新型百日咳疫苗研究进展

百日咳(whooping cough)是一种由百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)感染所引起的急性呼吸道传染病,严重时可导致婴幼儿死亡。近年来百日咳的复发流行表明,百日咳的防控效果不理想,现有疫苗的保护力衰减是其重要的原因,亟需研发新型百日咳疫苗。现从不同研发角度对加强免疫、提高产能和优化工艺以及对全细胞百日咳疫苗(whole-cell pertussis vaccine,w P)、无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccine,a P)的改进,新抗原来源形式、应用新运送系统、新佐剂的新型百日咳疫苗作一概述。

应用CHO细胞法检测百日咳疫苗中的残余毒性

根据百日咳毒素（PT）能特异地使中华地鼠卵巢细胞（CHO）聚集的性质，采用CHO细胞分析法检测了18批全细胞百白破疫苗（DTPw）和12批无细胞百白破疫苗（DTPa）。存放于4℃的两种疫苗中，DTPw聚集CHO细胞滴度的几何均值（GMT）是30.79±2．316,DTPa不产生聚集、两种疫苗在37℃存放4周后，DTPw聚集滴度的GMT是948．09±1．598．DTPa是205．67±1．392。实验结果表明，百日咳疫苗存在明显的毒性逆转现象，与动物试验不一致。因此建议采用CHO方法检测百日咳疫苗中PT的毒性。

百日咳疫苗血清学效力试验与小鼠保护力试验结果的相关性

目的 了解百日咳疫苗血清学效力试验（ＰＳＰＴ）与小鼠保护力试验（ＭＰＴ）结果的相关性，为该法替代ＭＰＴ积累资料。方法 用不同剂量的ＤＴＰ疫苗免疫小鼠，４ｗ后采血，用ＥＬＩＳＡ测定小鼠血清中抗百日咳菌表面 抗原的总抗体滴度。用平行线法计算疫苗的效力，与ＭＰＴ测定结果进行相关性分析。结果１５批疫苗分别用 ＰＳＰＴ和ＭＰＴ法测定的效力单位相关性显著（ｒ＝ ０．９３５８，ｐ＜０．００１），二者差异无显著意义（Ｐ＞０．０５）。与 ＭＰＴ法相 比，ＰＳＦＦ法有更高的重复性，而且９５％可信限较小。结论ＰＳＰＴ法有望取代ＭＰＴ。

双抗夹心ELISA法在无细胞百日咳疫苗生产质控中的应用

实验中对无细胞百日咳疫苗的脱毒工序优化后,采用双抗夹心ELISA法来检测百日咳有效组分含量,同时采用效价试验方法来验证结果。ELISA法定量测定有效成分的结果和效价试验结果均证明达到《中国药典》三部2005版的要求。由于双抗夹心ELISA法特异性强,灵敏度高,适用于无细胞百日咳疫苗生产各个环节的质量控制。

第二代百日咳疫苗毒性国家标准品的建立

目的建立第二代百日咳疫苗毒性国家标准品(简称二代毒性标准品)。方法选用百日咳疫苗生产菌株(编号CS株CMCC58003)进行发酵罐培养,将收获的百日咳菌液灭活后分装冻干后,作为第二代百日咳国家毒性标准品的候选品(简称候选毒性标准品)。以第一代百日咳疫苗毒性国家标准品为标准(简称一代毒性标准品),由4个单位协作标定候选毒性标准品,采用热加速法考察候选毒性标准品的稳定性。结果共获得检定合格的候选毒性标准品1 800支;经4个实验室协作标定,每支二代毒性标准品LPU为21,HSU为41;且稳定性良好。结论候选毒性标准品各项指标均符合要求,可作为第二代百日咳疫苗毒性国家标准品使用。

Lewis大鼠实验性变态反应性脑脊髓炎动物模型的建立及百日咳疫苗的影响

目的建立可靠的Lewis大鼠实验性过敏性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)动物模型;方法采用Lewis大鼠脚垫皮下注射豚鼠全脊髓匀浆(spinal cords homogenate of guinea pigs,GPSCH)和含有卡介苗(bacille calmetteguerin,BCG)10mg/ml的完全福氏佐剂(complete Freund's adjuvant,CFA)诱导EAE,从临床症状评分、光镜、电镜下病理学改变对模型进行评价。结果Lewis大鼠EAE的发病率为9/10,潜伏期为12.6±1.01天。百日咳疫苗(bordetella pertussis vaccine,BPV)可提高EAE的发病率,缩短EAE的潜伏期(P<0.05),加重其临床症状和病理改变(P<0.05)。结论GPSCH和CFA免疫Lewis大鼠建立的EAE是成功可靠的;BPV对EAE有显著的促发作用,可诱导形成超急性EAE。

无细胞百日咳疫苗中百日咳毒素活性测定分析

百日咳毒素(pertussis toxin,PTx)是鲍特氏菌属百日咳杆菌产生的一种主要毒力因子,具有多种生物学活性,如淋巴细胞增多促进活性、组胺致敏活性、中华仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)簇集作用、胰岛激活作用、T细胞有丝分裂促进作用、红细胞凝集活性等[1-4],是引起百日咳众多临床症状的原因,同时也是无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccine,APV)的主要保护性抗原组分[5]。

无细胞百日咳疫苗的质量控制及其标准化

无细胞百日咳疫苗在全世界范围内已逐渐用于婴幼儿的计划免疫和加强注射中 ,但到目前为止没有完全令人满意的效力试验方法。小鼠保护试验不适合对无细胞百日咳疫苗进行效力评估 ,免疫原性试验在衡量制品一致性方面是有用的 ,但与临床保护之间缺乏相关性 ,最近建立的气雾攻击主动保护试验为功能性效力试验开创了美好的前景。用生物学结合物理化学方法对疫苗抗原含量 ,纯度 ,安全性和免疫原性的研究 。

无细胞百日咳疫苗效力国家参考品的建立

采用罐培养百日咳CS菌株，培养物经硫酸铵两段盐析、浸提后，再经蔗糖密度梯度离心，收集以FHA．PT为主的百日咳菌保护性抗原，经福尔马林解毒，制备成原液。该原液按照中国和日本的生物制品规程检定合格后，加入保护剂，稀释至18μgPN／ml，分装冻干制备成无细胞百日咳疫苗效力参考品。以JNIH3和JNIH－6参考品为标准，按照日本规程的小鼠脑腔攻击法标定其效力单位。根据14次效力试验所得的结果和日本NIH标定的结果，该批疫苗效力国家参考品的效力单位定为15PIU／ml。

无细胞百日咳疫苗生产用菌种CMCC58003Fim2、Fim3抗原成分的血清学检测

目的检测无细胞百日咳疫苗生产用菌种CMCC58003(简称CMCC58003)的Fim2、Fim3抗原成分。方法运用玻片凝集试验法进行检测。结果现有5个批次CMCC58003的Fim2、Fim3抗原成分的玻片凝集试验均为阳性。结论 5个批次CMCC58003的Fim2、Fim3抗原成分的血清学检测结论为合格。

美开展大规模无细胞百日咳疫苗试验

美开展大规模无细胞百日咳疫苗试验李长信译娄长春校由美国国主卫生研究院（ＮＩＨ）变态反应和传染病研究所（ＮＩＡＩＤ）的微生物学与传染病科所开展的百日咳计划．负责开展百日咳领域里的几项研究的开发、管理、监控、培训等项工作。ＮＩＡＩＤ根据美国国会《国家儿童...

溶液环境对百日咳疫苗分离纯化的影响

针对百日咳疫苗在低盐条件下不稳定,容易聚集而导致层析过程收率低、分离度低的难题,实验中选择脲作为稳定剂来改善百日咳疫苗所处的溶液环境,并采用离子交换层析和凝胶过滤层析进行百日咳疫苗的分离纯化,通过ELISA抗原活性测定和还原性SDS-PAGE等方法研究了脲对百日咳疫苗分离纯化的影响。结果表明,在流动相中加入2mol/L脲作为稳定剂,能显著提高离子交换层析和凝胶过滤层析中的PT和FHA活性回收率、凝胶过滤层析的分离度、PT和FHA的纯度。这些结果对百日咳疫苗的分离纯化和层析工艺优化提供了重要的依据和参考。

第三代百日咳疫苗毒性国家标准品的制备和标定

目的:制备和标定第三代百日咳疫苗毒性国家标准品,用于百日咳疫苗毒性检测。方法:按照《中国药典》三部(2015版)的相关要求,选用百日咳疫苗生产菌株CS株进行发酵罐培养,将收获的百日咳菌液灭活后分装冻干,作为第三代百日咳疫苗毒性国家标准品的候选品。按照《中国药典》三部要求对候选品进行检定,以第二代百日咳疫苗毒性国家标准品为标准,组织6家单位进行协作标定,并采用热加速试验对候选毒性标准品进行稳定性考察。结果:共制备合格候选毒性标准品7000支,其外观、水分、分装精度均符合《中国药典》的相关要求;协作标定结果经统计学分析,最终确定每支第三代毒性标准品LPU为60,HSU为84;且稳定性良好。结论:候选毒性标准品各项指标均符合《中国药典》的各项要求,且一致性、稳定性良好,可作为第三代百日咳疫苗毒性国家标准品使用。

两种不同类型无细胞百日咳疫苗诱导小鼠免疫应答分析

目的比较两种不同类型无细胞百日咳疫苗免疫小鼠后诱导体液免疫和细胞免疫应答的特点。方法将BALB/c小鼠分为3组(分别纯化Pa组、共纯化Pa组、PBS组),分别用稀释后的两种不同工艺生产的无细胞百日咳疫苗及PBS皮下接种,接种量0.5 m L/只,于第4周加强免疫,剂量与初免相同。于免疫后第1周、第4周和第5周取血,分离血清用于检测小鼠抗百日咳抗体Ig G水平(抗-PT和抗-FHA);同时于加强免疫后第7天,分离小鼠脾淋巴细胞,经刺激后,取其培养上清,用流式细胞微球芯片捕获法(cytometric bead array,CBA法)测定脾淋巴细胞经体外刺激后所产生的Th1、Th2和Th17型细胞因子的含量。结果对两种类型无细胞百日咳疫苗组检测的结果进行比较,在免后第4周,分别纯化Pa组和共纯化Pa组的抗-PT和抗-FHA Ig G水平差异无统计学意义(P>0.05);但在免后第5周,分别纯化Pa组的抗-PT和抗-FHA Ig G水平均高于共纯化Pa组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。经PT刺激后诱导产生的细胞因子,分别纯化Pa组的IL-4含量高于共纯化Pa组,差异具有统计学意义(P<0.05);分别纯化Pa组和共纯化Pa组的其他细胞因子差异均无统计学意义(P>0.05)。结论两种类型的无细胞百日咳疫苗免疫小鼠后均能诱导产生体液免疫应答和细胞免疫应答。

无细胞百日咳疫苗的研究开发进展和临床评价

儿童感染百日咳博代氏杆菌导致的发病率和死亡率仍很普遍。虽然用全细胞百日咳疫苗控制百日咳有效，但由于接种它后副作用较大，迫使人们不得不去开发新一代的疫苗。无细胞百日咳疫苗开发成功则是该类疫苗研究的重大进展，它与全细胞疫苗相比有内毒素含量减少、反应原较小和免疫持续时间长等优点。另外，儿童接种无细胞疫苗后的不舒服感大大减少，依从性增加，还有望扩大到青少年和成人中免疫，使人类在全球上消灭百日咳成为可能。