昆明地区献血人群中寨卡病毒、登革病毒和基孔肯雅病毒感染情况调查

目的了解昆明地区献血人群中寨卡病毒(ZIKV)、登革病毒(DENV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)感染的流行情况。方法随机抽取2022年8月-2023年10月昆明地区献血者标本10662份,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应技术(RT-qPCR)检测ZIKV RNA、DENV RNA和CHIKV RNA。结果10554份标本获得了有效的检测结果,在这次调查中未发现ZIKV、DENV和CHIKV核酸阳性。结论昆明地区无偿献血人群中ZIKV、DENV和CHIKV的感染风险较低,暂时没有必要对昆明地区无偿献血人群进行ZIKV、DENV和CHIKV的常规筛查。

2023年广州与西双版纳输入性登革病毒溯源与进化变异特征分析

目的研究2023年广州和西双版纳输入性登革病毒(dengue virus,DENV)输入来源和进化变异。方法使用扩增子测序方法对14例来自广州登革热病例和66例来自西双版纳登革热病例血清样本进行测序,并根据序列构建系统发育树和分析氨基酸突变位点。结果系统发育树显示,广州DENV-Ⅰ可溯源至缅甸,DENV-Ⅱ可溯源至印度尼西亚和肯尼亚。西双版纳DENV-Ⅰ可溯源至缅甸和泰国,DENV-Ⅱ可溯源至泰国。与参考序列相比,所得80条序列中平均每条序列约700个核苷酸突变,其中约10%为错义突变。值得注意的是,C蛋白和非结构蛋白2A(non-structural protein 2A,NS2A)突变频率高于其它区域。在结构蛋白中,广州DENV毒株C蛋白和E蛋白错义突变率均显著低于西双版纳,prM蛋白错义突变率显著高于西双版纳;在非结构蛋白中,广州毒株NS1、NS2A和NS5蛋白错义突变率均显著高于西双版纳,NS3蛋白错义突变率显著低于西双版纳。结论2023年广州地区输入性DENV来源于缅甸、印度尼西亚和肯尼亚,西双版纳地区输入性DENV来源于缅甸和泰国。广州DENV毒株错义突变主要发生在非结构蛋白,而西双版纳DENV毒株错义突变主要发生在结构蛋白。

黄芩苷通过调控PI3K/AKT信号通路抑制登革病毒感染诱导的人静脉内皮细胞的自噬

目的探究2型登革病毒(DENV-2)感染人脐静脉内皮细胞(HUVECs)对细胞自噬的影响及黄芩苷(BA)抗DENV-2感染的具体作用机制。方法HUVECs体外培养,设置对照组:HUVECs正常培养;DENV-2感染组:HUVECs+DENV-2;黄芩苷组:HUVECs+DENV-2+BA。用DENV-2感染HUVECs通过透射电镜观察自噬;Western blotting检测细胞自噬相关蛋白LC3、P62的表达,采用溶酶体红色荧光探针染色法观察DENV-2感染后HUVECs内溶酶体的pH变化;蛋白质组学筛查DENV-2感染HUVECs后差异蛋白的表达情况;使用CCK-8法测定黄芩苷对HUVECs活性的影响;RT-qPCR检测细胞内病毒RNA的复制情况;检测病毒NS1蛋白的表达情况;通过透射电镜观察细胞自噬;采用Lyso-Tracker Red染色法观察黄芩苷对DENV-2感染后HUVECs内溶酶体酸化的影响;检测细胞自噬相关蛋白ATG5、Beclin-1、LC3、P62的表达,自噬小体和溶酶体融合的关键蛋白STX17、SNAP29、VAMP8表达情况及PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。结果DENV-2感染可诱导细胞自噬小体的形成;DENV-2感染后LC3Ⅱ/LC3 I表达逐渐增高,48 h达到峰值(P<0.05);p62表达水平在感染前中期无明显变化,48 h后降低(P<0.05);Lysotracker red染色结果显示DENV-2感染组红色亮点较多,且染色明亮。CCK-8结果显示50μg/mL被视为黄芩苷对HUVECs细胞的最大无毒剂量。RT-qPCR结果显示随着黄芩苷浓度增加药物对病毒的抑制作用增强。黄芩苷可降低DENV-2 NS1蛋白的表达(P<0.001)。与DENV-2组相比,经过黄芩苷(50μg/mL)处理后,自噬减少,加入黄芩苷后抑制溶酶体酸化。黄芩苷组48 h LC3 II/LC3 I比值降低(P<0.05),48 h时p62表达增加(P<0.05)。经过黄芩苷处理后DENV-2诱导的自噬相关蛋白Beclin-1、ATG 5、STX17、SNAP29和VAMP8的表达下调(P<0.01)。蛋白组学结果显示PI3K-AKT通路在DENV的发病机制中可能发挥重要作用。加入PI3K抑制剂(LY294002)后,DENV-2的RNA表达水平降低,各组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达水平的蛋白表达水平降低(P<0.01)。用黄芩苷处理后,DENV-2感染组PI3K、AKT的mRNA表达水平均显著降低(P<0.05),而mTOR mRNA表达无明显变化。DENV-2感染组上调的p-PI3K、p-AKT的蛋白表达水平均降低(P<0.05),而p-mTOR表达无明显变化。DENV-2诱导的LC3、P62蛋白表达降低(P<0.05);在黄芩苷治疗组中也抑制了病毒诱导的自噬。结论DENV-2感染可促进HUVECs细胞自噬的发生,黄芩苷可抑制DENV-2的RNA和NS1蛋白的表达,可能通过抑制自噬发生及自噬体和溶酶体融合,降低DENV-2诱导的自噬,其作用机制可能是通过PI3K/AKT信号通路调控。

重庆市沙坪坝区白纹伊蚊密度和抗药性及其携带登革病毒现状调查

目的掌握重庆市沙坪坝区白纹伊蚊密度、季节消长情况、抗药性水平及其携带登革病毒状况,为预防和控制登革热传播流行提供科学依据。方法在居民区、公园和旧轮胎堆放地3类生境中采用双层叠帐法监测白纹伊蚊成蚊密度,在居民区采用布雷图指数法监测白纹伊蚊蚊幼密度;采用诊断剂量法中的成蚊接触筒法测定其抗药性;采用实时荧光定量PCR法检测登革病毒核酸。结果沙坪坝区2022年白纹伊蚊平均帐诱指数为1.42只/(帐·h),平均布雷图指数(Breteau index,BI)为0.88。不同生境白纹伊蚊成蚊密度差异无统计学意义(F=0.664,P>0.05),不同月份白纹伊蚊成蚊密度差异有统计学意义(F=2.941,P<0.05)。白纹伊蚊成蚊对高效氯氰菊酯、溴氰菊酯产生了抗药性,对马拉硫磷产生了可能抗性,对残杀威较为敏感。对采集的白纹伊蚊登革病毒核酸检测结果均为阴性。结论建议沙坪坝区继续加强白纹伊蚊密度、抗药性及其携带病原监测,防止登革热的发生与流行。

1型登革病毒感染病人血清中非结构蛋白1B细胞线性表位鉴定

目的鉴定1型登革病毒感染病人血清中1型登革病毒非结构蛋白1(nonstructural Protein 1 of Dengue virus type 1,DENV-1 NS1)B细胞线性表位。方法以重组DENV-1 NS1为抗原,免疫印迹法筛选NS1阳性病人血清。一组重叠DENV-1 NS1的重叠多肽同这些NS1阳性血清反应鉴定NS1蛋白线性B细胞表位。采用梯度稀释的1-4型重组DENVNS1竞争抑制阳性多肽同病人血清反应鉴定其反应特异性和交叉反应性。结果12份DENV-1核酸阳性病人中筛选得到5份抗DENV-1 NS1阳性病人血清。重叠多肽法、竞争抑制法和生物信息学方法筛选出3条阳性NS1多肽(氨基酸残基序列第1-15,131-145,271-285),其中aa1-15在已报道的DENV-1分离株高度保守,提示这个区域可能存在DENV-1血清型特异性表位。aa131-145和aa271-285对应的蛋白序列比对分析表明以上区域中的133-FI/LIDGP-138和271-GKLEL/M/IDF-277在已报道的4种血清型DENV分离株中高度保守,提示这2个区域存在4种血清型DENV共同表位。结论发现3个NS1上B细胞线性表位,其中aa131-145和aa271-285为首次报道,结果有助于疫苗和诊断试剂的研发。

登革病毒多价DNA疫苗构建及免疫保护效果验证

目的研究登革病毒(dengue virus,DENV)的多价DNA疫苗pVAX1-EDIII在小鼠体内的免疫原性及其保护作用。方法采用真核表达载体p VAX1,设计并构建含4种血清型登革病毒EDIII结构域的DNA疫苗。在第0、14和42天采用电脉冲肌肉导入方式免疫小鼠。末次免疫后1周,ELISA检测针对4种血清型登革病毒的血清特异性IgG抗体水平;ELISpot检测免疫后小鼠脾细胞分泌特异性IL-4、IFN-γ的水平;体内中和实验检测小鼠免疫后血清对感染DENV和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)乳鼠的保护效力。结果与对照组相比,电脉冲肌肉导入DNA疫苗诱导产生较高滴度的IgG抗体与较强的细胞免疫应答。免疫后血清对致死剂量DENV感染的3日龄乳鼠有完全保护作用,对ZIKV感染C57BL/c 1日龄乳鼠有部分保护作用。结论电脉冲肌肉导入登革DNA多价疫苗免疫可诱导针对4种血清型登革病毒的特异性体液免疫以及细胞免疫应答并能有效抵抗DENV的致死剂量攻毒,对ZIKV也能产生一定的保护效应,具有广谱抗黄病毒感染的潜力。

基于登革病毒免疫逃逸机制的小鼠感染模型研究进展

登革病毒(dengue virus,DENV)感染是世界上虫媒传播最广的病毒性疾病,感染人体后可出现轻型和严重程度不同的登革热疾病进程。由于DENV主要通过抵抗人干扰素(interferon,IFN)信号通路的传导来逃逸人体内的免疫系统的识别与攻击,而小鼠天然对DENV感染具有抵抗力,因此一直以来研究人员试图通过构建IFN信号通路相关分子敲除的小鼠模型来实现DENV的感染,但很难准确复制DENV感染的临床特征。本文总结了登革病毒基于IFN信号通路的免疫逃逸机制,分析了其相应靶点敲除小鼠模型在登革病毒的致病机制、疫苗和药物研发中的应用,最后提出在敲除小鼠的基础上,进一步进行人源化改造可能会获得更好的模拟临床DENV感染后不同疾病进程的小鼠模型。

登革病毒-2感染人脐静脉内皮细胞的磷酸化蛋白质组学分析

目的对登革病毒-2(DENV-2)感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的差异磷酸化蛋白质进行分析以及初步探究DENV-2感染的可能致病机制。方法实验设置DENV-2感染HUVEC组和HUVEC空白对照组,每组3个重复。收集细胞沉淀后,利用SDT裂解法获取蛋白质,通过串联质谱标签(TMT)法对磷酸化蛋白质进行定性与定量分析,对鉴定到的差异磷酸化蛋白质进行氨基酸保守基序分析、亚细胞定位分析、蛋白质结构域分析、GO富集分析、KEGG通路分析和蛋白质互作(PPI)等生物信息学分析。利用Western blot检测JUN、MAP2K2和AKT1磷酸化蛋白的表达。结果共检测到1385个差异蛋白质上的2918个修饰肽段,其中有1346个修饰肽段显著上调(FC>1.2,P<0.05),1572个修饰肽段显著下调(FC<0.83,P<0.05)。氨基酸保守基序分析共获得49个磷酸化保守基序。蛋白质结构域分析中富集到的差异磷酸化肽段最多是RNA识别基序、蛋白激酶结构域和PH结构域。通过亚细胞定位分析发现差异的修饰肽段主要定位在细胞核和细胞质中。GO富集和KEGG通路分析结果显示差异肽段主要在刺激反应的调节、含核碱基的小分子生物合成过程、吞噬体和白细胞跨内皮迁移处富集。对上调和下调的差异磷酸化蛋白分别进行蛋白质互作—KEGG联合分析,结果发现上调和下调的差异磷酸化蛋白质共富集到15条通路,且通过Western Blot检测与自噬途径相关的3个差异磷酸化蛋白质即JUN、MAP2K2和AKT1的表达,结果显示DENV-2组与空白组相比,p-JUN表达显著下调(1.48±0.01 vs 1.23±0.01,P<0.0001);p-AKT1表达显著上调(0.87±0.02 vs 1.01±0.01,P<0.001);p-MAP2K2表达显著上调(1.10±0.02 vs 1.29±0.05,P<0.01)。结论DENV-2感染HUVEC存在较多差异表达蛋白,p-JUN的下调、p-MAP2K2和pAKT1的上调提示3个能够调节自噬的磷酸化蛋白可能与DENV-2感染机制有关。

固相酶联免疫测定法检测NS1抗原在登革病毒感染早期诊断中的应用

目的探讨固相酶联免疫测定(ELISA)法检测NS1抗原在登革病毒感染早期诊断中的应用价值。方法选取登革病毒感染早期患者血清171份,非登革病毒感染发热患者血清11份,正常人血清10份,采用ELISA法检测全部192份血清的登革病毒NS1抗原和IgM抗体;采用逆转录-聚合酶链反应-限制性内切酶酶切片段长度多态性分析(RT-PCR-RFLP)技术对发病5 d内的125份血清进行扩增和鉴定分型;并采用C6/36细胞微量培养法对发病第1、2天的41份血清进行登革病毒分离培养。结果登革病毒感染患者发病2 d内、3～5 d以及6～10 d血清NS1抗原的检出率分别是92.7%(38/41)、83.3%(70/84)、10.9%(5/46);IgM抗体的检出率分别是2.4%(1/41)、51.2%(43/84)、97.8%(45/46);非登革病毒感染的发热患者及正常人血清中,有1例疟疾患者血清登革病毒IgM抗体呈阳性,NS1抗原无一例阳性。RT-PCR在登革病毒感染患者发病第1、2天和3～5天的检出率分别是85.4%(35/41)、83.3%(70/84);登革病毒感染患者发病第1、2天血清的病毒分离培养阳性率分别是80.0%(16/20)、38.1%(8/21),总分离率58.5%(24/41);RT-PCR-RFLP分型鉴定技术及间接免疫荧光法(IFA)均证实2006年广州流行株为登革Ⅰ型病毒。结论ELISA法检测登革病毒NS1抗原操作技术成熟,且具有敏感性高、特异性好的特点,对登革病毒感染的早期诊断和疫情的早期控制具有重要意义,适合于基层医疗机构常规应用。

登革病毒特异性T细胞在DHF/DSS发病中作用的研究

目的 研究登革病毒特异性T细胞在登革病毒致病中的作用。方法 首先把培养的HepG2移植到严重联合免疫功能不全 (SCID)小鼠体内 ,建立HepG2 graftedSCID (HepG2 SCID) ,然后将该小鼠分为 3组 :①A组 :登革病毒特异性T细胞 ( 2D42 )接种后次日 ,腹腔内接种 10 6pfu的Ⅱ型登革病毒 (DEN2 ) ;②B组 :正常小鼠胸腺细胞 (NMT)接种后次日 ,腹腔内接种DEN2 ;③C组 :腹腔内接种DEN2。观察感染后各组动物的死亡率、病毒血症及主要脏器的病理变化。结果 接种 2D42细胞 +感染的小鼠 ,80 %出现明显的临床表现 ,并在感染后 12 8d死亡 ,剩余的 2 0 %小鼠有一过性的临床表现 ,然后从疾病中恢复 ,并存活在 3个月以上。而接种NMT +感染或单纯感染的小鼠 ,死亡率均为 10 0 %。A组和B组小鼠血清中的病毒滴度和主要脏器的病理变化发生率明显高于C组。结论 DEN T细胞有保护机体免受病毒侵害和加重病情进展的双重作用 ,而NMT细胞只有加重病情的单一作用。

用登革病毒非结构蛋白1抗原检测法诊断登革病毒感染的效果分析

目的 :探讨用登革病毒非结构蛋白1(NS1)抗原检测法诊断登革病毒感染的效果。方法 :选取2018年8月至9月期间广州医科大学附属顺德医院收治的25例登革病毒感染患者作为研究对象。这些患者入院后,均对其进行登革病毒NS1抗原检测、登革病毒特异性IgG抗体和IgM抗体联合检测。然后比较用登革病毒NS1抗原检测法和登革病毒特异性IgG抗体、IgM抗体联合检测法对这些患者的病情进行诊断的准确率。结果 :用血清登革病毒NS1抗原检测法对这25例患者的病情进行诊断的准确率高于用血清登革病毒特异性IgM抗体和IgG抗体联合检测法对其病情进行诊断的准确率(P <0.05)。结论 :用登革病毒NS1抗原检测法诊断登革病毒感染的准确率较高。

登革病毒实时荧光PCR快速检测技术研究

目的建立TaqmanMGB实时荧光PCR技术快速检测登革病毒。方法利用TaqmanMGB技术，根据登革病毒3’端非编码区的一段高度保守序列，设计登革1～4型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针，以登革热毒株作为标准，以乙脑毒株作对照，建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法。并对8份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT-PCR及荧光PCR扩增。结果RT-PCR检测8份临床血清标本，2份阳性，阳性率为25％。实时荧光PCR检测登革病毒cDNA灵敏度为0．17pg／μl，病毒液灵敏度为10^-5TCID50与乙脑病毒无交叉反应，检测8份临床血清标本，5份阳性，阳性率为62．5％。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论TaqmanMGB实时PCR检测方法快速、敏感性高、特异性强，可作为登革病毒的快速检测方法，应用于登革热的临床早期诊断。

福建省首次从病人血清及蚊体分离出登革病毒的研究

目的 １９９９ 年入夏以来， 我省某地发生不明原因发热、头痛、肌痛、乏力、皮疹等症状的病人， 拟诊为登革热。为了从病原学上证实， 我们进行了病毒分离， 为防治工作提供科学依据。方法 应用早期病人血清７ 份， 白纹伊蚊１ 份经处理后接种Ｃ６／３６ 细胞， 并应用恢复期病人血清、双相血清、免疫血清及单克隆抗体进行免疫荧光法鉴定及分型。结果 在７份早期病人血清中经２ ～３ 代分离出５ 株登革病毒， 并从白纹伊蚊体内分离出１ 株登革病毒。结论 此分离的毒株经鉴定均为登革ＩＩ型病毒。此系福建省首次从病人血清及蚊媒体内分离出病毒的报告。不仅为防制工作提供科学依据， 而且为今后的研究奠定了基础。

TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应检测登革病毒

目的建立一种敏感、特异、重复性好的登革病毒(Dengue Virus, DV)鉴定方法.方法根据DV 3'端非编码区基因保守序列,设计一套特异性引物和TaqMan MGB探针.利用1998～2004年收集的26份登革热病人临床血清标本,15例乙脑病人血清,DV 4个血清型标准毒株及23株1978～1997年DV 地方流行株和相关西尼罗病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、基孔肯亚病毒等毒株,同时用克隆了1型DV 基因组3'端非编码区序列片段的质粒DNA作为阳性对照,检测所建立方法的特异性、敏感性.结果所建立方法的最低检测限约为每反应5个基因拷贝.用该方法检测4个血清型DV 标准毒株、23株DV 地方流行株和26例分离到DV 的阳性血清标本,检出率为100 %;用该方法检测15例乙脑病人血清、10例麻疹病人血清和西尼罗病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、基孔肯亚病毒,结果均为阴性.结论新建的TaqMan MGB探针检测DV 方法是实验室早期诊断登革热较理想的方法.

登革病毒的基因组分析及中国登革毒株的来源(英文)

目的分析登革病毒的基因组序列,了解目前世界范围存在的各种登革病毒基因型,探索部分中国毒株的可能来源。方法分析GenBank数据库中有完整基因组序列的登革病毒序列,利用NCBI服务器对基因组编码区序列进行在线比对,按最小进化法用MEGA5.0软件绘制种系发生树。结果分析了全球范围四种血清型共3000余株登革病毒的基因组序列,分别将各血清型毒株划分为4-6个基因型。通过对各基因型毒株背景的分析,证明基因型分布与毒株的地理来源存在一定联系。39株中国毒株中,多数能够通过种系发生树确定其来源。结论全球登革病毒的基因型分布具有地区特异性,中国登革毒株的传播来源存在多样性。

2014年福建省南平市登革病毒E基因序列分析

目的测定2014年南平市登革暴发相关登革病毒E基因序列,探讨其输入来源及基因型别。方法将患者急性期血清接种C6/36细胞,分离登革病毒,通过RT-PCR进行血清型鉴定,扩增全长E基因,测定序列并绘制系统进化树。结果共分离到4株DENV-1,2株DENV-2,扩增并测序获得E基因全长序列,4株南平地区DENV-1型分离株之间同源性为100%,与D13459(Donguang)分离株同源性也高达99.7%;2株DENV-2型分离株与DENV2/CN/GZ05/2014分离株的同源性均达100%。系统进化分析发现,4株DENV-1病毒株与来自广东及印度的毒株处于同一进化树分支,均为基因Ⅴ型;2株DENV-2病毒株与来自广东及新加坡的毒株处于同一进化树分支,均为基因Ⅳ型。结论福建省南平市本次登革热本地病例暴发可能是由广东或者东南亚地区的登革热输入病例引起的。

从登革出血热病人血清分离到一株登革病毒

从登革出血热病人血清分离到一株登革病毒左丽１程明亮２刘乐和３郭辉玉３丁一生２凌天翼１１贵阳医学院免疫学教研室（５５０００４）２贵阳医学院传染病学教研室３广州中山医科大学微生物学教研室近年来，由登革病毒（ＤＶ）引发的登革出血热（ＤＨＦ）和登革休克...

白纹伊蚊传播登革病毒的媒介效能研究

目的 :研究白纹伊蚊在登革病毒传播中的作用。方法 :应用C6 /36细胞培养分离病毒结合RFPCR检测 ;用间接免疫荧光法 (IFA)检测血清抗体。结果 :饱吸感染发病乳鼠血的白纹伊蚊 ,对DENⅠ～Ⅳ型有较高的感染率 (50 %～ 58% ) ,通过叮咬敏感动物 (乳鼠 )也能传播这 4个型的DEN。分批检测感染雌蚊的子 1代卵、幼虫及雌、雄成虫 ,证实白纹伊蚊能经卵传递DEN ,至少可传 2代以上。结论 :该蚊对DEN有较大的媒介效能 。

广州地区2012年1、2型登革病毒基因型特征研究

目的测定广州市2012年1、2型登革病毒（DENV1、DENV2）的E基因序列，探讨其来源及基因型。方法收集广州市2012年478例登革热患者急性期血清478份，用C6／36细胞培养分离登革病毒，RT—PCR法扩增全长E基因，测定序列并绘制系统发育树，结合流行病学资料进行分子流行病学分析。结果478例患者标本中分离到DENV16株，DENV22株，测序获得E基因序列，E基因长度均为1485bp，编码495个氨基酸，DENV1碱基同源性为97．4％～99．9％，推导的氨基酸同源性为99．2％～100．0％，其同源性与2011、2006和2004年份的国内DENV1流行株接近。DENV2碱基同源性为91．3％，推导的氨基酸同源性为97．8％，其同源性与我国DENV2流行株相对较远。进化分析发现，DENV1均属于同一亚型，即亚洲型，DENV2属于两个亚型，即马来西亚／印度次大陆和东南亚型。结论推测广州市2012年DENV1和DENV2均为输入性，DENV1可能由柬埔寨和广东佛山输入，DENV2可能由孟加拉国和缅甸输入。

应用含内参的多重实时荧光RT-PCR方法快速检测登革病毒和基孔肯雅病毒

目的建立一种登革病毒、基孔肯雅病毒并含人类基因内参检测的多重实时荧光RT-PCR方法,能在同一反应管内同时检测目前发现的所有来源的登革病毒或基孔肯雅病毒。方法针对登革病毒3′端非编码区和基孔肯雅病毒结构蛋白E2-6K-E1区以及人体各类组织细胞中均能稳定表达的RNAse P基因,设计了3套特异性引物和探针,建立了1套能同时检测登革病毒、基孔肯雅病毒及含有人类基因检测内参的多重实时荧光RT-PCR方法,对其灵敏性和特异性进行了验证,并对临床发热病人标本进行了应用评估。结果该方法对检测体外转录合成的登革病毒和基孔肯雅病毒RNA的灵敏性可达最低每个反应10～100拷贝,对检测登革1型病毒和基孔肯雅病毒的灵敏性分别可达最低每个反应0.1TCID50/mL和1TCID50/mL。用20株登革病毒、4株基孔肯雅病毒和日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、盖塔病毒、辛德毕斯病毒各1株进行检测,方法的特异性均为100%。方法应用于189份发热病人血清标本检测,可准确地鉴定出其中登革病毒或基孔肯雅病毒核酸阳性的标本,且所有血清标本均能被内参引物和探针有效地扩增和杂交。结论本研究建立了一种高灵敏性、高特异性且含人类基因内参检测的登革病毒和基孔肯雅病毒多重实时荧光RT-PCR检测方法,可作为登革热或基孔肯雅热病人早期快速鉴别诊断的有效工具,也可用于蚊媒携带登革病毒或基孔肯雅病毒的高通量快速筛查。