白果内酯调控AMPK-SIRT3正反馈环路介导的线粒体生物发生改善ATDC5软骨细胞炎性损伤

旨在以AMPK-SIRT3正反馈环路为切入点,探讨白果内酯改善白介素1β(IL-1β)诱导的ATDC5软骨细胞炎性损伤的作用机制。采用IL-1β(10 ng·mL^(-1))诱导ATDC5软骨细胞炎性损伤来构建体外骨关节炎模型,随机分为对照组,IL-1β组,IL-1β和白果内酯共同处理组,其中,共同处理组按照白果内酯的应用浓度又分为低、中和高(15、30和60μmol·L^(-1))3个不同剂量组。免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测各组软骨细胞中ADAMTS4、PGC-1a、Collagen Type II、MMP-3、NRF-1和Fis1的蛋白与mRNA表达情况。试剂盒检测各组ATP含量,并通过免疫荧光方法检测SIRT3表达水平。Western blot检测AMPK-SIRT3正反馈环路相关蛋白p-AMPK、AMPK和SIRT3表达水平。使用Compound C和3-TYP处理ATDC5软骨细胞,构建AMPK-SIRT3信号通路阻断模型,检测下游PGC-1a、NRF-1和Fis1蛋白变化。结果显示,白果内酯通过下调ADAMTS4和MMP-3表达(P<0.05),促进Type II collagen表达(P<0.05)来调节ECM代谢平衡,并促进ATP合成。在机制上,白果内酯干预软骨细胞后p-AMPK、SITR3、PGC-1a和NRF-1水平显著升高(P<0.05),而Fis1蛋白水平显著降低(P<0.05),并且使用Compound C和3-TYP预处理软骨细胞后,PGC-1a、NRF-1和Fis1蛋白水平被不同程度抑制。综上所述,白果内酯通过AMPK-SIRT3正反馈环路激活PGC-1a,调节线粒体生物发生改善ATDC5软骨细胞炎性损伤。

白果内酯通过抑制丝裂原活化蛋白激酶/核因子-κB通路减轻脓毒症诱发肝损伤实验研究

目的:探讨白果内酯对脓毒症诱发肝损伤的保护作用及机制。方法:利用盲肠结扎穿孔术建立小鼠脓毒症模型。利用随机数字表法将48只小鼠平均分为四组,对照组仅进行假手术,而不进行盲肠结扎;脓毒症组通过盲肠结扎建立脓毒症小鼠模型;低剂量组在建模后尾静脉注射4 mg/kg白果内酯溶液;高剂量组在建模后尾静脉注射12 mg/kg白果内酯溶液。记录各组小鼠7 d的存活率和体重,检测腹腔灌洗液和血液中的菌落形成数量;利用HE染色和高碘酸希夫(PAS)染色方法观察肝损伤情况;检测血清中丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)含量评估肝脏功能;利用试剂盒检测血清和肝脏匀浆中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-1β和IL-10;利用免疫组化技术检测中性粒细胞浸润;利用Western blot检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核因子-κB(NF-κB)通路中关键分子表达量。结果:白果内酯提高了脓毒症小鼠的存活率,减少了脓毒症小鼠腹腔灌洗液和血液中的菌落形成数量,并减轻了由脓毒症诱发的肝损伤。白果内酯减轻了脓毒症小鼠的炎症反应及肝脏的中性粒细胞浸润,抑制了脓毒症小鼠肝脏组织中活化的MAPK/NF-κB通路。结论:白果内酯通过抑制MAPK/NF-κB通路活化减轻脓毒症诱发的肝损伤。

白果内酯对慢性应激导致小鼠抑郁的保护作用及机制研究

为了探究白果内酯(BB)对抑郁小鼠的保护作用及其作用机制,文章以40%白果内酯粗品为原料,通过分子印迹固相萃取法(molecular imprinting solid phase extraction,MISPE)制备纯度为98.21%白果内酯。采用6~8周龄ICR小鼠36只,随机分为对照组、模型组、氟西汀组(10 mg/kg)、低剂量组(BB 3.5 mg/kg)、中剂量组(BB 7.0 mg/kg)、高剂量组(BB 14.0 mg/kg)6组。除对照组外,其余组均通过慢性不可预测性轻度应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)模型构建小鼠抑郁模型。实验过程中观察白果内酯干预后小鼠抑郁行为的变化,并记录小鼠体质量。实验结束检测小鼠血清中炎症因子、脑组织内单胺类神经递质和海马区脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的相对表达量。研究发现,白果内酯的干预使得小鼠抑郁情况得到改善,能够显著降低炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的质量浓度,提高单胺类神经递质多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)和5-羟色胺(5-HT)的质量比,并促进BDNF的表达。结果表明,白果内酯能够通过抑制炎症促进脑内单胺类神经递质的发生和BDNF的表达,从而发挥对抑郁小鼠的保护作用。

高速逆流色谱法分离纯化银杏叶中白果内酯和银杏内酯A、B、C

目的从银杏叶中分离纯化白果内酯和银杏内酯A、B、C。方法银杏叶提取液经醋酸乙酯萃取、D-101大孔吸附树脂柱和Al2O3柱纯化后得到总内酯提取物,提取物再经两次高速逆流色谱分离制备4种内酯单体。结果25%乙醇热提取、醋酸乙酯萃取、D-101柱、pH4.0的Al2O3柱对总内酯的提纯最终使总内酯质量分数达到44.98%。经高速逆流色谱制备得到的白果内酯和银杏内酯A、B、C最高质量分数分别为98.3%、98.9%、98.8%、98.4%。结论本法简便快速、回收率高。

白果内酯抗大鼠卡氏肺孢子虫肺炎的实验研究

目的 研究白果内酯治疗实验大鼠卡氏肺孢子虫肺炎的疗效。方法 以地塞米松皮下注射大鼠 6周诱导建立肺孢子虫肺炎动物模型 ,用不同剂量白果内酯治疗实验大鼠 ,以免疫抑制为对照组 ,通过大鼠肺质量 /体质量的值 ,肺印片每视野的包囊均数为指标评价疗效。结果 白果内酯 2 0mg/kg、3 0mg/kg治疗组大鼠肺质量 /体质量的值分别为 0 0 0 97± 0 0 0 3 3、0 0 10 2± 0 0 0 2 1,明显低于免疫抑制组对照组 0 0 14 6± 0 0 0 3 4(P <0 0 5 )。白果内酯 2 0mg/kg、3 0mg/kg治疗组大鼠肺印片每视野的包囊均数分别为 2 3 1± 0 88、1 95± 0 5 7明显低于免疫抑制组对照组 7 3 9± 2 3 3 (P <0 0 1)。

银杏内酯A、B和白果内酯的分离与纯化

以银杏叶浸膏 EGb76 1 为原料 ,通过预处理、制备色谱和重结晶过程 ,得到纯度达 98%以上的银杏内酯 A、B和白果内酯纯品。建立了一种较简单的分离和纯化银杏内酯 A。

高速逆流色谱分离制备白果内酯

目的 :以银杏叶粗提物为原料 ,利用高速逆流色谱法 (HSCCC)分离制备得到白果内酯单体。方法 :采用氯仿 甲醇 水 ( 4∶3∶2 )的溶剂系统 ,待两相溶剂充分混合后 ,临用前将其分开 ,在室温下 ,下相作流动相 ,上相作固定相 ,以 2 .0ml/min的流速 ,由首端向尾端洗脱 ,主机正转 ,转速为 80 0r/min ,固定相保留值为 78% ,进样 2 .0ml,定时收集馏分 ,用TLC鉴定。结果 :经一次HSCCC即可分离制得白果内酯单体 ,TLC方法可用于银杏内酯的定性检测。结论 :本方法简便、快速 。

LC-MS/MS快速测定不同采摘时间银杏叶中银杏内酯和白果内酯的含量

目的建立银杏叶中银杏内酯和白果内酯的高效液相电喷雾二级质谱(LC-MS/MS)定量分析方法,并对不同采摘时间银杏叶中银杏内酯和白果内酯含量进行测定。方法银杏叶样品以甲醇-水(1:9)提取,并用乙酸乙酯萃取,采用Phenomenex ODS柱分离,流动相为甲醇-水(60:40),流速0.7 mL·min^(-1)。电离方式为电喷雾正离子,采用多反应检测模式(MRM),捡测离子分别为m/z 409.4→345.3(银杏内酯A)、m/z 425.3→361.3(银杏内酯B)、m/z 441.4→325.3(银杏内酯C)和m/z 327.4→309.3(白果内酯)。结果分析过程仅需8.5 min,且无杂质干扰,4种成分回收率为91.79%～101.48%银杏内酯A,B和白果内酯含量分别在7月18日、8月19日和7月5日采摘的样品达到最高。结论方法快速、准确、选择性好,适合银杏内酯和白果内酯的定量分析,七月份叶子中内酯含量最高,为最佳采摘时间。

白果内酯对大鼠栓塞后脑水肿模型脑内水通道蛋白9的影响

目的探讨白果内酯(bilobalide,BB)对脑内水通道蛋白9(aquaporing,AQP9)的影响与其抗水肿作用的关系。方法利用Wistar大鼠持续性中动脉栓塞(permanent middle cerebral artery occlu-sion,pMCAO)制作左半球栓塞后水肿模型,通过脑水含量测定、梗塞面积测量、免疫组织化学染色、Real-time RT-PCR方法检测AQP9的mRNA和蛋白质的表达变化,对比栓塞对照组和BB预治疗组的差异,论证BB抗水肿的机制。结果正常组两侧脑含水量无差异。pMCAO24 h后,栓塞对照组和BB预治疗组脑水含量两侧均高于正常组,且栓塞侧明显高于栓塞对侧。BB预治疗组与栓塞对照组相比,两侧脑水含量均明显减低。pMCAO可引起大鼠皮质和白质中AQP9的大量表达。BB预治疗组较栓塞对照组胶质细胞和神经元细胞AQP9的表达出现明显减弱,特别是pMCAO 8 h和16 h时左侧白质及右侧皮质减低明显。pMCAO后AQP9的mRNA持续增加,16 h时达峰值,BB预治疗组明显降低了mRNA的合成。结论 BB通过抑制神经细胞中AQP9mRNA和蛋白质的合成机制脑水肿的形成。由于皮质中胶质细胞数量远大于神经元细胞,抑制AQP9合成的作用就更加明显。

白果内酯对血管性痴呆小鼠的保护作用

目的观察白果内酯(Bilobalide,BB)对血管性痴呆小鼠学习记忆功能的影响。方法采用双侧颈总动脉反复缺血—再灌注加尾动脉放血的方法建立小鼠血管性痴呆模型。血管性痴呆实验小鼠随机分为9组:假手术组、模型组,尼莫同组(Nimo,13.5 mg.kg-1),石杉碱甲片组(Hupe,0.06 mg.kg-1),BB(1.25、2.5、5、10、50 mg.kg-1)组,术后连续给药60 d。采用跳台和避暗实验,观察血管性痴呆小鼠学习和记忆的能力;化学比色法,检测脑组织匀浆中胆碱酯酶、SOD活性和MDA、NO含量;HE染色,观察脑组织病理形态学的变化。结果 BB可以缩短模型小鼠学习反应时间,延长记忆时间,减少错误次数;增加小鼠脑组织SOD活性和降低MDA含量,降低胆碱酯酶活性和NO含量。病理结果显示,BB对血管痴呆小鼠脑组织皮层和海马CA1区病理形态学变化有一定的改善作用。结论白果内酯对血管性痴呆小鼠具有一定的保护作用。

白果内酯和银杏内酯B对过氧化氢诱导人角质形成细胞氧化损伤的保护作用

通过CCK-8法测定细胞存活率,WST染色方法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,DTNB测定谷胱甘肽(GSH)活性,脂质氧化试剂盒检测丙二醛(MDA)含量,DCFH-DA法测定活性氧(ROS)含量,ELISA法测定炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量水平,研究了白果内酯和银杏内酯B对过氧化氢(H2O2)诱导人角质形成细胞(HaCaT细胞)的抗氧化损伤和抑制炎症因子的影响,同时利用药物数据库预测目标靶点,研究白果内酯和银杏内酯B发挥功效的机制。结果表明,白果内酯与银杏内酯B能减少H2O2诱导的SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性降低,抑制MDA释放增加,减少ROS的产量,减少炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的生成;综合网络分析结果显示白果内酯和银杏内酯B抗炎活性呈现多分子、多靶点和多通路特点。

白果内酯通过TLR4/TAK1/NF-κB通路对非酒精性脂肪肝炎大鼠模型肝纤维化的调控作用

目的探究白果内酯(BB)对非酒精性脂肪肝炎(NASH)大鼠肝纤维化的作用及机制。方法高脂饲料诱导建立NASH大鼠模型,检测血清高密度脂蛋白(HDL)、甘油三酯(TG)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)浓度;HE染色观测肝组织病理变化;免疫组化检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,ELISA检测白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和IL-1β表达;Western blot检测基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)和TLR4/TAK1/NF-κB通路蛋白的表达。结果与NASH组比较,BB组(中、高剂量)血清TG、ALT和AST浓度明显降低,HDL浓度明显升高;肝组织病理损伤减轻;同时BB组大鼠肝组织α-SM A的阳性表达明显减少;给予BB 8周后,大鼠肝组织MMP-1表达明显增多,TIMP-1表达水平明显降低,炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β表达也明显被抑制;此外,BB还可显著促进NASH大鼠TLR4和TAK1表达,升高p-p65/p65比值。结论 BB能通过抑制TLR4/TAK1/NF-κB通路激活减轻NASH大鼠肝纤维化程度。

银杏萜内酯A、B、C和白果内酯的热特征分析

研究银杏萜内酯A、B、C和白果内酯的热特征并探讨鉴定这些化合物的新方法.用热重分析法(TGA)和差示扫描量热法(DSC)分别对银杏萜内酯A、B、C和白果内酯进行热特征分析.所有样品的热重(TG)和微商热重(DTG)曲线都有各自的谱图特征,其DSC曲线的峰形、峰位置和峰值也有特征;银杏萜内酯A、B、C的稳定性较差,不能准确测得其熔点;白果内酯受热稳定,能够测得其熔点.利用TGA和DSC法容易鉴定银杏萜内酯A、B、C和白果内酯.用TG-DTG法对银杏萜内酯A、B、C和白果内酯在非等温条件下进行热分解动力学研究,把从TG-DTG曲线中得到的数据和30个不同的方程采用Achar微分法和Madhusudanan-Krishnan-Ninan(MKN)积分法对其进行非等温分解动力学研究,得到动力学参数活化能(E和指前因子A)和分解动力学机理及方程.

银杏内酯和白果内酯对大鼠脑缺血再灌注损伤后VEGF的表达的影响

目的研究银杏内酯(ginkgolides,GK)和白果内酯(bilobalide,BB)对大鼠脑缺血再灌注损伤后血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响,探讨GK和BB能否通过影响血管生成实现神经保护作用。方法制备Wistar大鼠大脑中动脉缺血(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,缺血2 h后再灌注12 h。将实验动物随机分为4组:假手术组(Sham组)、MCAO+盐水对照组(Saline组)、MCAO+白果内酯组(10 mg/kg,BB组)和MCAO+银杏内酯组(10 mg/kg,GK组)。缺血2 h再灌注12 h后,对大鼠神经功能缺损评分。通过TTC染色观察脑梗死体积变化,应用免疫组化及Western blot检测各组大鼠缺血侧脑皮质区VEGF及其受体VEGFR-1的表达。结果与Saline组相比,GK组和BB组动物神经行为学评分明显降低(P<0.05),脑梗死体积明显减小(P<0.05);与Saline组相比,GK组和BB组VEGF阳性细胞表达数目及蛋白表达均明显增高(P<0.05),而VEGFR-1阳性细胞数表达数目增多,其蛋白表达量未见明显变化。结论银杏内酯和白果内酯对脑缺血/再灌注损伤的保护作用可能与促进VEGF的表达有关。

白果内酯调控LEF1-AS1/miR-23b-3p分子轴缓解肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞损伤

目的探讨白果内酯对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞损伤的保护作用及其对lncRNA LEF1-AS1/miR-23b-3p分子轴的调控作用。方法用肺炎链球菌诱导肺泡上皮细胞建立细胞损伤模型(感染组);分别转染si-NC、si-LEF1-AS1后,用肺炎链球菌感染细胞(感染+si-NC组和感染+si-LEF1-AS1组);pcDNA、pcDNA-LEF1-AS1分别转染至肺泡上皮细胞后用白果内酯与肺炎链球菌共同处理细胞(感染+白果内酯+pcDNA组和感染+白果内酯+pcDNA-LEF1-AS1组)。ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6的水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;qRT-PCR法检测LEF1-AS1、miR-23b-3p的表达量;双荧光素酶报告基因实验检测LEF1-AS1与miR-23b-3p的靶向关系;Western blot检测Bcl-2、Bax蛋白表达量。结果白果内酯能够降低肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平和LEF1-AS1的表达量(P<0.05),并可降低凋亡率和Bax蛋白水平(P<0.05),还可促进miR-23b-3p和Bcl-2表达(P<0.05),且呈剂量依赖性;LEF1-AS1可靶向调控miR-23b-3p;转染si-LEF1-AS1可降低TNF-α、IL-1β、IL-6的水平以及凋亡率和Bax蛋白水平(P<0.05),增加Bcl-2蛋白水平(P<0.05);转染pcDNA-LEF1-AS1能够逆转白果内酯对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞炎性因子及凋亡的作用。结论白果内酯可通过调控LEF1-AS1/miR-23b-3p分子轴抑制肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞炎性反应及凋亡,进而减轻细胞损伤。

白果内酯对半乳糖诱导的痴呆小鼠学习记忆功能的保护作用

目的研究白果内酯(Bilobalide,BB)对D-半乳糖诱导的痴呆小鼠的保护作用。方法采用D-半乳糖皮下注射建立小鼠衰老模型,通过跳台和避暗实验检测小鼠的学习和记忆能力;采用比色法,测定小鼠脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量;采用HE染色法,观察小鼠脑组织病理形态学变化。结果结果表明,白果内酯(5、10 mg/kg)能不同程度地提高痴呆小鼠的学习记忆成绩,提高脑组织中SOD活性,降低MDA含量,HE染色结果提示白果内酯对小鼠脑组织皮层和海马CA1区病理形态学变化有一定的改善作用,结论白果内酯对半乳糖诱导的痴呆小鼠有一定的保护作用,其作用机制可能与抗氧自由基有关。

白果内酯对Aβ25-35诱导HT22细胞损伤及NLRP-1炎症小体激活的影响

目的研究白果内酯对Aβ25-35诱导HT22细胞损伤及NLRP-1炎症小体激活的影响。方法Aβ25-35(1μmol/L)诱导HT22建立细胞损伤模型,同时白果内酯(6、12、24μmol/L)和NADPH氧化酶抑制剂(DPI,15μmol/L)处理24 h,采用CCK-8法检测细胞活力,Annexin V-FITC/PI双染法检测神经元细胞凋亡率,流式法(DCFH-DA荧光探针)测定细胞内ROS生成,ELISA法测定IL-1β、IL-6、TNF-α水平,Western blot法检测NLRP-1、ASC、caspase-1的蛋白表达。结果与对照组比较,模型组细胞活力下降(P<0.01),神经元细胞凋亡率提高(P<0.01),同时,ROS的生成、细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平及NLRP-1、ASC、caspase-1的蛋白表达均增多(P<0.01);与模型组比较,白果内酯(12、24μmol/L)组能提高细胞活力,减少ROS生成,降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平与神经元细胞凋亡率(P<0.05,P<0.01),白果内酯(24μmol/L)组能抑制细胞NLRP-1、ASC及caspase-1的蛋白表达(P<0.01)。结论白果内酯对Aβ25-35诱导的小鼠海马神经元HT22细胞损伤具有较好的保护作用,其机制可能与抑制NADPH氧化酶-ROS介导的NLRP-1炎症小体激活有关。

白果内酯抗卡氏肺孢子虫体外作用的研究

目的研究不同浓度白果内酯抗体外培养卡氏肺孢子虫的作用。方法接种卡氏肺孢子虫(Pc)于人肝癌细胞(HepG-2)。4h后加入试验药物和对照试剂。白果内酯浓度分别为:150、100、50、25、12.5μM/L;对照药喷他脒:15μM/L;以后每隔1d取1/10培养液观察,分别作对倍稀释PCR和六亚甲基四胺银(GMS)染色计数Pc包囊。结果卡氏肺包子虫在体外培养细胞上的生长高峰出现于第6d,对倍稀释PCR提示,白果内酯50μMol/L以上浓度对Pc均有抑制作用,白果内酯150μMol/L、100μMol/L对Pc的抑制率分别为91.67%和93.75%,与喷他脒95.83%之间比较,P>0.05,提示以上两浓度的白果内酯对Pc的抑制作用与喷他脒15μMol/L相似;白果内酯50μMol/L与各组间差异均有显著性,提示其作用优于空白对照组,而不及白果内酯100μMol/L组,同时随着药物剂量的增加其抗Pc的作用增强;药物对Pc包囊的抑制率白果内酯150μMol/L、100μMol/L分别为58.85%、53.62%,与喷他脒63.01%比较,P>0.05,提示这两个浓度的白果内酯对Pc包囊的抑制作用与喷他脒15μMol/L相似;其余浓度白果内酯与空白对照组间差异无显著性,提示这几种浓度的白果内酯对Pc包囊无明显的抑制作用。结论白果内酯在体外对Pc有明显抑制作用,白果内酯150μMol/L、100μMol/L对Pc的抑制作用与喷他脒相当。

银杏植物各部位及银杏组织培养细胞中银杏内酯B和白果内酯含量的初步研究

用高压液相色谱法对五年生扦插银杏各部位及银杏组织培养细胞中银杏内酯B和白果内酯的含量进行了测定。结果表明银杏内酯B和白果内酯在银杏植物各部位的含量差异很大。银杏内酯B在银杏叶中含量最高,白果内酯在银杏侧根中含量最高。在6,7-V培养基下银杏组织培养细胞中同时测出银杏内酯B和白果内酯,提示用植物组织培养方法有可能同时产生银杏内酯B和白果内酯。