我国12省市玉米矮花叶病病原鉴定及病毒致病性测定

利用甘蔗花叶病毒 (Sugarcanemosaicvirus,SCMV)单克隆抗体细胞株 2B5腹水和SCMV、玉米矮花叶病毒 (Maizedwarfmosaicvirus,MDMV)、高粱花叶病毒 (Sorghummosaicvirus,SrMV)和约翰逊草花叶病毒 (Johnsongrassmosaicvirus,JGMV)的特异性引物对我国浙江、江苏、上海、山东、河南、河北、北京、山西、陕西、甘肃、四川、云南 12省市 15个地点的 176株玉米矮花叶病病样分别进行了间接ELISA和免疫捕获反转录PCR(IC RT PCR)检测 ,结果表明这些病样均含有SCMV ,而无MDMV、SrMV或JGMV存在 ,表明上述 12省市的玉米矮花叶病病原为SCMV。进一步对甘肃 (GS)、四川 (SC)、云南 (YN) 3个SCMV分离物的近全长CP基因进行了序列测定 ,并测定了浙江分离物 (ZJ)和甘肃分离物 (GS)在 13个玉米品种上的致病性。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4传代致弱株HuN4-F30感染性克隆的构建及拯救病毒致病性分析

为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)Hu N4株传代致弱株Hu N4-F30感染性克隆,本研究利用高保真DNA聚合酶,分6个片段进行病毒全基因组序列扩增,并通过点突变在其基因组10 808位引入Mlu I作为分子标记。通过重叠延伸PCR在5'端上游引入CMV启动子,3'端引入丁型肝炎病毒(HDV)核酶基因和牛生长素多聚腺苷酸化信号(BGH)。将各片段依次连接克隆于改造的p Belo BAC11载体中,构建含有全长HP-PRRSV致弱株c DNA感染性克隆p Belo BAC11-Hu N4-F30,并将全长质粒直接转染Marc-145细胞拯救出病毒。通过核酸鉴定与测序、分子标记鉴定、间接免疫荧光试验和动物致病性试验等进行鉴定。结果表明,拯救的病毒能够通过Mlu I酶切与亲本鉴别,拯救病毒的间接免疫荧光与亲本病毒一致,拯救病毒表现出低致病性。HP-PRRSV Hu N4-F30感染性克隆的构建与病毒的拯救,为进一步研究HP-PRRSV传代致弱机制奠定了基础。

非洲猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应程序等反应条件,建立一种基于探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和重复性,对130份临床样品进行检测,并与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)进行比较分析。本研究成功建立的ASFV和HP-PRRSV二重FQ-PCR检测方法在10^(-1)~10^(5) copies/μL模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和HP-PRRSV基因出现阳性扩增,但对猪日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲经典株(VR2332株)、健康猪脾脏等7种病原核酸样品对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在0.53%~3.14%,重复性良好;对ASFV和HP-PRRSV的最低检测模板浓度均为10 copies/μL;利用建立的二重FQ-PCR方法对130份临床样品进行检测,检测结果与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和HPPRRSV二重FQ-PCR检测方法,为ASFV和HP-PRRSV的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。

美洲型猪蓝耳病病毒高致病性变异株RT-LAMP检测方法的建立

设计两套反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)引物,建立了检测美洲型猪蓝耳病病毒及其高致病性变异株的RT-LAMP方法。采用RT-LAMP方法与实时荧光RT-PCR方法检测58份病料,结果一致,但RT-LAMP方法的灵敏度大约高出10倍。RT-LAMP方法特异性良好,检测猪瘟、伪狂犬病和细小病毒等均未出现交叉反应。结果表明,建立的美洲型猪蓝耳病病毒及其高致病性变异株RT-LAMP检测方法具有特异、灵敏、高效和简便的特点,在我国猪蓝耳病快速检测领域将有广阔的应用前景。

PCR-ELISA快速检测高致病性禽流感病毒方法的建立

作者针对H5亚型禽流感病毒的包含多碱性氨基酸裂解点特异性片段,设计特异性引物并从病料中扩增出RT-PCR产物,再以ELISA方法判断PCR扩增的有无。结果表明,本方法具有较高的特异性和敏感性。

低致病性禽流感病毒与禽病原性大肠杆菌的联合感染试验

以10^(5.17)ELD_（50）的低致病性禽流感病毒(mildlypathogenic avian influenza virus,MPAIV)气管内注射10日龄SPF鸡,24h后,重复感染一次;48h后,气管内注射禽病原性大肠杆菌353(018)、120(018)、037(078)、166(078)、058(02)、536(088)、132(011)和173(026)株,3×10~7CFU/羽,连续观察5d.结果:MPAIV单独感染组死亡率为13.33%;各大肠杆菌单独感染组的死亡率分别为353:100.00%、120:60.00%、037:80.00%、166:86.67%、058:100.00%、536:93.33%、132:86.67%和173:20.O0%;MPAIV与上述各分离株的联合感染组的死亡率分别为100.00%、93.33%、86.67%、93.33%、100.00%、100.00%和100.00%.

肉鸡呼肠孤病毒的分离鉴定及致病性研究

【目的】从临床发病的疑似感染鸡呼肠孤病毒的白羽肉鸡病料中分离鉴定获得1株鸡源呼肠孤病毒SD18,对SD18株进行致病性及传播特性研究,为该病毒的深入研究和综合防治奠定基础。【方法】无菌采集疑似感染鸡呼肠孤病毒发病鸡跗关节处的肌腱和渗出物,分离病原物,在LMH细胞上培养,并连续盲传3代,经无菌生理盐水倍比稀释,采用Reed-Muench法测定病毒鸡胚半数致死量(ELD 50)和组织细胞半数感染量(TCID 50);对分离毒株进行理化特性和血凝特性测定;利用设计的鸡呼肠孤病毒L1和S1基因特异性引物,对提取的病毒总RNA进行RT-PCR扩增,经PCR鉴定为阳性的菌落进行基因测序以及核苷酸同源性比对和系统遗传进化分析;用该分离株病毒对SPF鸡和白羽肉鸡进行动物回归试验,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定攻毒后的SPF鸡血清中呼肠孤病毒抗体滴度。【结果】从疑似感染鸡呼肠孤病毒发病鸡跗关节处的肌腱和渗出物中分离获得1株鸡源呼肠孤病毒SD18,其ELD 50为10-6.5/0.1 mL,TCID 50为10-7.36/0.1 mL。RT-PCR结果显示,目的基因片段长度分别为1100,750,265 bp,依次为鸡呼肠孤病毒的S1、σC和L1基因片段。核苷酸同源性比对结果显示,该分离株SD18与Ⅴ群鸡源呼肠孤病毒TW-918(台湾株)的S1基因序列同源性达92.7%,与Ⅰ群鸡病毒性关节炎疫苗S1133株的同源性仅为59.0%。核酸序列遗传进化分析表明,该分离株SD18与Ⅴ群鸡源呼肠孤病毒TW-918(台湾株)处于同一进化分支上,与Ⅰ群鸡源呼肠孤病毒S1133株处于不同的进化分支上,说明新分离的肉鸡呼肠孤病毒SD18株属于基因Ⅴ群,可能是Ⅰ群经典鸡源呼肠孤病毒S1133株的变异毒株。SPF鸡和白羽肉鸡回归试验表明,SD18株病毒能够引起鸡病毒性关节炎,与临床发病一致,并能水平传播。接种试验表明,病毒SD18能致死鸡胚,打开死亡鸡胚可见其绒毛尿囊膜增厚、尿酸盐沉积、胚体出血等症状,符合呼肠孤病毒的致病特点。【结论】该分离株SD18为新型肉鸡呼肠孤病毒,能够引起鸡发生病毒性关节炎。

H5亚型高致病性禽流感病毒流行特点及其防控

H5亚型高致病性禽流感的发生给养禽业造成了严重损失,目前H5N6、H5N1成为主要的流行亚型,优势流行的HA分支在一定时期内呈现动态变化,且一直处于不断变异和进化之中,给我国防控工作带来了很大的挑战。本文通过分析近年H5亚型高致病性禽流感发生情况,以及H5亚型病毒的流行特点、进化过程,进而提出加强风险环节监测、开展病原特性研究、持续做好免疫工作和落实生物安全控制措施等防控建议。

表达高致病性猪蓝耳病病毒GP5重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

将PCR扩增的高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)HuN4株GP5基因与含绿色荧光蛋白(EGFP)基因的表达盒插入到伪狂犬病毒通用转移载体pgG-uni中,构建了转移载体pgG-HPGP5-EGFP。通过磷酸钙法将转移载体pgG-HPGP5-EGFP和PRV Bartha-K61株的基因组共转染Vero细胞,经过8轮荧光蚀斑筛选和PCR鉴定获得了稳定表达EGFP的重组病毒,命名为rPRV-HPGP5。IFA和western blot结果证实HP-PRRSV HuN4株GP5在重组病毒中得到了有效表达。该重组病毒的获得为高致病性猪蓝耳病基因工程疫苗的研究奠定了基础。

H5N1亚型高致病性禽流感病毒在鸽子体内分布的研究

应用实验室分离的鸭源高致病性禽流感病毒(AIV)A/Duck/Harbin/01/2004(H5N1)毒株,经SPF鸡胚增殖病毒,通过滴鼻途径人工感染鸽子,通过临床观察、剖检、HA、HI、PCR等方法进行体内分布和毒性研究。结果病死鸽子的肺脏损害最为严重,其次为脑、法氏囊;在病死鸽子的肺、肝、肾、脑中检测到病毒,其中肺中的病毒含量最高,脑、肝、肾中的病毒含量次之,再次为心和脾;各组织HA和HI检测阳性;各组织PCR检测到目的基因;对照组所有检测均为阴性。结果表明AIV在鸽子体内可以复制,并在肺、脑内病毒含量较高,为预防AIV奠定了基础。

山西省低致病性禽流感病毒检测及基因分析

在山西主要养鸡区规模化养鸡场采集病死或扑杀鸡的喉气管、脑、胸肌、心肌和肺组织等;活禽静脉采集血液、气管拭子或泄殖腔拭子,雏禽采集新鲜的粪便等,共采集疑似低致病性禽流感样品608份。经血凝试验、血凝抑制试验及RT-PCR鉴定,并进行HA基因测序和核苷酸序列同源性分析。结果显示,疑似样品中有68份含有禽流感病毒,其中65份属于H9亚型,各样品毒株间HA基因核苷酸序列同源性为96.5%~98.1%,与我国现有疫苗的HA基因核苷酸及部分现有毒株序列同源性为88.9%~93.8%,说明HA基因已发生较大的遗传漂变。

高致病性猪蓝耳病病毒GS/LZh/07株的分离、鉴定及其非结构蛋白Nsp2基因特性分析

将高致病性猪蓝耳病疑似病料接种Marc145细胞,发现该病料可使Marc145细胞产生CPE,应用猪蓝耳病病原检测试剂盒从细胞培养物中检测到PRRSV,命名为Gs/Lzh/07株。同时应用RT-PCR方法扩增该分离毒株的非结构蛋白Nsp2基因,并进行了序列测定,发现所扩增到的Nsp2基因有90个核苷酸的缺失。序列比对结果表明:该分离病毒Nsp2基因与经典毒株PRRSV-ch-1a核苷酸同源性为83.0%,氨基酸同源性为72.7%;与高致病性变异毒株NX和SD核苷酸同源性为95.5%,氨基酸同源性为90.9%,可见该毒来源于2006-2007年流行毒株,说明高致病性猪蓝耳病变异病毒已经在甘肃省存在。该毒株的成功分离为高致病性猪蓝耳病流行病学调查分析提供数据,也为预防控制该病积累了资料。Nsp2的特性分析为揭示高致病性猪蓝耳病PRRSV在甘肃省的流行特点提供参考。

2016～2017年防城港市活禽市场低致病性禽流感病毒监测分析

为了解中越边境地区活禽市场低致病性禽流感病毒(Low pathogenic avian influ-enza virus,LPAIV)的分布情况,从2016年10月至2017年9月在防城港市不同活禽市场共采集家禽口腔/泄殖腔棉拭子876份,采用鸡胚接种进行病毒分离,然后通过HA和HI试验对分离结果进行鉴定。结果显示LPAIV样品阳性数为41份,阳性率为4.68%。同时发现LPAIV季节分布较为明显,冬春季分离率较高。分离的LPAIV中以H6、H9、H3、H1、H4亚型为主。鸡、鸭、鹅样品中LPAIV的分离率分别为3.91%、8.82%和16.67%。不同种属家禽LPAIVs的分离率存在差异,水禽LPAIV分离率明显较高。研究结果显示活禽市场是LPAIV的一个重要存储库,加强活禽市场禽流感病毒监测对禽流感的防控及公共卫生安全具有重要意义。

1株野鸟源H5N2亚型禽流感病毒对SPF鸭的致病性分析

旨在初步评估野鸟源H5N2亚型禽流感病毒（AIV）对幼龄鸭的致病力，为研究AIV的致病机制和禽流感发生机制提供理论依据。本研究以2周龄SPF鸭（绍兴麻鸭）为模型，模仿自然感染1株H5N2亚型LPAIV，对其致病性进行了初步研究。结果表明，试验鸭临床症状不明显，病毒在鸭消化道更能进行有效复制，排毒时间较长，具有直接接触感染的能力。病毒感染鸭7～14d可产生HI抗体，在第3周达最高值。病毒仅能在盲肠扁桃体和法氏囊2个器官组织中较高水平复制，却对法氏囊、肺、胸腺和胰腺造成不同程度的损伤。结果提示，幼龄鸭在AIV传播中起到一定作用，至于是否与真正自然状态下的感染有差异，还需进一步试验证实。

虎源高致病性禽流感病毒H5N1在实验小鼠体内分布与含量测定

将本实验室分离、鉴定的虎源高致病性禽流感病毒A/Tiger/Harbin/01/2003(H5N1)株第3代鸡胚尿囊液进行10-3倍稀释,接种小鼠,待小鼠死亡后无菌采取心、肝、脾、肺、肾、脑六种脏器分别研磨制成乳剂,接种MDCK细胞,以细胞病变为判定指标,计算病死小鼠不同脏器内病毒含量。同时用RT-PCR、血凝-血凝抑制试验以及电镜负染的方法进行鉴定和观察。结果显示,可在小鼠的肺脏、肝脏、肾脏、脑组织中检出所接种的病毒,肺脏中的病毒含量最高,脑中的病毒含量次之,肝脏和肾脏中的病毒含量最少。可在肺、肝、肾、脑组织与感染细胞培养物中扩增出与理论值一致的核酸条带,肺乳剂上清液感染细胞培养物中可检出1∶23的血凝效价,电镜观察在肺乳剂上清液及其感染细胞培养物中可见到典型的流感病毒颗粒。

低致病性禽流感病毒对养禽业的危害

文章对致病性禽流感病毒的特性、对养禽业的危害以及致病性禽流感的预防作了综合性叙述,重点对低致病性禽流感病毒的危害、免疫抑制性、毒性的变异性作了叙述,对生产、科研具有一定的参考意义。

高致病性禽流感病毒性肺炎小鼠模型血清细胞因子的水平

目的探讨细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在高致病性禽流感病毒性肺炎(HPAIVP)中的作用。方法昆明小鼠60只随机分为实验组和对照组,每组30只。高致病性禽流感病毒滴鼻制备HPAIVP小鼠模型,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA),对攻毒后不同时间点实验和对照组小鼠血清IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平进行检测。结果实验组血清IL-1β、IL-6、和TNF-α水平明显高于对照组,差异均有显著性(Pa<0.05)。结论细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α参与高致病性禽流感病毒肺炎的发病过程。

我国五省区部分猪场高致病性猪蓝耳病毒感染情况检测与分析

对2008年-2009年我国五省区发病猪场235份、屠宰场的218份样品进行了高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)RT-PCR检测,挑选具有代表性的HP-PRRSV阳性样品进行HP-PRRSV ORF5基因扩增、测序及分析。结果表明,这五个省区发病场蓝耳病的检出率平均74.6%。屠宰场的检出率平均44%,混合感染主要以二重感染为主,且发病场较屠宰场严重。对获得的13株HP-PRRSV ORF5进行测序分析,发现序列长度均为603 bp,未见缺失或插入,仅在9 aa^29 aa存在点突变;序列比较发现,与普通株标准序列VR-2332株核苷酸同源性达85.9%~87.2%;与高致病性毒株的同源性JXA1-06核苷酸同源性达96.0%~99.0%。而其推导氨基酸序列与普通型、高致病性毒株的同源性分别为87.1%~88.1%和97.5%~98.0%。从遗传进化以及变异情况看,获得的PRRSV ORF5序列均为与JXA1类似的高致病性PRRSV序列,与JXA1和HB-1同属美洲型中的一个亚群。

我国高致病性猪蓝耳病病毒的演化分析

自2006年以来,我国大面积暴发高致病性猪蓝耳病,但目前对其病原HP-PRRSV的起源还不得而知。本试验通过对多株HP-PRRSV进行全长基因组分析,发现HP-PRRSV中存在4处缺失,而且这4处缺失是逐步形成的,在中间过渡类型的毒株中存在着缺失1处、2处、3处的毒株。此外,中间过渡类型毒株中的一些氨基酸基序也是逐步变化的。本试验初步阐明了我国HP-PRRSV的起源是CH-1a-like PRRSV,在中间过渡的毒株中能够发现逐步演变的轨迹。

2013-2019年广西边境地区低致病性禽流感病毒监测分析

为了解广西边境地区低致病性禽流感病毒(low pathogenic Avian influenza virus,LPAIV)的流行情况,本研究对2013-2019年在广西边境地区的规模养殖场和活禽市场采集的33964份家禽棉拭子样品,采用鸡胚接种方法进行病毒分离,并结合血凝抑制试验和RT-PCR等方法鉴定禽流感病毒的亚型。结果显示,共有3892份样品分离到LPAIV,2013-2019年的样品病毒分离率分别为17.39%、11.23%、13.59%、9.31%、9.09%、9.12%和15.21%,总分离率为11.46%,其中2013年样品的病毒分离率最高。分离到的LPAIV包括H1、H3、H4、H6、H9、H10和H117种亚型,样品病毒分离率分别为0.14%、4.37%、0.19%、4.06%、2.69%、0.01%和0.003%。其中活禽市场分离到H1、H3、H4、H6、H9、H10和H117种亚型流感病毒,样品病毒分离率分别为0.19%、5.53%、0.21%、5.29%、3.41%、0.01%和0.004%,总分离率为14.64%;而养殖场分离到H3、H4、H6和H94种亚型流感病毒,样品病毒分离率分别为1.26%、0.12%、0.79%和0.78%,总分离率为2.95%,养殖场的分离率远低于活禽市场(14.64%)。鸡源样品的病毒分离率为5.77%,水禽样品的病毒分离率为15.10%,环境样品的病毒分离率为21.67%,水禽和环境样品的病毒分离率远高于鸡。结果表明,当前广西边境地区家禽携带多种亚型LPAIV,水禽是高风险禽群,应进一步加强监测和防控;活禽市场污染严重,应进一步加强对活禽市场的监管力度,建立和实施更加科学有效的活禽市场运营机制。