/CD8+比值显著高于正常对照组,CD3+、CD4+、CD8+T细胞计数均显著低于其他各组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)HVB感染者HBV-DNA水平与外周血CD3+、CD4+、CD8+T细胞及CD4+/CD8+比值无相关性(P>0.05)。(3)抗病毒治疗6个月后HBV-DNA水平小于检测低限组的外周血CD3+、CD4+、CD8+T细胞计数显著高于治疗12个月后转归及无转归组,而CD4+/CD8+比值显著低于治疗12个月后无转归组,差异均有统计学意义(P<0.05)。(4)拉米夫定相关变异型和野生型HBV感染者外周血CD3+、CD4+、CD8+T细胞及CD4+/CD8+比值间差异无统计学意义(P>0.05)。结论慢性HBV感染者体内存在T细胞亚群失衡和细胞免疫功能紊乱,可能是HBV感染后慢性化的重要原因;T细胞亚群检测可作为抗病毒治疗效果和疾病转归的预测指标;T细胞亚群计数较百分比更能反映患者的细胞免疫状况。

聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒-DNA对判别病毒复制临床价值的探讨

目的 了解不同方法对乙型肝炎病毒 (HBV)传染性判定的价值。方法 应用聚合酶链反应 (PCR)法和EL ISA法分别对 375例门诊、住院患者血清进行检测 ,将两者结果进行比较。结果 抗 - HBc阳性组 HBV- DNA检出率明显高于阴性组 ,χ2 =18.9,P<0 .0 0 5。结论 PCR法明显优于 EL

慢性乙型肝炎虚实病机与病毒复制及T细胞关系的研究

目的 :通过对虚实分类的慢性乙型肝炎 (乙肝 )患者进行乙肝病毒 DNA(HBV DNA)定量、T淋巴细胞亚群检测分析 ,探讨中医虚实病机与现代医学免疫发病机制之间的关系。方法 :将 HBe Ag阳性的慢性乙肝轻、中度的患者分为虚证组、实证组、虚实夹杂组 ,检测上述指标并对各组进行比较分析。结果 :与正常对照组比较 ,各组慢性乙肝患者 CD+ 4水平明显下降 ,CD+ 4/ CD+ 8存在明显差异。HBV DNA定量实证组 >虚实兼夹组 >虚证组 (P<0 .0 5 )。 CD+ 4/ CD+ 8比值虚证组 >虚实兼夹组 >实证组 (P<0 .0 5 )。结论 :慢性乙肝患者存在着免疫调节紊乱 ;HBV DNA定量水平可作为实证的参考指标 ,CD+ 4/ CD+ 8值可作为虚实变化的参考指标 ,CD+

猪传染性胃肠炎病毒ORF7蛋白在ST细胞中定位及其对病毒复制影响的研究

为研究猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)ORF7蛋白的亚细胞定位及其在TGEV复制中的作用。本研究通过RT-PCR扩增TGEV ORF7基因,将其与真核表达载体pEGFP-C1和pEGFP-N1相连接,构建表达载体pGFP-ORF7(GFP融合在TGEV ORF7的-NH2端)和pORF7-GFP(GFP融合在ORF7的-COOH端)。分别将这两个质粒转染至ST细胞,western blot检测融合蛋白GFP-ORF7和ORF7-GFP的表达。通过生物信息学分析和激光共聚焦确定TGEV ORF7蛋白的亚细胞定位。在此基础上,通过细胞病变观察和荧光定量PCR检测TGEV ORF7蛋白对TGEV复制的影响。结果显示,本研究正确构建了真核表达载体pGFP-ORF7和pORF7-GFP,western blot检测结果表明融合蛋白GFP-ORF7和ORF7-GFP均正确表达,TGEV ORF7蛋白大小约为9 ku;结合生物信息学分析和激光共聚焦共定位结果显示TGEV ORF7特异性的定位于ST细胞的内质网中,其定位和其N端的信号肽序列有关;荧光定量PCR检测结果显示,过表达ORF7蛋白后TGEV mRNA转录水平降低99%,表明ORF7蛋白参与调控TGEV的复制。本研究为TGEV ORF7蛋白功能的研究提供了参考依据。

孕妇血清中乙型肝炎病毒复制水平与胎儿宫内感染的关系

目的探讨孕妇血清中乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBeAg)、前S1抗原(Pre-S1Ag)和病毒DNA(HBV-DNA)与胎儿宫内乙型肝炎病毒感染的关系。方法应用酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)对165例乙肝表面抗原(HBsAg)阳性孕妇的母血及产后婴儿外周血的乙型肝炎血清学标志物(HBV-M)和HBV-DNA进行检测。结果165例HBsAg阳性孕妇血清中HBeAg、Pre-S1Ag和HBV-DNA的检出率分别为29.1%、31.5%和38.2%,所生婴儿外周血中HBsAg和HBV-DNA的检出率分别为7.3%(12/165)和23.6%。HBeAg、HBVPre-S1Ag和HBV-DNA阳性孕妇所生婴儿外周血HBV-DNA的检出率分别为79.2%、75.0%和66.7%,显著高于HBeAg、Pre-S1Ag和HBV-DNA阴性者的5.1%、6.2%和0.0%,(P<0.01)。孕妇血清中平均HBVDNA的含量为(7.32±1.79)(拷贝数/mL的对数),显著高于婴儿外周血HBVDNA的(5.86±1.33),(P<0.01),婴儿外周血中HBVDNA阳性率随孕妇HBVDNA含量增加而显著增加,且呈正相关(r=0.43,P<0.01)。结论孕妇血清中HBeAg、Pre-S1Ag和HBV-DNA阳性是胎儿宫内感染HBV的高危因素,胎儿宫内感染率随母血中HBV-DNA含量增加而增加。