花旗松素调节MCP-1/CCR2轴对急性淋巴细胞白血病细胞恶性进展的影响

目的:研究花旗松素(Taxifolin)对急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞恶性进展的影响及单核细胞趋化蛋白-1(CCL2)/CC趋化因子受体2(CCR2)轴发挥的作用。方法:体外培养ALL-T淋巴细胞CCRF-CEM;CCK-8法检测不同浓度Taxifolin对CCRF-CEM细胞活力影响,筛选本实验用Taxifolin浓度;将CCRF-CEM细胞分为control组、Taxifolin-L组、Taxifolin-M组、Taxifolin-H组、Taxifolin+rCCL2组;EDU法检测各组CCRF-CEM细胞增殖;流式细胞术检测各组CCRF-CEM细胞凋亡;Transwell检测各组CCRF-CEM细胞侵袭能力;平板克隆形成实验检测各组CCRF-CEM细胞集落形成能力;RT-PCR检测各组CCRF-CEM细胞CCL2、CCR2基因表达水平;Western blot检测各组CCRF-CEM细胞CCL2、CCR2、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达水平。结果:选择25、50、100μmol/L三个Taxifolin浓度进行后续实验;与control组相比,Taxifolin-L、M、H组CCRF-CEM细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白表达水平显著升高,CCRF-CEM细胞EDU阳性细胞率、侵袭细胞数量、细胞克隆集落数、CCL2、CCR2基因表达水平、CCL2、CCR2、Bcl-2蛋白表达水平均显著性降低,且呈剂量依赖性(P<0.05);与Taxifolin-H组相比,Taxifolin+rCCL2组CCRF-CEM细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白表达水平显著性降低,CCRF-CEM细胞EDU阳性细胞率、侵袭细胞数量、细胞克隆集落数、CCL2、CCR2基因表达水平、CCL2、CCR2、Bcl-2蛋白表达水平均显著性升高(P<0.05)。结论:Taxifolin可能通过抑制CCL2/CCR2轴,从而抑制CCRF-CEM细胞恶性进展。

过表达CASP1诱导人急性髓系白血病细胞THP-1的G_(0)/G_(1)细胞周期阻滞和NLRP3炎性小体介导的焦亡

目的:探讨半胱天冬酶1(Caspase1,CASP1)对人急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞THP-1的细胞周期和细胞焦亡的影响。方法:培养THP-1细胞,将细胞分为对照组(正常培养的THP-1细胞),pcDNA3.1-null组(过表达CASP1的阴性对照,用5.0μg/mL的pcDNA3.1-null质粒转染THP-1细胞24h)、pcDNA3.1-CASP1组(过表达CASP1,用5.0μg/mL的pcDNA3.1-CASP1质粒转染THP-1细胞24h)。用CCK-8法检测各组细胞的增殖活力。用流式细胞术检测各组细胞凋亡和周期的变化。用qRT-PCR法检测细胞中CASP1、白细胞介素(interleukin,IL)-1β,IL-18的mRNA表达水平。用Western blot法检测细胞增殖相关蛋白Ki67、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA),细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(Nod-like receptor heat protein domain associated protein 3,NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白((apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、CASP1、切割半胱天冬酶1(cleaved-caspase 1,cleaved-CASP1)、IL-1β,IL-18、cleaved-Gasdermin D的相对表达水平。结果:与对照组比,pcDNA3.1-null组的细胞增殖活力、细胞凋亡、细胞周期变化均无统计学意义(P>0.05)。与对照组比,pcDNA3.1-CASP1组的细胞凋亡变化无统计学意义(P>0.05),细胞的增殖活力减少,G_(0)/G_(1)细胞周期被阻滞,Ki67、PCNA、cyclin D1的相对表达水平均减少(P<0.05),NLRP3、ASC、CASP1、cleaved-CASP1、IL-1β,IL-18、cleaved-Gasdermin D的相对表达水平均增加(P<0.05)。与pcDNA3.1-null组比,pcDNA3.1-CASP1组的细胞凋亡变化无统计学意义(P>0.05),细胞的增殖活力减少,G_(0)/G_(1)细胞周期被阻滞,Ki67、PCNA、cyclin D1的相对表达水平均减少(P<0.05),NLRP3、ASC、CASP1、cleaved-CASP1、IL-1β,IL-18、cleaved-Gasdermin D(30 kDA)的相对表达水平均增加(P<0.05)。结论:过表达CASP1诱导AML细胞THP-1的G_(0)/G_(1)细胞周期阻滞和NLRP3炎性小体介导的焦亡。

mTOR信号通路影响人早幼粒白血病细胞株HL60的趋电性

生物电信号指导的细胞定向迁移行为在多细胞生物体的重大生理和病理过程中发挥重要作用,然而电信号指导细胞定向迁移的机制并不清楚.利用体外直流电刺激探究细胞定向迁移机制是研究生物电信号指导细胞行为常用的手段.作者对人早幼粒白血病细胞株HL60的趋电性作用进行了研究,发现在300 mV/mm的直流电场中,HL60细胞发生明显朝向电场阴极的趋电性运动,其趋电性指数和轨迹速度分别为0.89±0.04和9.72±0.38μm/min;Rictor敲低突变株的趋电性与野生型之间无限制性差异.利用高浓度mTOR的特异性抑制剂PP242药物处理HL60细胞后,细胞在直流电场中的趋电性指数降低到0.82±0.06,运动速度也被显著抑制.以上研究结果表明,mTOR信号通路在HL60细胞的趋电性运动中发挥了一定的作用,但Rictor并不是关键基因.研究结果为开发生物电场依赖的靶向药物提供了理论基础.

槲皮素对白血病细胞增殖、凋亡的影响

目的 探讨槲皮素对白血病细胞增殖、凋亡的影响。方法 人原髓细胞白血病细胞(HL-60)加入10、20、40μmol/L浓度的槲皮素100μl,分别记为槲皮素10、20、40μmol/L组,另加入RPMI1640培养液100μl为空白组。比较各组细胞增殖、凋亡、黏附能力、迁移能力、侵袭情况;检测各组HL-60细胞中半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase)家族蛋白8、9、3的表达情况。结果 槲皮素抑制白血病细胞的增殖活力,其活力随槲皮素浓度和作用时间的增加而加强。槲皮素各组凋亡指数较空白组增加,黏附率、迁移率、侵袭数较空白组降低,差异有统计学意义(P<0.05),且槲皮素各组呈显著浓度依赖性(P<0.05)。40μmol/L槲皮素能够显著上调caspase9、3蛋白表达(P<0.05)。结论 槲皮素能够抑制白血病HL-60细胞的增殖、迁移和侵袭,促进凋亡,对其具有较强的杀伤作用,凋亡机制与细胞中caspase9、3蛋白有关。

芦可替尼对人红白血病细胞免疫检查点分子表达的影响

目的:芦可替尼通过抑制酪氨酸蛋白激酶2(tyrosine protein kinase 2,JAK2)通路来抑制人红白血病(human erythroleukemia,HEL)细胞的血管新生及迁移能力,而HEL细胞中程序性死亡受体1(programmed death-1,PD-1)、程序性死亡受体配体1(programmed death-ligand 1,PD-L1)的表达及芦可替尼对其表达的影响尚无相关报道。本研究探讨芦可替尼对JAK2 V617F突变阳性HEL细胞增殖、凋亡以及免疫检查点分子PD-1、PD-L1表达的影响。方法:用不同浓度的芦可替尼处理HEL细胞,细胞增殖检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞活力,流式细胞术检测HEL细胞凋亡率,荧光定量PCR检测JAK2、PD-1及PD-L1 mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测p-JAK2、PD-1、PD-L1蛋白质表达水平。流式细胞术分析淋巴细胞与HEL细胞共培养48 h后HEL细胞PD-1、PD-L1的表达和淋巴细胞PD-1的表达及调节性T细胞比例。结果:不同浓度芦可替尼能够抑制HEL细胞增殖,并与时间和剂量呈正相关。芦可替尼能够降低JAK2、PD-1、PD-L1 mRNA及蛋白质表达水平,并与时间和剂量呈正相关。结论:芦可替尼可能通过特异性抑制JAK2信号通路降低HEL细胞PD-1、PD-L1的表达。

依达拉奉对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7炎性反应的抑制作用

目的 探讨依达拉奉(EDA)对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7炎性反应的抑制作用。方法 以脂多糖诱导RAW264.7细胞,复制炎性细胞模型。采用CCK-8法检测EDA的细胞毒性作用。实验分为空白组(等体积培养基)、模型组(等体积培养基)、给药组(40μg/mL EDA)。采用Griess法检测细胞中一氧化氮(NO)水平,采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定细胞中前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素18(IL-18)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、活性氧(ROS)水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)法测定细胞中IL-1β和IL-18 mRNA表达水平;采用Western blot法检测细胞中JAK2/信号转导和转录激活因子3(STAT3)通路相关蛋白JAK2,p-JAK2,STAT3,p-STAT3,IL-1β,IL-18的蛋白表达水平。结果 与0μg/mL比较,20,40,80,160μg/mL EDA处理下细胞存活率无显著变化(P <0.05)。与模型组比较,给药组细胞中NO,PGE2,IL-1β,IL-18,TNF-α,ROS水平均显著降低(P <0.05);IL-1β与IL-18 mRNA及蛋白表达水平和p-JAK2/JAK2与p-STAT3/STAT3均显著降低(P <0.05)。结论 EDA可能通过抑制JAK2/STAT3通路的激活而抑制RAW264.7细胞的炎性反应。

RNA结合蛋白RBPMS调控急性髓系白血病细胞系THP-1增殖与迁移

目的研究具有多重剪接功能的RNA结合蛋白(RBPMS)对携带MLL-AF9融合基因的急性髓系白血病细胞系THP-1功能的影响。方法使用GEO数据库分析造血系统中RBPMS的表达情况;通过慢病毒感染THP-1细胞,RT-qPCR和Western blot检测RBPMS过表达效率;通过高通量测序检测RBPMS过表达后对THP-1细胞转录组的影响。分别用CCK-8法和流式细胞仪检测RBPMS过表达对白血病细胞增殖以及迁移能力的影响。结果RBPMS在携带MLL-AF9融合基因的急性髓系白血病干细胞中异常低表达。RBPMS过表达后THP-1细胞的增殖和迁移能力显著降低(P<0.0001,P<0.05)。结论RBPMS可以抑制携带MLL-AF9融合基因的急性髓系白血病细胞系的细胞增殖与迁移。

细胞毒性T淋巴细胞和T白血病细胞利用柔软性逃避穿孔素介导的杀伤

目的细胞毒性淋巴细胞(CTL)释放的穿孔素仅在肿瘤细胞膜表面打孔,而不在CTL表面形成孔洞,这种单向杀伤机制在免疫学角度尚未被阐明。穿孔素打孔既是一个化学过程,也是一个生物力学过程,细胞可利用其柔软性妨碍穿孔素打孔。方法实验室前期研究发现活化的CTL下调FLNA表达,通过柔软性逃避穿孔素介导的杀伤,这种柔软性同样被T白血病细胞用于免疫逃逸。结果和结论本研究在细胞、动物及病人3个水平结合多组学、原子力显微镜等手段,发现ZAP70介导的YAP Y357磷酸化和活化使filamin A下调来诱导柔软性的形成。并且在CTL中,耐药转运蛋白MDR1表达更高,因此CTL比恶性T细胞对YAP抑制剂更具耐药性。YAP的适度抑制使恶性T细胞变硬,但CTL仍然保持一定的柔软性,从而使CTL在杀伤恶性肿瘤细胞时避免自溶。因此,本发现揭示了一种基于机械力的针对T细胞白血病的免疫治疗策略。本研究基于生物机械力学和肿瘤免疫核心问题进行探究,揭示了T白血病细胞免疫逃逸背后的生物力学机制,为开发基于生物机械力学的新型免疫治疗奠定了理论基础。

NCTD通过调控PPP5C影响人白血病细胞增殖和凋亡的机制研究

目的研究去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)通过调控磷酸蛋白磷酸酶催化亚基5C(protein phosphatase 5 catalytic subunit,PPP5C)对人白血病NB4、K562细胞增殖、凋亡能力的影响及机制的初步研究。方法体外培养NB4、K562细胞,电转PC3.1和PPP5C-PC3.1质粒至NB4、K562细胞,遗传霉素(geneticin,G418)筛选NB4、K562稳转细胞系。Western blot和RT-qPCR实验检测PPP5C蛋白和mRNA表达水平。采用CCK-8、迁移实验、Live&Dead^(TM)动物细胞活力/毒性检测试剂盒分别检测NB4、K562细胞的增殖能力、迁移能力和死细胞、活细胞的数量。将NB4、K562稳转细胞分为0μg/mL NCTD组和不同浓度NCTD组,分别用含有0、8、16、32μg/mL NCTD的1640培养基培养;Live&Dead^(TM)动物细胞活力/毒性检测试剂盒检测死细胞率并对细胞形态进行拍照;Western blot检测各组细胞caspase 3、Cleaved caspase 3、JNK、p-JNK、p38、p-p38和α-Tubulin蛋白表达水平。结果NB4、K562细胞转染后PPP5C表达水平显著提高,细胞增殖能力、迁移能力、抗凋亡能力显著增强;与0μg/mL NCTD组相比,NCTD各浓度组会促进细胞凋亡,且呈剂量依赖性;PPP5C过表达拮抗NCTD对白血病细胞的杀伤作用;机制研究发现PPP5C通过去磷酸化修饰降低p-JNK的蛋白水平进而调控与细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase 3的表达。结论NCTD能够通过调控PPP5C分子促进NB4、K562细胞凋亡,抑制细胞的增殖。

多参数流式细胞技术分析髓系白血病细胞相关免疫表型

目的 探讨常见的急性髓系白血病细胞相关免疫表型,并阐述其在临床中的应用价值。方法 应用多参数流式细胞技术分析47例急性髓系白血病(AML)患者骨髓标本中白血病细胞相关免疫表型,并对其免疫分型结果与治疗、预后的相关性进行统计分析,进而探讨AML免疫分型在临床中的应用。结果 47例AML患者阳性高表达的髓系抗原有CD33(93.62%)、CD13(89.36%)、MPO(89.36%)、CD117(82.98%)、CD64(38.30%);造血干/祖细胞CD分子阳性表达以CD38(93.62%)、CD34(65.96%)、HLA-DR(51.06%)为主;其他抗原以CD56(48.94%)、CD7(23.40%)、CD19(19.15%)为主。经相同时间治疗后,23例(48.94%)AML患者病情得到完全缓解,患者阳性表达T细胞系抗原CD7的完全缓解率显著低于阴性患者(P<0.05)。6例(26.09%)患者在1 a内复发,没有任何一种抗原表达情况与之有关(P>0.05)。随访结束后,有26例(55.32%)患者死亡,阳性表达NK细胞系抗原CD56和T细胞系抗原CD7患者的死亡率显著性高于阴性表达的患者,阳性表达B细胞系抗原CD19的患者死亡率显著性低于阴性表达的患者(P<0.05),幼稚标志与成熟标志不同步的患者死亡率高于幼稚标志与成熟标志同步的患者(P<0.05)。结论 髓系抗原CD33、CD13、MPO、CD117、CD64是AML诊断中可靠的抗原标志物,AML患者的免疫分型结果可为临床医生确定治疗方案和判断预后提供参考。

急性早幼粒细胞白血病细胞形态分类体系及其与实验室检查和FLT3-ITD突变的相关性分析

目的:建立一套用于表征急性早幼粒细胞白血病(APL)患者细胞形态特点的分类体系,并分析不同APL细胞形态特点与常规检验指标和基因变异的相关性。方法:根据APL白血病细胞的形态特征,建立一套14类的分类体系用以表征患者个体间和个体内的细胞形态异质性。将该分类体系用于40例APL患者的形态学分析,并将分类结果与患者的常规检验指标和基因变异特点进行统计学分析,以分析不同APL细胞形态特征与常规检验指标和基因变异的相关性。结果:FLT3-ITD突变阳性的APL病例组中核形规则、粗颗粒且不见Auer小体(1类)的细胞显著少于FLT3突变阴性病例组(P<0.05)。核形规则组相比于核形不规则组活化部分凝血活酶时间(APTT)明显较长(P<0.05);细颗粒组相比于粗颗粒组APTT明显较长(P<0.01)、骨髓白血病细胞比例相对更低(P<0.05);Auer小体阴性组的外周血白细胞计数、D-二聚体、乳酸脱氢酶和骨髓白血病细胞比例均显著高于Auer小体增多组(均P<0.05)。结论:本研究建立的形态学分类体系可以客观表征不同类型的APL白血病细胞,有助于更好地评估APL白血病细胞的个体内和个体间异质性和进一步用于精确分析APL的形态表型与生物学特性的相关性。

miR-141-5p/ZNF705A对慢性粒细胞白血病细胞源外泌体调控骨髓间充质干细胞黏附作用的机制

目的探讨慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)细胞源外泌体(exosome,Exo)中miR-141-5p/ZNF705A对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)黏附作用的影响。方法电镜和NTA粒径分析检测CML患者外周血和K562细胞中的Exo形态大小;qRT-PCR和Western blot检测转染前后K562细胞的Exo、BMSCs标记分子及黏附蛋白的表达情况;细胞黏附实验检测BMSCs的黏附能力;CCK-8法检测BMSCs活性、萤光素酶实验检测miR-141-5p与ZNF705A结合情况等。结果qRT-PCR结果显示,miR-141-5p表达在CML患者和K562细胞源Exo中均明显降低;qRT-PCR和Western blot等结果表明,CML患者中BMSCs的黏附蛋白CD44和CXCL12表达明显降低,且能够吞噬K562细胞源Exo。进一步发现,与CD34^(+)细胞相比,K562源性Exo能够降低Exo促进的BMSCs中CD44和CXCL12表达和黏附作用;同时,双萤光素酶基因报告等验证miR-141-5p与ZNF705A靶向结合;最后发现通过上调K562细胞源Exo中miR-141-5p的表达,靶向抑制ZNF705A,进而促进BMSCs的活性和黏附功能。结论K562细胞下调Exo中miR-141-5p表达,减少对ZNF705A的靶向抑制,进而抑制BMSCs的黏附功能,从而调控CML患者的骨髓造血功能。

长链非编码RNA母系表达基因8通过微小RNA-495-3p调控急性髓性白血病细胞高迁移率族蛋白A1表达及对细胞增殖、凋亡的作用机制研究

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)母系表达基因8(MEG8)通过微小RNA-495-3p(miR-495-3p)调控急性髓性白血病细胞(AML)高迁移率族蛋白A1(HMGA1)表达及对细胞增殖、凋亡的机制。方法:选取50例经确诊为AML患者的骨髓活检标本与52例健康骨髓捐赠者骨髓标本,常规培养人AML细胞株HL-60,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法骨髓单个核细胞中lncRNA MEG8 mRNA表达。将HL-60细胞分为六组,即HL-60组(HL-60细胞)、si-NC组(转染si-NC)、si-lncRNA MEG8组(转染si-lncRNA MEG8)、mimic-NC组(转染mimic-NC)、miR-495-3p mimic组(转染miR-495-3p mimic)、si-lncRNA MEG8+miR-495-3p mimic组(转染si-lncRNA MEG8+miR-495-3p mimic),CCK-8法检测培养24、48、72 h各组细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞中HMGA1表达,双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA MEG8、miR-495-3p、HMGA1之间的关系。结果:与对照组相比,观察组lncRNA MEG8 mRNA表达升高(P<0.05)。与miR NC+MEG8 WT组比较,miR-495-3p mimic+MEG8 WT组荧光素酶活性下降(P<0.05),与miR NC+HMGA1 WT组比较,miR-495-3p mimic+HMGA1 WT组荧光素酶活性下降(P<0.05)。与HL-60组、si-NC组、mimic-NC组比较,si-lncRNA MEG8组、miR-495-3p mimic组和si-lncRNA MEG8+miR-495-3p mimic组24、48 h细胞增殖能力均显著下降,si-lncRNA MEG8+miR-495-3p mimic组细胞增殖率最低(P<0.05)。与HL-60组、si-NC组和mimic-NC组比较,si-lncRNA MEG8+miR-495-3p mimic组HL-60细胞凋亡率高于si-lncRNA MEG8组和miR-495-3p mimic组(均P<0.05)。与HL-60组、si-NC组和mimic-NC组比较,si-lncRNA MEG8+miR-495-3p mimic组HMGA1蛋白表达低于si-lncRNA MEG8组和miR-495-3p mimic组(均P<0.05)。结论:沉默lncRNA MEG8可能通过上调miR-495-3p来下调HMGB1,来抑制HL-60细胞的恶性生物学行为,可为探索AML潜在治疗靶点提供了新思路。

紫草素对人早幼粒细胞白血病细胞自噬和凋亡的影响

目的:探讨紫草素对人早幼粒细胞白血病细胞自噬和凋亡的影响及可能的机制。方法:取对数生长期的人早幼粒细胞白血病细胞NB4,将其分为对照组(未处理的NB4细胞)、紫草素组(0.3μmol/L紫草素处理)、740Y-P组(15μmol/L PI3K/Akt/m TOR通路激活剂740Y-P处理)、紫草素+740Y-P组(0.3μmol/L紫草素与15μmol/L 740Y-P共同处理),处理24 h后,用于后续实验,CCK-8法检测各组细胞活力,单丹磺酰戊二酸染色检测细胞自噬囊泡的聚集情况,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测各组细胞中Beclin1、LC3、p62、Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2及PI3K/Akt/m TOR通路相关蛋白的表达。结果:与对照组比较,紫草素组NB4细胞内紫色点状荧光强度、细胞凋亡率及Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、cleaved caspase-3、Bax蛋白相对表达量升高,OD_(450)值(24、48 h)及Bcl-2、p62蛋白相对表达量降低(均P<0.05);与对照组比较,740Y-P组NB4细胞内紫色点状荧光强度、细胞凋亡率及Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、cleaved caspase-3、Bax蛋白相对表达量降低,OD_(450)值(24、48 h)及Bcl-2、p62蛋白相对表达量升高(均P<0.05);与紫草素组比较,紫草素+740Y-P组NB4细胞内紫色点状荧光强度、细胞凋亡率及Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、cleaved caspase-3、Bax蛋白相对表达量降低,OD_(450)值(24、48 h)及Bcl-2、p62蛋白相对表达量升高(均P<0.05)。与对照组比较,紫草素组NB4细胞中PI3K/Akt/m TOR通路相关蛋白p-PI3K、p-Akt、p-m TOR蛋白表达显著降低,而740Y-P组显著升高(均P<0.05);与紫草素组比较,紫草素+740Y-P组NB4细胞中p-PI3K、p-Akt、p-m TOR蛋白表达显著升高(均P<0.05)。结论:紫草素可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路促进NB4细胞自噬与凋亡。

miR-155对慢性髓细胞白血病细胞凋亡及热休克蛋白表达的影响

目的探讨微小RNA-155(miR-155)对慢性髓细胞白血病(CML)细胞凋亡情况和对热休克蛋白(HSP)27、HSP60及HSP70表达的影响。方法采用实时荧光定量逆转录PCR(RT-qPCR)分别检测miR-155在CML耐伊马替尼(IM)细胞株K562-G和CML细胞株K562中的表达水平。以携带miR-155的慢病毒和阴性对照慢病毒感染K562-G细胞,分别命名为miR-155组和对照组。细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测miR-155对耐药细胞增殖的影响。RT-qPCR及蛋白质印迹法(Western blot)检测miR-155对HSP27、HSP60、HSP70表达的影响。流式细胞术检测miR-155组和对照组细胞的凋亡比例。结果与K562细胞相比,K562-G细胞中miR-155呈低表达(P<0.05)。miR-155组细胞的增殖情况与对照组相比从第36 h开始降低(P<0.05)。与对照组相比,miR-155组HSP60、HSP70升高(P<0.05),而HSP27降低(P<0.01)。流式细胞术检测结果显示,miR-155组细胞的凋亡率高于其对照组(P<0.05)。结论miR-155促进CML细胞的凋亡,并使细胞中的HSP60、HSP70表达升高,HSP27表达降低。

miR-760/CPEB2轴对急性淋巴细胞白血病细胞凋亡和增殖的影响

目的探究miR-760对急性淋巴细胞白血病(ALL)凋亡和增殖的影响和机制。方法采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-760和细胞质多腺苷酸化元件结合蛋白2(CPEB2)相对表达。Ball-1细胞分为不同组:miR-NC组(转染miR-NC)、miR-760mimic组(转染miR-760 mimic)、si-NC组(转染si-NC)、si-CPEB2组(转染si-CPEB2)、oe-NC组(转染oe-NC)、oe-CPEB2组(转染oe-CPEB2)、miR-760 mimic+oe-NC组(共转染miR-760 mimic+oe-NC)和miR-760 mimic+oe-CPEB2组(共转染miR-760 mimic+oe-CPEB2)。流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测Bax、c-caspase-3、t-caspase-3、Ki67、PCNA和CPEB2相对表达量。双荧光素酶报告实验验证miR-760和CPEB2靶向结合。结果与人B淋巴母细胞HMy2.CIR比较,ALL细胞系Ball-1、Reh和JurkatE6中miR-760水平表达下降,CPEB2 mRNA和蛋白水平表达上升(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-760 mimic组细胞凋亡率、Bax和c-caspase-3水平表达上升,而Ki67和PCNA水平表达下降(P<0.05)。生物信息学方法预测miR-760靶向调控CPEB2,双荧光素酶报告实验验证CPEB2是miR-760的靶标。与si-NC组比较,si-CPEB2组细胞凋亡率、Bax和c-caspase-3水平表达上升,而Ki67、PCNA水平表达下降(P<0.05)。上调CPEB2表达能逆转miR-760过表达对细胞凋亡率、Bax、ccaspase-3的促进和对Ki67、PCNA的抑制(P<0.05)。结论miR-760靶向调节CPEB2,诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖,为ALL治疗提供新选择。

糖酵解参与调控楝酰胺抑制慢性粒细胞白血病细胞增殖的研究

本研究旨在探讨糖酵解参与楝酰胺的抗慢性粒细胞白血病细胞活性及机制。研究发现,楝酰胺以时间和浓度依赖性抑制K562细胞的生长增殖,其作用于K562细胞3 d的IC 50为21.70±5.68 nmol/L。楝酰胺阻滞K562细胞于G2/M期,诱导出现凋亡。楝酰胺降低了K562细胞的葡萄糖消耗量和乳酸生成水平,抑制c-Myc和己糖激酶2(hexokinase 2,HK2)的蛋白表达。K562细胞在进行去葡萄糖处理后生长减慢,乳酸生成水平降低,c-Myc蛋白表达下调。楝酰胺在无葡萄糖培养下K562细胞上的抑制率明显低于含葡萄糖培养下K562细胞上的抑制率。以上结果说明楝酰胺具有抗慢性粒细胞白血病细胞活性,其作用机制可能是抑制c-Myc和HK2介导的糖酵解。

靶向CD74的嵌合抗原受体T细胞的抗白血病细胞作用研究

嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)疗法目前已应用于血液肿瘤的治疗,前期研究发现CD74在白血病患者白血病干细胞中高表达,为了探索其对白血病细胞的杀伤作用,通过CD74 CAR表达载体的构建、慢病毒载体的包装及T细胞的感染,制备CD74 CAR-T细胞。利用体外杀伤实验及细胞因子的释放检测确定CAR-T细胞对CD74^(+)的白血病细胞的特异性杀伤作用。结果显示,CD74 CAR-T分别与CD74^(+)的THP-1及CD74^(-)的K562白血病细胞共培养时,THP-1细胞可被清除,而对CD74^(-)的K562细胞无明显杀伤作用。CD74 CAR-T细胞可被CD74^(+)的THP-1细胞有效激活,通过细胞因子释放途径有效杀伤白血病细胞。研究成功构建了靶向CD74^(+)的白血病细胞的CAR-T细胞,为白血病的免疫治疗提供了新的靶点和免疫治疗策略。

激酶ULK1对急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡作用的研究

目的 探讨ULK1对急性T淋巴细胞白血病细胞株CEM-C7凋亡的影响及与AMPKα/ULK1轴之间的关系。方法 通过予不同浓度ULK1激活剂LYN-1604(0、1.2、2μmol/L)、ULK1抑制剂MRT68921(0、1.2、2μmol/L)干预CEM-C7细胞24 h,流式细胞术检测各药物浓度对CEM-C7细胞株凋亡率的影响,筛选凋亡最明显的药物浓度进行后续实验,Edu及Soft agar实验检测其对CEM-C7细胞株增殖的影响,流式细胞术检测其对CEM-C7细胞株线粒体膜电位的影响,透射电镜观察其对CEM-C7细胞细胞核及线粒体超微结构变化的影响,Western blot检测激活和抑制ULK1后ULK1、p-ULK1(Ser317)、Caspase3、Cleaved-caspase3、Bcl-2、Bax、PCNA、AMPKα、p-AMPKα(Ser172)的表达情况。结果 ULK1抑制剂及激活剂分别干预CEM-C7细胞24 h以后,与对照组相比,ULK1抑制剂可明显促进CEM-C7细胞发生凋亡,抑制CEM-C7细胞增殖,使细胞线粒体的膜电位明显下降,差异均具有统计学意义(P<0.05);透射电镜可观察到明显的细胞凋亡现象;p-ULK1(Ser317)、p-AMPKα(Ser172)的蛋白水平表达下降,而ULK1激活剂对CEM-C7细胞株无明显影响。结论 ULK1可能通过AMPKα/ULK1轴影响其对CEM-C7细胞的凋亡功能。

氯普噻吨调节Akt/mTOR通路对人急性髓系白血病细胞自噬和凋亡的影响

目的探讨氯普噻吨通过调节蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路对人急性髓系白血病(AML)细胞自噬和凋亡的影响。方法以SKNO-1、MOLM-13两个细胞系为研究对象,0、20、40、60μmol/L氯普噻吨分别处理SKNO-1、MOLM-13细胞6、12、24 h,CCK-8检测细胞增殖情况。实验分为4组,对照组正常培养、SC79组用5 mg/L SC79处理细胞2 h,氯普噻吨组用40μmol/L氯普噻吨处理细胞12 h,氯普噻吨+SC79组在SC79组基础上添加40μmol/L氯普噻吨处理细胞12 h。单丹磺酰尸胺(MDC)染色检测自噬的发生情况;流式细胞术检测细胞凋亡率;蛋白质免疫印迹检测自噬相关蛋白SQSTM1/p62、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B),凋亡相关蛋白聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(PARP)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase3)、激活型caspase3(cleaved caspase3)以及Akt/mTOR信号通路相关蛋白Akt、磷酸化(p)-Akt、mTOR、p-mTOR表达情况。结果在SKNO-1、MOLM-13细胞中,6、12、24 h时,与0μmol/L氯普噻吨相比,20、40、60μmol/L氯普噻吨处理后细胞增殖抑制率升高(P<0.05);在同一时间点,随着氯普噻吨浓度的升高,细胞增殖抑制率升高,40μmol/L氯普噻吨处理细胞12 h进行接下来研究。在SKNO-1、MOLM-13细胞中,与对照组相比,SC79组细胞凋亡率、自噬小体阳性率,LC3B、PARP、cleaved caspase3/caspase3蛋白表达水平降低(P<0.05),SQSTM1/p62、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平升高(P<0.05);而氯普噻吨组表现出相反趋势(P<0.05);在SC79组基础上添加氯普噻吨,与氯普噻吨组相比,细胞凋亡率、自噬小体阳性率,LC3B、PARP、cleaved caspase3/caspase3蛋白表达水平降低(P<0.05),SQSTM1/p62、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论氯普噻吨能够抑制Akt/mTOR通路促进人AML细胞自噬和凋亡。