双标准曲线相对定量PCR试验原理与方法

实时荧光定量PCR(FQ-PCR)是一种准确有效的核酸定量分析技术,具有易操作、高通量、高敏感性、高特异性、高度自动化和低污染等优点,并随新定量PCR仪及新操作方法的发展而得到广泛应用,但是,定量PCR的高敏感性特点使得实验操作严格而繁琐。阐述了一种改进的相对定量方法——双标准曲线法的试验原理和特点,描述了定量PCR体系的优化方式,探讨了试验误差分析方法及试验操作技巧,并就试验数据的处理方法进行讨论。试验证明,双标准曲线法是一种经济、简单而准确的定量方法。

定量RT-PCR及其在植物学研究中的应用

定量RT-PCR(Quantitative reverse transcriptase-PCR)是在反转录和定量PCR的基础上发展起来的一种特异性检测基因表达的技术。主要包括相对定量RT-PCR(Relative quantitative RT-PCR)、竞争性定量RT-PCR(Competitive quan-titative RT-PCR)、比较定量RT-PCR(Comparative quantitative RT-PCR)和实时定量RT-PCR(Real time quantitative RT-PCR)四种。目前定量RT-PCR在植物学研究中的应用越来越广泛,如植物营养学研究、植物发育学研究、植物抗逆机理研究、转基因植物的检测、病原菌的检测、植物与微生物互作机理研究、植物抗病性检测等方面。本文综述了定量RT-PCR的原理及在植物学中的应用。

微小脲原体相对定量方法的建立及临床应用

目的建立微小脲原体(Up)聚合酶链反应(PCR)相对定量方法,克服阴道标本采样差异对检测结果的影响,并探讨Up在细菌性阴道病(BV)中的作用。方法根据Up 4个血清型拓扑异构酶Ⅳ基因序列,合成Up定量PCR的引物和探针,建立Up PCR定量方法;同时进行宿主细胞甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因定量,计算103宿主细胞中Up的相对含量;分别检测Up标准株和临床分离株、解脲脲原体标准株和临床分离株、11种其它阴道常见微生物,验证PCR的特异性;从532例BV患者和276名健康女性采集阴道分泌物,进行Up相对定量分析。结果 Up定量PCR方法能直接检测阴道分泌物中的Up,对解脲脲原体和11种其它阴道常见微生物无交叉反应,灵敏度为100拷贝/μL。BV患者和健康女性的Up感染率分别为49.8%(265/532)和43.1%(119/276),二者之间差异无统计学意义(χ2=3.263,P=0.071);BV患者和健康女性Up相对定量分别为667拷贝/103细胞和20拷贝/103细胞,二者比较差异有统计学意义(χ2=47.012,P=0.000 1)。如果以50拷贝/103细胞作为参考值,则BV患者Up的阳性率为39.3%(209/532),健康女性的阳性率为17.0%(47/276),二者比较差异有统计学意义(χ2=41.537,P=0.001)。结论 Up黏附到宿主细胞表面是其致病的关键因素。建立的Up相对定量方法能反映宿主细胞上Up的含量,克服了采样差异对检测结果的影响,能更客观地反映Up的致病能力。

H5N1禽流感病毒感染豚鼠体内线粒体抗病毒信号蛋白SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的建立H5N1禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)感染豚鼠体内线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法,并检测H5N1 AIV感染前、后豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平。方法提取豚鼠肺脏组织RNA,反转录合成cDNA,将cDNA模板按10倍系列稀释为9个浓度(1.00 E+10~1.00 E+02 copies/μl),进行PCR扩增。以β-actin为内参,建立标准曲线,比较两基因的扩增效率,验证该方法的引物特异性、重复性及灵敏度。同时用该方法检测H5N1 AIV攻毒前、后豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平。结果 c DNA模板最佳稀释度范围为1.00 E+09~1.00 E+04。豚鼠MAVS和β-actin基因的标准曲线斜率差值<0.1,R^2=0.999,扩增效率分别为100.2%和100.3%;两基因扩增溶解曲线峰单一,可扩增出清晰的目的条带,且无非特异性扩增;两基因Ct值的变异系数(CV)均<10%;灵敏度为1.00 E+03 copies/μl。感染H5N1 AIV的豚鼠肺脏组织中MAVS的表达水平下调。结论成功建立了H5N1 AIV感染豚鼠体内MAVS的SYBR GreenⅠ相对荧光定量PCR检测方法,并发现H5N1 AIV感染可导致豚鼠体内MAVS表达水平下调。

金花茶查尔酮异构酶基因全长克隆与表达的初步研究

利用RT-PCR和RACE技术,从我国珍稀濒危植物金花茶花瓣中获得了查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因的cDNA全长,命名为Cn-CHI,GenBank登录号HQ269805.1。碱基序列分析表明,Cn-CHI基因全长953bp,包含56 bp的5’非翻译区、204 bp的3’非翻译区和一个长为693 bp编码230个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列比对分析表明,Cn-CHI基因编码蛋白与蔷薇科、杜鹃花科、茄科等植物的CHI蛋白同源性都在75%以上,与山茶科山茶属茶树CHI蛋白同源性高达99%。相对荧光定量PCR分析表明,Cn-CHI基因在金花茶花蕾发育过程中呈现先急剧上升后平缓下降的趋势;在花器官的不同部位中,Cn-CHI基因表达量最高的是雌蕊,其次是雄蕊,在萼片和花瓣中的表达量较低且相差不大。

苏尼特羊钙蛋白酶抑制蛋白基因表达规律及其与肉质的相关性研究

选取40只苏尼特羊为研究对象,采用相对定量PCR技术对不同月龄苏尼特羊背最长肌、臂三头肌、股二头肌中CAST基因的表达规律与肉质相关性进行研究,分析基因表达量与肉质指标的关联。结果表明:CAST在三个实验部位中的表达规律相同,5、6、8月龄有不同程度的增高,12月龄降到最低。4个月龄中,CAST基因的表达量为臂三头肌(Q)>股二头肌(H)>背最长肌(B)。5月龄时股二头肌(H)和背最长肌(B)表达量基本相同,8月龄时,臂三头肌(Q)和股二头肌(H)表达量基本相同。在8、12月龄时,臂三头肌(Q)中CAST基因的表达量显著高于背最长肌(B)。在背最长肌中,CAST基因表达量与剪切力(r=-0.449)、黄度值(r=-0.753)、p H2(r=-0.245)呈负相关;与红度值呈显著负相关(r=-0.950,p=0.050);与亮度值(r=0.171)、p H1(r=0.387)呈正相关;在股二头肌中,CAST基因表达量与剪切力(r=0.520)、黄度值(r=0.846)呈正相关;与红度值(r=-0.091)、亮度值(r=-0.193)、p H1(r=-0.446)、p H2(r=-0.446)呈负相关。在臂三头肌中,CAST基因表达量与剪切力(r=0.333)呈正相关;与红度值(r=-0.494)、黄度值(r=-0.465)、亮度值(r=-0.317)、p H1(r=-0.814)、p H2(r=-0.629)呈负相关。

甘蓝型油菜半胱氨酸蛋白酶cDNA的克隆及组织特异性表达分析

采用SSH(Suppression subtractive hybridization)和Race-PCR(Rapid-amplification of cDNA ends)技术克隆得到来自甘蓝型油菜(Brassica napus L.)矮化突变体‘NDF-1’的一个差异表达基因编码区的全长cDNA序列,命名为Bncp5.该基因全长1224bp,含有1080bp的完整开放阅读框,编码359个氨基酸.该基因编码区与甘蓝中一个与衰老相关的半胱氨酸蛋白酶基因(登录号AF454960)同源性达97%,氨基酸序列同源性达到100%.Bncp5编码的蛋白相对分子质量为39.5×103,等电点为5.57.对其活性位点的分析表明其具备真核生物半胱氨酸蛋白酶的活性中心,且有很高的功能区段保守性,推测为一跨膜蛋白.相对定量PCR的检测结果表明,Bncp5在野生型和矮化突变体的根、茎、子叶和真叶中都有表达,但是表达量存在显著性差异.在野生型高秆油菜中,根的表达量最低,在真叶的表达量最高;在矮化突变体中,根、茎中的表达明显高于野生型,而在子叶和真叶中的表达量与野生型油菜的表达量基本一致.

基于转录组测序的铝胁迫下甘蓝型油菜新内参基因的发掘与引物开发

为了研究甘蓝型油菜在铝胁迫条件下内参基因的稳定性,在受到主要铝毒害的根组织内发掘新内参基因,以甘蓝型油菜耐铝品种赣油杂7号和铝敏感品种蓉油18的苗期根组织为研究材料,对营养液培养的试验材料分别设置对照组(0 h)和2个时间梯度(3,24 h)的铝胁迫(100μmol/L AlCl_(3),pH值4.5)处理组。首先,采用有参考基因组的转录组测序技术(RNA-seq)及FPKM值差异基因表达分析,筛选出符合持家基因特征的5个候选内参基因(Actin7、ARFA1E、SAP5、UXS3、UBC9)。随后,依次进行实时荧光相对定量PCR分析,扩增曲线和熔解曲线分析,LinRegPCR扩增效率分析,geNorm、NormFinder和BestKeeper基因表达稳定性分析,REST 2009相对表达量分析等分析步骤。结果表明,新设计开发的5对候选内参基因引物特异性高。从转录组测序数据中筛选出的4个候选内参基因(Actin7、ARFA1E、SAP5、UXS3)的表达稳定性获得了验证。按表达稳定性的综合排名由高至低排序依次为UXS3、SAP5、ARFA1E、Actin7,其中最优组合为SAP5和UXS3。综上所述,本研究开发的候选内参基因引物特异性高,可以提高铝胁迫试验体系实时荧光相对定量PCR试验的准确性,新发掘的内参基因(Actin7、ARFA1E、SAP5、UXS3),可以作为铝胁迫试验体系实时荧光相对定量PCR试验的新内参基因。

PCV2与PPV共感染猪外周血单个核细胞对其细胞凋亡相关因子表达水平的影响

为分析猪圆环病毒2型(PCV2)与猪细小病毒(PPV)体外共感染对猪外周血单个核细胞(PBMC)细胞凋亡相关因子mRNA转录水平的影响,探讨PCV2和PPV共感染机制及宿主—病毒之间的作用关系,运用病毒滴度和相对荧光定量PCR技术,测定和分析PCV2和PPV感染PBMC后PCV2、PPV的病毒滴度含量及Bcl-2、FasL、p53、Caspase-8、PBR、TNF-α等的转录时相变化。结果表明:PCV2、PPV能够感染PBMC细胞,PCV2/PPV共感染中PCV2、PPV的含量分别在24h显著最高(P<0.001);PCV2、PPV单独感染和PCV2与PPV共感染PBMC后引起Bcl-2、FasL、p53、Caspase-8、PBR、TNF-αmRNA转录水平上升;在3h时PCV2/PPV共感染组PBR、P53mRNA转录水平显著高于PCV2、PPV单感染组(P<0.05),12h时PCV2/PPV共感染组FasLmRNA转录水平显著高于PCV2、PPV单感染组(P<0.05),24h时Bcl-2、Caspase-8mRNA转录水平显著高于PCV2、PPV单感染组(P<0.05),PCV2/PPV共感染组TNF-αmRNA转录水平显著高于PPV组(P<0.05),与PCV2组差异不显著。结论:PCV2与PPV共感染引起细胞凋亡相关因子mRNA转录水平上调,加速淋巴细胞凋亡,本试验为PCV2和PPV共感染机制研究提供了理论基础和试验依据。

甘蓝型油菜ADP-核糖基化因子基因全长cDNA克隆及表达分析

【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus L.)矮化突变体"NDF-1"和野生型近等基因系亲本"3529"中ADP-核糖基化因子(ADP-ribosylation factor,ARF)基因全长cDNA,分析矮化突变体中该基因在不同组织中的表达水平,探讨矮化突变体中该基因在甘蓝型油菜茎杆发育过程中的作用。【方法】采用SSH(suppression subtractive hybridization)、RACE(rapid-amplification of cDNA ends)和RT-PCR技术,克隆甘蓝型油菜矮化突变体"NDF-1"和野生型"3529"中的ARF基因的全长cDNA序列。分别采集甘蓝型油菜野生型和矮化突变型苗期子叶、薹期根、茎尖和真叶,采用相对定量PCR方法检测矮化突变体中该基因的表达。【结果】获得了甘蓝型油菜矮化突变体"NDF-1"和野生型"3529"的ARF基因的全长cDNA,分别命名为BnARF和BnARF-h。序列分析表明:这两个基因长度分别为837和802 bp,都含有546 bp的完整开放阅读框(ORF),编码181个氨基酸,与其它植物、动物和酵母的ARF基因有很高的相似性。BnARF基因在野生型和矮化突变体的根、子叶、茎尖和真叶中均有表达,其中在子叶中表达量最高,真叶中次之,根和茎尖中的表达量最少。同时BnARF在矮化突变体的根、子叶和茎尖中的表达量都显著低于野生型,但在真叶中表达量相近。【结论】克隆了甘蓝型油菜矮化突变体"NDF-1"和野生型"3529"中ADP-核糖基化因子基因的全长cDNA,这两个ARF基因的序列上有两处碱基存在差异,其中一处是错义突变,推测这一突变可能与植株矮化有关。而BnARF基因在野生型和矮化突变体的根、子叶和茎尖的表达存在显著性差异,可能参与了甘蓝型油菜的矮秆发育过程。

鸳鸯鸭恒定链两异构体组织转录模式研究

为探索鸳鸯鸭恒定链(MDIi)两种异构体MDIi-1和MDIi-2在不同组织或器官中的转录模式,建立了检测MDIi-1和MDIi-2组织转录的实时相对定量PCR方法,检测并分析了MDIi-1和MDIi-2在不同组织或器官中的转录特点。结果显示MDIi-1在法氏囊底部的转录水平为各组织或器官中最低(设为校正器);和校正器比较,MDIi-1在脾和小肠黏膜呈最高水平转录,而法氏囊颈部、肝、肾、胸腺和血液也呈较高水平转录,其他器官均低水平转录;MDIi-2在脾、法氏囊颈部和小肠黏膜也呈超过校正器的高水平转录,胸腺、肺和肾的转录水平仅略低于校正器,其他组织或器官转录水平都远低于校正器,呈极低水平转录。同一组织或器官中MDIi-1转录水平远高于MDIi-2,但MDIi-1和MDIi-2在所有被检组织或器官中转录具有很高的相关性,相关性系数达0.850 7。MDIi-1和MDIi-2共转录于所有被检组织或器官中,每一组织或器官中MDIi-1是主要转录形式,在所有被检组织或器官中两异构体均高转录于具有免疫防御功能的器官或组织,MDIi-1和MDIi-2差异性转录的试验结果为后续两异构体功能机制和基于MDIi的基因疫苗研究提供了基础资料。

胃癌患者外周血单个核细胞HLA基因表达研究

目的探讨胃癌患者外周血单个核细胞(PBMC)HLA-A、HLA-B、HLA-DP、HLA-DR、HLA-G基因的表达水平及对胃癌的临床应用价值。方法设计HLA-A、HLA-B、HLA-DP、HLA-DR、HLA-G基因引物和实时荧光PCR相对定量法反应体系,在ABI7500实时荧光定量PCR仪上检测43例胃癌患者和22例健康人PBMC内基因表达水平并分析其差异。结果(1)胃癌患者HLA-A、HLA-B、HLA-DP、HLA-DR、HLA-G的mRNA相对表达量分别为0.71±0.26、0.61±0.37、0.91±0.33、0.90±0.38、0.77±0.27。健康组分别为1.23±0.60、1.17±0.60、1.07±0.68、1.12±0.55、0.98±0.37。与健康组相比,胃癌患者HLA-A、HLA-B、HLA-G表达水平降低,差异有统计学意义。HLA-DP和HLA-DR则无明显差异。(2)在不同分化的胃癌患者中,HLA-A、HLA-B、HLA-DP、HLA-DR和HLA-G的mRNA表达水平无明显差异。胃癌Ⅰ期+Ⅱ期的HLA-G表达水平高于Ⅲ期+Ⅳ期,差异有统计学意义。不同分期的HLA-A和HLA-B的表达水平无明显差异。结论胃癌患者PBMC的HLA-A、HLA-B、HLA-G的基因表达水平下调且HLA-G不同分期间存在差异。检测PBMC的HLA-A、HLA-B、HLA-G基因表达水平有助于胃癌的诊断和研究。

肝癌患者血清端粒酶逆转录酶mRNA表达研究

【目的】探讨肝癌患者血清端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)mRNA表达水平及对肝癌的临床应用价值。【方法】设计人端粒酶逆转录酶基因引物和实时荧光PCR相对定量法反应体系,在ABI7500实时荧光PCR仪上检测45例肝癌患者,52例病毒性肝炎患者,29例肝硬化患者和58例健康人血清端粒酶逆转录酶mRNA表达水平并分析其差异。【结果】肝癌患者血清hTERT mRNA水平明显高于肝炎、肝硬化患者及健康人。肝癌患者血清hTERT mRNA相对表达量与肿瘤大小和分化等级及分期明显相关,与年龄、性别、以及肿瘤数量无明显关联。【结论】肝癌患者血清hTERT基因表达上调,其升高程度与肿瘤分化与进展相关,检测血清hTERT基因表达水平有助于肝癌的诊断和研究。

2型糖尿病患者外周血有核细胞糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）基因表达研究

目的探讨糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）基因在2型糖尿病患者和健康人外周血有核细胞中表达水平的差异性及其对2型糖尿病发生机制的研究价值。方法设计GSK-3β基因引物，实时荧光RT—PCR相对定量法检测40例2型糖尿病患者和40例健康人PBMC内基因表达水平并分析其差异。结果2型糖尿病患者组GSK-3β的mRNA相对表达量为0．94±0．34，健康组为0．92±0．19，两者比较差异无明显统计学意义（P〉o．05）。结论在2型糖尿病患者外周血有核细胞中GSK-3β的基因相对表达量与健康人相比无明显差异。该结果尚待进一步通过联合检测和扩大样本量来确认。

淋巴瘤患者外周血单个核细胞FOXp3与HLA-B基因表达研究

目的探讨淋巴瘤患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)FOXp3与人白细胞抗原B(human leukocyte antigen,HLA-B),的基因表达水平及对淋巴瘤的临床应用价值。方法设计FOXp3和HLA-B基因引物和实时荧光PCR相对定量法反应体系,在实时荧光定量PCR仪上检测69例淋巴瘤患者和30例健康人外周血单个核细胞内基因表达水平并分析其差异。结果淋巴瘤患者FOXp3和HLA-B的mRNA相对表达量分别为1.46±0.45和0.74±0.22,健康组分别为1.15±0.30和1.05±0.28,两组差异均有统计学意义。在淋巴瘤患者组中,Ⅰ期+Ⅱ期的HLA-B相对表达量高于Ⅲ期+Ⅳ期,差异有统计学意义,而FOXp3未见区别。结论淋巴瘤患者外周血单个核细胞的FOXp3基因表达水平上调,HLA-B的基因表达水平下调且HLA-B不同分期间存在差异。检测PBMC的FOXp3、HLA-B基因表达水平有助于淋巴瘤诊断和研究。

淋巴瘤患者外周血单个核细胞FOXp3与HLA-B基因表达研究

目的探讨淋巴瘤患者外周血单个核细胞（PBMC）FOXp3与HLA—B的基因表达水平及对淋巴瘤的临床应用价值。方法设计FOXp3和HLA—B基因引物和实时荧光PCR相对定量法反应体系，在AP17500实时荧光定量PCR仪上检测69例淋巴瘤患者和30例健康人外周血单个核细胞内基因表达水平并分析其差异。结果（1）淋巴瘤患者FOXp3和HLA—B的mRNA相对表达量分别为1．46±0．45和0．74±0．22，健康组分别为1．15±0．30和1．05±0．28，与健康组相比，淋巴瘤患者外周血PBMC的FOXp3表达水平高于正常人，而HLA—B低于正常人，差异均有统计学意义。（2）在淋巴瘤患者组中，Ⅰ期＋Ⅱ期的HLA—B相对表达量高于Ⅲ期＋Ⅳ期，差异有统计学意义，而FOXp3未见明显区别。结论淋巴瘤患者外周血单个核细胞的FOXp3基因表达水平上调，HLA—B的基因表达水平下调且HLA—B不同分期间存在差异。检测PBMC的FOXp3，HIA—B基因表达水平有助于淋巴瘤诊断和研究。

重瓣山茶花器官发育相关基因CjAPL1的全长克隆与表达分析

为研究A功能基因在山茶花重瓣形成过程中所发挥的功能,利用同源克隆和RACE扩增方法,从重瓣山茶花品种‘金盘荔枝’发育早期的花芽中获得了山茶花AP基因全长cDNA,命名为CjAPL1,GenBank登录号JX657332。该基因全长1 149 bp,其中,开放阅读框(ORF)长度为741 bp,5’非编码区长度206 bp,3’非编码区长度202 bp。经氨基酸序列分析表明:CjAPL1基因编码一条含有246个氨基酸的蛋白质,与猕猴桃、八仙花等植物的Ap1蛋白同源性均在75%以上。Rea-time PCR结果显示,CjAPL1基因在‘金盘荔枝’不同发育时期花芽中的表达量为:花芽发育早III期>花芽发育早II期>花芽发育早I期>现蕾期,表达趋势表现为先逐渐升高而后急剧降低;花器官不同部位中的表达量为花柱最高,其次为子房和萼片,在雄蕊下部和外轮花上部中的表达量最低。这些差异表明,CjAPL1基因可能在‘金盘荔枝’重瓣花形成中发挥作用。

越橘查耳酮合酶基因的克隆及表达分析

为研究越橘花色素苷合成的分子机制,利用RT-PCR和RACE技术从越橘(Vaccinium spp.)果实中克隆了查耳酮合酶基因(CHS)的全长cDNA,命名为VcCHS,GenBank登录号为JN654702。VcCHS全长1 438 bp,包含107 bp的5'非编码区、71 bp的3'非编码区和1个长度为1 260 bp编码419个氨基酸的开放阅读框。该基因编码的蛋白具有CHS家族普遍存在的功能活性位点:Cys(C)164、His(H)303、Asn(N)336和特征多肽序列(RLM-MYQQGCFAGGTVLR)。多重比对分析发现越橘VcCHS基因编码的氨基酸序列与葡萄(Vitis vinifera)CHS基因编码的氨基酸序列相似性达90.2%。系统进化分析表明,该序列与杜鹃花目的植物聚为一类。VcCHS基因在果实发育的整个过程均有不同程度的转录表达,花期和果实成熟期表达量较高,绿果期表达量最低。VcCHS相对表达量变化与花色素苷相对含量的变化趋势具有一致性,并均在果皮组织中达到最高。

ORFV感染羔羊后的组织定位及其病毒载量分析

【目的】研究山羊传染性脓疱病毒的组织定位及病毒载量情况。【方法】选取健康断奶羔羊,通过口唇部和尾根部划线的方法接种山羊传染性脓疱病毒液,正常饲喂,观察记录其发病情况,待出现典型临床症状时,放血处死,采集不同组织,进行羊传染性脓疱常规PCR检测,并对阳性组织进行免疫组织化学分析;同时,利用F1L基因片段与GAPDH内参基因建立相对荧光定量PCR检测方法,测定分析阳性组织的病毒载量;制备病毒载量较高的组织病毒悬液,分析其在OFTu中的增殖情况。【结果】断奶羔羊在攻毒后10 d出现典型疱疹症状;唇部、上颚、鼻甲骨、颈前淋巴结、肠系膜淋巴结和尾根部组织经过PCR鉴定后,均扩增出大小为1023 bp的目的条带;病毒载量结果表明,山羊传染性脓疱病毒在鼻甲骨中的含量最高,其更易在鼻甲骨细胞中增殖。【结论】首次明确了山羊传染性脓疱病毒可在在患病羔羊的多个组织中定殖,且其在鼻甲骨中含量最高,为山羊传染性脓疱疫苗候选毒株的分离纯化及其致病机制的深入研究提供数据支撑。

CMAH基因在小鼠不同组织中的转录水平分析

目的哺乳动物细胞中所含唾液酸及其衍生物主要包括N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)和脱氨神经氨酸(deaminoneuraminic acid,KDN),其中Neu5Ac可在胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase,CMAH)的催化下合成Neu5Gc。本研究应用相对荧光定量PCR方法检测BALB/c小鼠不同组织中CMAH基因的转录水平,为进一步分析不同组织中所含Neu5Gc含量差异提供参考依据。方法在NCBI数据库中查找CMAH基因mRNA序列并设计特异引物,选择小鼠β-actin为内参基因,应用相对荧光定量PCR方法检测正常BALB/c小鼠9种组织中CMAH基因mRNA的转录情况。结果在9种不同的小鼠组织中,肝脏组织中CMAH基因mRNA转录水平最高,其分别为脾脏的2.46倍、肾脏的3.17倍、气管的5.14倍、肺脏的11.70倍、心肌的21.12倍、骨骼肌的31.37倍、小肠的66.90倍以及脑组织的1055.99倍。结论本研究确定BALB/c小鼠CMAH基因在多种组织中均有转录且差异较大。