IL-10受体沉默的树突状细胞瘤苗对食管鳞癌细胞体内外免疫活性的影响

目的探讨IL-10受体(IL-10R)沉默的树突状细胞(DC)瘤苗对食管鳞癌细胞体内外免疫活性的影响。方法从食管鳞癌患者外周血中提取DC,使用倒置显微镜和扫描电镜对DC细胞形态进行鉴定,流式细胞仪上机检测DC细胞的表型。将TE11细胞分为空白对照组、DC-CTL组、NC-shRNA-DC-CTL组和IL-10R-shRNA-DC-CTL组。制作负载热休克凋亡的TE11细胞抗原的DC,然后使用Lipofectamine 3000分别进行IL-10R-shRNA慢病毒和NC-shRNA慢病毒转染,最后通过不同处理的DC诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。通过MTT法检测DC对TE11细胞的杀伤率,采用ELISA法检测TE11细胞培养上清液中IL-12和干扰素(IFN)-γ含量。将荷瘤小鼠随机分为对照组、未转染的DC组(DC组)、NC-shRNA-DC组和IL-10R-shRNA-DC组,每组6只。将DC悬液或生理盐水注射至小鼠淋巴结,每周注射1次,共注射4次。每隔7 d用游标卡尺测量肿瘤体积。采用免疫组织化学染色检测肿瘤组织中Ki67表达水平,TUNEL染色检测肿瘤组织TUNEL阳性率,流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞中CD8^(+)T细胞的比例,采用ELISA法检测肿瘤组织中IL-12和IFN-γ水平,采用RT-qPCR检测肿瘤组织中IL-10 mRNA和IL-10R mRNA水平。采用Western blot检测肿瘤组织中IL-10、IL-10R、信号转导子和转录激活子3(STAT3)、p-STAT3、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和程序性死亡配体1(PD-L1)的蛋白表达水平。结果倒置显微镜和扫描电镜证实分离的细胞符合DC形态学,DC的特异性标志物CD11c、MHC-Ⅱ、HLA-DR和CD83的阳性率分别为91.43%,89.53%,88.62%和90.74%。与空白对照组相比,DC-CTL组、NC-shRNA-DC-CTL组和IL-10R-shRNA-DC-CTL组TE11细胞杀伤率升高(P<0.05),TE11细胞培养上清液中IL-12和IFN-γ的水平升高(P<0.05);与DC-CTL组和NC-shRNA-DC-CTL组相比,IL-10R-shRNA-DC-CTL组TE11细胞杀伤率升高(P<0.05),TE11细胞培养上清液中IL-12和IFN-γ的水平升高(P<0.05)。与对照组相比,DC组、NC-shRNA-DC组和IL-10R-shRNA-DC组大鼠肿瘤体积和Ki67阳性率降低(P<0.05),TUNEL阳性率升高(P<0.05),肿瘤浸润淋巴细胞中CD8^(+)T细胞比例及肿瘤组织中IL-12和IFN-γ的水平升高(P<0.05),肿瘤组织中IL-10和IL-10R mRNA和蛋白水平、STAT3磷酸化水平以及PD-1和PD-L1蛋白水平降低(P<0.05);与DC组和NC-shRNA-DC组相比,IL-10R-shRNA-DC组肿瘤体积和Ki67阳性率降低(P<0.05),TUNEL阳性率升高(P<0.05),肿瘤浸润淋巴细胞中CD8^(+)T细胞比例及肿瘤组织中IL-12和IFN-γ的水平升高(P<0.05),肿瘤组织中IL-10和IL-10R mRNA和蛋白水平、STAT3磷酸化水平以及PD-1和PD-L1蛋白水平降低(P<0.05)。结论IL-10R沉默的DC瘤苗具有体内外抗食管鳞癌活性,可有效增强CD8^(+)T细胞免疫活性,抑制STAT3激活以及PD-1/PD-L1免疫检查点。

人B7-2瘤苗与DC瘤苗体外联合诱导抗食管癌的作用

目的:研究人B7-2瘤苗和负载了肿瘤细胞冻融抗原的DC瘤苗体外联合诱导抗食管癌的免疫作用.方法:应用脂质体转染技术,将融合基因表达载体pEGFP-N3-B7—2转染人食管癌细胞株EC9706.采用密度梯度离心法从脐血中分离单个核细胞(MNC)后,获得单核细胞(Mo).在细胞因子作用下诱导分化,第3d加入EC9706的冻融抗原,共培养4d后获得负载肿瘤抗原的成熟树突状细胞(MDC).将致敏DC与从脐血中分离的T淋巴细胞共培养3d,获得细胞毒T淋巴细胞(CTL);四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测CTL对转染和未转染的EC9706的细胞毒作用.结果:融合基因在食管癌细胞株EC9706的胞膜上定位表达.脐血来源的DC可负载并递呈肿瘤抗原,激活自体T淋巴细胞,诱导肿瘤特异性CTL产生,对转染pEGFP—N3-B7—2的EC9706细胞有显著杀伤作用(F=21.672,P=0.000).结论:人B7—2瘤苗和DC瘤苗体外联合应用,诱导出明显的杀伤食管癌细胞的免疫效应.

自体瘤苗与分枝杆菌多糖的临床联合应用研究

本文对45例胃肠癌术后患者应用自体瘤苗和分枝菌多糖（mycobsacterialPolysa-ccharides，MPS）联合皮下及肌肉注射治疗，并与相应对照比较，通过治疗前后外周T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+／CD8+及NK细胞活性的检测、研究组治疗后CD3+、CD4+、CD4+／CD8+比值和NK细胞活性都较前显著增加，而对照组无明显变化，以随访近期临床治愈率研究组也明显优于对照组，此疗法可以改善胃肠癌患者的细胞免疫功能，无毒副作用，可作为胃肠肿瘤的一种辅助治疗手段。

白细胞介素-18修饰的树突状细胞瘤苗的制备及其抗肿瘤免疫保护作用的研究

目的研究树突状细胞(DC)瘤苗的抗肿瘤免疫保护治疗作用,进一步探索DC为基础的肿瘤免疫治疗的新途径。方法以腺病毒为载体转染IL-18和/或gp100-DC,制备DC瘤苗,以ELISA、RT-PCR、FACS及混合淋巴细胞反应(MLR)检测所制备的DC瘤苗的效果,以黑色素肿瘤动物模型鉴定DC瘤苗的抗肿瘤免疫保护作用。结果本研究成功制备了DC瘤苗,IL-18/gp100-DC的抗肿瘤免疫保护作用明显强于IL-18-DC或gp100-DC瘤苗。结论Th1型细胞因子IL-18和gp100共转染能显著增强DC的抗肿瘤作用。

化疗药对病毒瘤苗免疫效果的影响

不同化疗药作用过的肿瘤细胞，经病毒感染后制成瘤苗的免疫效果明显不同。环磷酰胺和地塞米松能增强肿瘤细胞的抗原性，病毒感染后制备的瘤苗免疫力也随之增强，而阿糖胞苷对肿瘤细胞无影响，处理过的肿瘤细胞经病毒感染后制备的瘤苗抗原性反而降低。环磷酰胺预先处理荷瘤小鼠腹腔的肿瘤细胞，可去除Ｔｓ细胞的作用，保持新城疫病毒－瘤苗的免疫效果，提高受攻击小鼠的存活率。

瘤苗特异性主动免疫治疗及其机制的实验研究

围绕中药莪术及其有效成分β-榄香烯的抗癌作用与原理的研究,用多种小鼠可移植性瘤株,比较系统、深入地研究了中药(莪术油、β-揽香烯等)、化学药品(MMC、戊二醛等)、放射能(^(60)Co、X线等)及/或病毒(痘苗病毒、新城鸡瘟病毒)等处理的肿瘤细胞疫苗或其膜组分(Mfr)的主动免疫防治效应及其规律和机制,获得了明显的可重复的阳性结果,解决了有关瘤苗制备、保存和使用方法等一系列问题.

肝癌(H_(22))固化瘤苗的免疫实验研究

应用高温固化结合手术切除治疗肝癌曾作介绍，随访发现温免疫远位效应。为研究此种治疗方法与免疫的关系，应用小鼠移植性肝癌Ｈ２２在６５℃／６５ｍｉｎ射频条件下制备成固化瘤苗。用该瘤苗免疫小鼠（ＢＡＬＢ／Ｃ）发现能特异性主动免疫抗同源Ｈ２２３×１０＾８癌细胞的攻击，抗癌率为８６．６％，未出现瘤苗促癌生长现象。与对照组鼠比较，具有显著细胞免疫效应。认为固化瘤苗的实验有临床应用研究价值。

香菇多糖增强树突状细胞瘤苗的抗肿瘤作用及其机制研究

目的进一步提高树突状细胞(DC)瘤苗的抗肿瘤作用,探索有效的抗肿瘤生物疗法。方法以腺病毒为载体介导黑色素瘤抗原(gp100)转染至DC制备成DC瘤苗,研究不同剂量香菇多糖(lentinan, LNT)单独或联合gp100-DC瘤苗对荷瘤小鼠的免疫治疗作用及其相关机制。结果LNT联合gp100-DC瘤苗能有效抑制恶性黑色素瘤生长,无瘤生存率达到66．7％。LNT联合gp 100-DC瘤苗治疗后,能显著增强荷瘤小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤(NK)细胞活性,提高脾细胞的干扰素-γ(IFN-γ)和IL-2分泌水平,组织学检查发现瘤体及瘤周有大量炎性细胞浸润,肿瘤细胞发生明显坏死。结论LNT联合gp100-DC瘤苗能有效地增强DC瘤苗的抗肿瘤免疫反应。

榄香烯复合瘤苗主动免疫的抗肿瘤效应

为研究我们研制的榄香烯(elemene)复合瘤苗主动免疫抗瘤效应的分子机制及其与热休克蛋白(heat shock protein,HSP)的可能关系,本文首先观察、比较厂榄香烯或/和热休克复合瘤苗主动免疫的抗瘤效应.1 材料与方法1.1 主要药品和试剂1%榄香烯注射液(批号940823,大连金港制药).25%戊二醛(E Merk).RPMI 1640全培基(Gibco RPMI 1640含15 mmol/L Hepes,2 mmol/L谷氨酰胺、常规量抗菌素、20%小牛血清,杭州四季青公司).1.2 实验动物和瘤株BALB/c系小鼠(H-2~d)和异基因型小鼠腹水型肝癌H22(H-2^-)高淋巴转移亚系以及615系小鼠(H-2~k)和其同基因型L615 T淋巴细胞性白血病,均由本室常规传代、保种.实验动物体重20～26g,按体重分类后随机分组,每组20只,雌雄各半.1.3

莪术醇瘤苗治疗胃癌的实验研究

目的:研究中药单体莪术醇生物修饰构建的肿瘤细胞瘤苗对荷瘤小鼠(SGC-7901胃癌)的免疫功能影响及治疗效率。方法:观察莪术醇-SGC-7901细胞瘤苗体外激活脾淋巴细胞的能力,体内成瘤性变化及作为瘤苗对荷瘤胃癌的小鼠治疗作用。结果:莪术醇-SGC-7901细胞瘤苗在体外能有效诱导免疫细胞活化增殖和特异性CTL活性的产生,体内的成瘤能力明显下降,用各组免疫接种后长期存活的脾细胞制备的LAK细胞,较同龄未免疫小鼠的脾细胞制备的LAK细胞具有更强的抗瘤效应(P<0.05);经莪术醇修饰构建的SGC-7901瘤苗与对照组相比能明显阻止胃癌细胞的肺转移,显著抑制皮下肿瘤结节形成,明显延长荷瘤鼠的生存时间(P<0.05);接种瘤苗后对荷瘤胃癌小鼠有较好的治疗效果。结论:莪术醇修饰构建的SGC-7901新型疫苗可以增强胃肿瘤细胞的免疫原性,对荷瘤胃癌小鼠(SGC-7901)有较好的治疗效果。

异体树突状细胞融合瘤苗抗骨肉瘤的免疫效应实验

目的探讨大鼠异体树突状细胞融合瘤苗诱导的抗骨肉瘤免疫学效应。方法采用Wistar大鼠骨髓来源的DCs与SD大鼠来源的骨肉瘤细胞UMR106通过电穿孔的方法进行融合。经分离纯化后,分别与SD、Wistar大鼠骨髓来源的T淋巴细胞作共同培养,刺激其增殖。采用流式细胞仪对其CD8+,CD4+细胞比例进行检测。MTT法测定细胞毒T淋巴杀瘤活性。结果T淋巴细胞和异体融合瘤苗经过共同培养,T细胞得以显著增殖。异体瘤苗诱导的UMR106特异性CTLs杀瘤效果显著,该效应是由MHC-Ⅰ限制的CD8+细胞发挥作用。结论异体树突状细胞与骨肉瘤细胞融合瘤苗具有显著的刺激T淋巴细胞增殖和诱导特异性CTLs的潜能,为以树突状细胞为基础的免疫治疗领域提供了新的策略,有望在临床骨肉瘤患者中获得广阔的应用前景。

榄香烯复合瘤苗HSP70与HSP70_(BCG)对巨噬细胞功能影响的比较

目的 :比较Hca F榄香烯复合瘤苗HSP70 (HSP70 HTCV)和卡介苗HSP70 (HSP70 BCG)对小鼠腹腔或脾脏巨噬细胞功能的影响 ,分析HSP70 HTCV诱导抗瘤免疫作用的机制。方法 :给正常BALB C小鼠腹腔注射HSP70 HTCV 或HSP70 BCG ,共 3次 ,并用多聚甲醛固定的Hca F细胞体内冲击。收集腹腔和脾脏的巨噬细胞 ,并用HSP70 HTCV或HSP70 BCG 体外再致敏 ,用MTT法测细胞毒活性、细胞的增殖和分泌TNF的能力 ,用中性红吞噬试验测巨噬细胞的吞噬能力。结果 :用HSP70 HTCV 免疫小鼠的腹腔巨噬细胞对Hca F的细胞毒活性强于用HSP70 BCG 免疫小鼠的腹腔巨噬细胞 (4 2 7%VS 31 0 % ,P <0 0 5 ) ;用HPS70 HTCV 免疫小鼠的脾脏巨噬细胞分泌TNF的能力高于用HSP70 BCG免疫小鼠的脾脏巨噬细胞 ,细胞培养上清对L92 9的细胞毒活性分别为 5 7 4 %和 35 9% (P <0 0 5 ) ,脾脏巨噬细胞吞噬中性红的能力的变化两组之间无明显差别 ;免疫巨噬细胞的上述功能均高于未经免疫的对照小鼠的巨噬细胞 (P <0 0 1) ,而三组巨噬细胞的增殖改变无明显差别 (P >0 0 5 )。结论 :HSP70 HTCV 或HSP70 BCG 免疫都能增强巨噬细胞功能 ,但HSP70

腺病毒介导IFN-γ基因转染的瘤苗体内抗肿瘤转移作用

通过缺陷型腺病毒载体的介导将小鼠ＩＦＮ－γ基因转染入肿瘤细胞，经５０００ｒａｄ６０Ｃｏ照射后制备成瘤苗，观察其对实验性肺转移荷瘤小鼠的治疗效果，并对其治疗作用的免疫机理进行了研究。结果显示：经ＩＦＮ－γ基因转移瘤苗治疗后荷瘤小鼠肺部转移结节明显减少，小鼠存活期明显延长。体内免疫功能检测表明；经ＩＦＮ－γ基因转染瘤苗治疗后小鼠脾淋巴细胞诱导的ＣＴＬ，ＬＡＫ及腹腔巨噬细胞杀伤活性均明显升高，但ＮＫ活性变化不明显。本实验表明：通过腺病毒载体的介导而制备的ＩＦＮ－γ基因转染瘤苗能有效地通过激活体内抗肿瘤免疫功能而对实验性黑色素瘤肺转移有显著的治疗效果。

GM-CSF基因修饰的不同肿瘤瘤苗体内诱导抗肿瘤免疫功能的比较

GM-CSF作为一种重要的造血生长因子，能刺激粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的增殖分化，此外它还具有重要的免疫调节作用，尤其是其增强机体抗肿瘤免疫功能的作用近年来倍受重视。曾有报道，GM-CSF基因修饰的肿瘤瘤苗能诱导机体产生有效的保护性抗肿瘤免疫应答，在同一肿瘤模型中其作用强于用IL-2、

IL-21 gpi和sGM-CSF共同修饰的瘤苗构建及其抗肿瘤效应

目的:构建膜锚定IL-21和分泌性GM-CSF(sGM-CSF)双表达瘤苗,并对其抗肿瘤效应及其机制作初步探讨。方法:用分子生物学方法构建双表达IL-21 gpi和sGM-CSF重组质粒,将鉴定过的重组质粒以脂质体转染B16F10细胞制成瘤苗,用流式细胞仪检测转染瘤苗IL-21 gpi和sGM-CSF的表达。以瘤苗治疗荷瘤鼠,经观察小鼠肿瘤体积、生存率来分析瘤苗的抗瘤性,并检测了瘤苗治疗鼠的细胞免疫活性。结果:正确构建了pRSC/IL-21 gpi-sGM-CSF重组质粒,转染细胞可很好地表达膜锚定IL-21和分泌性GM-CSF,制备的瘤苗能有效地发挥抗肿瘤效应,其机制与瘤苗治疗鼠的脾细胞增殖活性、NK细胞及CD8+细胞细胞毒活性增强有关。结论:成功构建了具有抗肿瘤活性的膜锚定IL-21和分泌性GM-CSF双表达瘤苗,为进一步抗肿瘤免疫治疗研究奠定了基础。

大鼠树突状细胞融合瘤苗的特异性抗骨肉瘤作用

背景与目的:树突状细胞(dendriticcells,DCs)是目前已知的功能最为强大的抗原呈递细胞,但以DC为基础的针对骨肉瘤的免疫治疗未见报道。本研究旨在探讨大鼠树突状细胞融合瘤苗诱导的特异性抗骨肉瘤作用。方法:应用重组大鼠rGM-CSF、rIL-4和rTNF-α培养大鼠骨髓前体细胞获得大量DCs,用标记抗大鼠OX62单抗免疫磁珠分离纯化DCs,经形态学观察、表型检测、功能学实验鉴定,然后通过电融合的方法将细胞系UMR-106与异基因或同基因大鼠DCs相融合制备肿瘤疫苗,观察其抗肿瘤的效果。结果:预防接种异基因肿瘤疫苗组和同基因肿瘤疫苗组大鼠的存活率分别为70%和50%,存活的大鼠经历了第2次大剂量骨肉瘤细胞的免疫攻击,7周之后继续得以存活。在针对骨肉瘤动物模型进行主动免疫治疗的研究中,60%的荷瘤大鼠瘤体萎缩、消失而得以长期存活。结论:大鼠骨肉瘤细胞系UMR-106与同种异基因树突状细胞的融合瘤苗有较强的特异性抗骨肉瘤作用。

高强度聚焦超声制备小鼠(H_(22))肝癌固化瘤苗免疫性的实验研究

目的 对比研究经高强度聚焦超声 (HIFU)及经 6 5℃高温水浴 1小时处理后制成的固化瘤苗的细胞免疫效应。方法 将小鼠H2 2 肝癌细胞分别用HIFU及 6 5℃高温水浴 1小时处理 ,制成固化瘤苗 ,并将两种方法制得的瘤苗同时接种于不同的小鼠 ,以抵抗同源H2 2 癌细胞 1.0× 10 7/ml攻击 ,比较其抑瘤率和 6周内生命延长率。结果 经HI FU处理制成的瘤苗其抑瘤率和 6周内生命延长率均显著高于经高温水浴法制得者 (P <0 .0 0 5 )。结论 HIFU瘤苗组具有明显优于高温瘤苗组的细胞免疫效应 。

荷瘤小鼠瘤苗治疗疗效与红细胞天然免疫活性相关性及其意义

新近利用抗原处理细胞(APC细胞)处理制备瘤疫效疗较为肯定,认为天然免疫细胞DC细胞瘤疫更有其应用价值.红细胞也是天然免疫细胞.能否用红细胞处理补体调理过的肿瘤细胞制备瘤苗是值得探讨的.有的学者认为红细胞是T细胞活性的调节器,我们的实验有可能为此提供的依据[Arosa FA, Currpharm Des, 2004, 10(27): 191].

自体树突状细胞瘤苗对Ⅲ期胃癌化疗后患者外周血淋巴细胞亚群的影响

目的探讨树突状细胞(DC)瘤苗对Ⅲ期胃癌化疗后患者外周血淋巴细胞亚群的影响。方法Ⅲ期胃癌化疗后患者83例,分为观察组40例和对照组43例。制备自体DC瘤苗,观察组化疗后采用自体DC瘤苗进行免疫治疗,对照组采用单纯化疗。对照组于化疗后第2、8周、观察组于相应时间采集外周血。流式细胞仪检测CD+3、CD+3CD+4、CD+3CD+8、CD+4/CD+8、CD+19、CD+16CD+56T细胞亚群。化疗后第8周按RECIST标准评定近期疗效,肿瘤患者生活质量QOL评分评估生活质量,NCI-CTC标准评价毒性反应。结果成功培养成熟的DC并制备DC瘤苗。观察组(75.0%)与对照组(69.8%)总有效率相比,P>0.05。观察组注射DC瘤苗的不良反应为寒战、发热、肌肉酸痛、皮肤瘙痒、胸闷及一过性全身无力,大部分为自限性。化疗后第8周,观察组淋巴细胞绝对数高于对照组,外周血CD+3、CD+3CD+4、CD+3CD+8T细胞比例高于对照组,QOL评分优于对照组(P均<0.05)。结论自体DC瘤苗可上调Ⅲ期胃癌化疗后患者外周血CD+3、CD+3CD+4、CD+3CD+8T淋巴细胞比例,可能产生非特异性抗肿瘤免疫效应。

新型全细胞瘤苗对荷肝癌小鼠的主动免疫治疗

目的 建立小鼠肝脏种植性肝癌模型，评价添加新型佐剂的全细胞肿瘤瘤苗的治疗效果，包括免疫学参数及小鼠存活期，探讨该肿瘤瘤苗的作用机制。方法Ｂａｌｂ／ｃ小鼠肝脏成功接种肿瘤后，分成４组，各组行不同的治疗。第１组单纯切除肿瘤，不做免疫治疗；第Ⅱ组切除肿瘤，用新型细胞瘤苗进行免疫治疗；第Ⅲ组不切除肿瘤，用新型瘤苗进行免疫治疗；第Ⅳ组为对照组，只进行开腹、关腹。第２８天处死各组半数小鼠，取血检测血清中ＩＬ－１０和ＩＦＮ－γ的水平；取脾用ＦＡＣＳ检测ＣＤ４／ＣＤ8 和 ＩＦＮ－γ／ＩＬ－１０双阳性细胞的比例。各组所余小鼠继续饲养，鹏存活期。结果第腴血清ＩＦＮ-γ的水平较其余组明显升高（ｐ＜０.０１）；血清 ＩＬ－１０的水平较其他组明显降低（ｐ＜０．０１）；ＣＤ８＋／ＩＦＮ－γ+细胞的比例明显高于其他各组（ｐ＜０.０１）； ＣＤ８+／ＩＬ－１０+细胞的比例明显低于其他各组（ｐ＜０.０１）；ＣＤ４＋／ＩＦＮ-γ+细胞的比例明显高于靴各组（ｐ＜０.０１）；ＣＤ４＋／ＩＬ－１０＋细胞的比例明显低于其他各组（ｐ＜０.０１）．同时，第Ⅱ组荷瘤小鼠的生存期亦有明显延长。各组肺或淋巴结转移无统计学意义。