石蜡包埋组织Real-time PCR检测技术在侵袭性曲霉菌病诊断中的应用价值

目的:探讨石蜡包埋组织实时聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测技术诊断侵袭性曲霉菌病(IA)的应用价值。方法:回顾性分析2021年1月—2023年12月山东省公共卫生临床中心经病理诊断IA患者200例,对其住院期间的石蜡包埋组织进行Real-time PCR检测,查阅半乳甘露聚糖(GM)试验结果,绘制Real-time PCR的受试者工作特征(ROC)曲线,计算ROC曲线下面积,制定最佳临界值,计算不同PCR和GM诊断条件下的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。结果:石蜡包埋组织Real-time PCR检测结果的敏感度为98.0%,特异度为100.0%,血清GM试验结果显示,敏感度为72.5%,特异度为94.0%;Real-time PCR检测用于IA诊断烟曲霉菌效能最好,其ROC曲线下面积为0.890(P=0.039),当荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)循环数值为34.30时,敏感度(89.0%)和特异度(92.0%)为最佳值。结论:石蜡包埋组织Real-time PCR检测技术对IA具有较高的诊断价值,其敏感度和特异度均高于GM试验。

基于石蜡包埋组织比较荧光PCR方法和抗酸染色法对结核分枝杆菌的检出率

结核病(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是由结核杆菌感染引起的慢性传染病,在新型冠状病毒感染(COVID-19)流行之前,结核病是单一传染病媒介死亡的主要原因,排名高于艾滋病。我国结核病人数较多,同时呈现高度耐药[1],结核病防治难度极大,因此早期准确诊断结核是治疗及控制结核的关键。本研究通过荧光PCR、抗酸染色对结核分枝杆菌检出率的比较,探讨抗酸及PCR在临床病理诊断中的差异及应用价值。

甲醛固定石蜡包埋组织4种DNA提取方法的比较分析

本研究以10例甲醛固定石蜡包埋组织(FFPET)作为疑难检材,将其制成蜡膜,分别以二甲苯-Chelex100法、脱蜡液-Chelex100法、脱蜡液-Vazyme FastPure FFPE DNA Isolation试剂盒(简称FP试剂盒)、脱蜡液-北京天根石蜡包埋组织基因组提取试剂盒法(简称天根试剂盒)提取DNA,进行紫外分光光度计测定(浓度、纯度)及短串联重复序列(STR)分型检测(23个常染色体),通过比较分析FFPET在4种不同提取方法中的提取质量、STR分型质量和检出率,从而寻求一种高效简便、经济实用、方便快捷的甲醛固定石蜡包埋组织中DNA提取方法。结果表明:应用4种方法提取的石蜡包埋组织蜡膜DNA经紫外分光光度计测定后显示,应用2种Chelex100法提取的DNA浓度高于2款试剂盒,试剂盒提取的DNA的纯度优于另外2种方法,以上差异均具有统计学意义(P<0.05);FP试剂盒提取DNA的平均浓度和纯度均优于天根试剂盒,无显著性差异(P>0.05);STR分型普遍存在不同基因座和同一基因座不同等位基因之间的扩增不均衡,呈现前高后低状态;STR平均检出率为FP试剂盒>天根试剂盒>Chelex100法,2种Chelex100法STR基因座检出率比较无显著差异(P>0.05),但分别和另外2种方法试剂盒方法相比有显著差异(P<0.05),FP试剂盒和天根试剂盒法相比有显著差异(P<0.05)。因此,在涉及甲醛固定石蜡包埋组织这类疑难检材的法医DNA鉴定案件时,脱蜡液-Vazyme FastPure FFPE DNA Isolation试剂盒法优于其余3种提取DNA方法。

普通甲醛固定石蜡包埋组织DNA提取方法的探讨

背景与目的:在国内,几乎所有的医院和科研机构均应用普通甲醛固定手术标本,但因为普通甲醛固定石蜡包埋组织中的DNA降解相对严重,从这些蜡块中提取高质量的DNA非常困难。本研究的目的是寻找从普通甲醛固定石蜡包埋组织中提取DNA的理想方法。方法:取我院2000年甲醛固定石蜡包埋的手术切除食管癌标本15例,分别以蛋白酶K消化和不同pH值下加热两种裂解方法裂解细胞,以酚氯仿抽提法提取其DNA;并在蛋白酶K消化法进行DNA提取的过程中,应用交叉设计对二戊烯或二甲苯脱蜡、37℃或56℃消化48h或72h、氯化钠盐析或酚氯仿抽提4种参数进行研究,所得DNA质量以电泳分析和PCR扩增结果判断。结果:蛋白酶K消化酚氯仿抽提法所得DNA产量(平均值为17.88μg)和质量均高于pH值为7～12条件下的加热提取法(P<0.05)。56℃消化所得的DNA质量明显优于37℃,而消化72h的DNA亦明显优于48h者。不同脱蜡方法和抽提方法对DNA的产量和质量影响不大,结论:以蛋白酶K消化氯化钠盐析法,从普通甲醛固定石蜡包埋组织中提取DNA质量较可靠。并且,应用蛋白酶K于56℃消化3天更能获得高质量和高产量的DNA。

肺癌石蜡包埋组织及新鲜标本组织芯片制备方法学探讨

目的 :探讨和建立石蜡包埋组织和新鲜冷冻标本制备组织芯片的方法 ,以及在基因表达分析中的应用。方法 :选取肺癌石蜡包埋组织 90例 ,新鲜液氮冻存肺癌及癌旁肺组织 2 0例 ,常规切片HE染色下确定穿刺部位 ,石蜡包埋组织芯片制作按Kononem等方法 (1998) ,每例穿取 0 6mm组织柱 2条 ,制备 180点阵组织芯片 ;而新鲜组织芯片参考Fejzo等方法 (2 0 0 1) ,并略作改良 ,制备 5 0点阵组织芯片。所有组织芯片模块 ,经 4 μm切片、常规组织学染色和免疫组化染色 ,以评价其在形态学及基因表达分析中应用的可行性。结果 :180点阵石蜡包埋肺癌组织芯片 ,组织排列整齐 ,HE染色后组织形态可观察率在 98%以上 ;p5 3、c myc、bcl 2、bax和Ki 6 7等免疫组化染色后 ,肺癌组织可见不同程度的抗原表达 ,组织点阵的形态可观测率在 89%～ 95 %之间。新鲜组织芯片经HE染色后 ,形态可观测率和基因表达可分析率在 70 %左右。结论 :手工法组织芯片制备简便易行 ,使用组织少 ,不破坏原蜡块 ;实验均一性、可比性好 ,且节省试剂。与常规组织切片相比 ,2点 0 6mm组织可以获得原蜡块 95 %以上的信息 ,完全可以用于组织形态学和蛋白水平上的基因表达分析 ;新鲜组织芯片技术已经初步建立 ,但尚有待于进一步完善制备技术和mRNA分析方法。

荧光定量PCR技术检测石蜡包埋组织结核杆菌DNA的应用评价

目的探讨荧光定量PCR(FQ-PCR)技术检测石蜡包埋组织结核分枝杆菌DNA(TB-DNA)在结核病诊断中的应用价值。方法 233例石蜡包埋组织标本采用实时FQ-PCR技术检测TB-DNA,同时进行抗酸染色和组织病理学检查,以临床诊断结果为金标准,分别计算TB-DNA、抗酸染色和病理学检查的灵敏度、特异性、准确度、阳性预测值和阴性预测值。结果 129例临床诊断为结核病的组织标本中,TB-DNA阳性107例,TB-DNA阴性22例;104例非结核病的标本中,TB-DNA阳性2例,TB-DNA阴性102例。TB-DNA检测的灵敏度、特异性、准确度、阳性预测值和阴性预测值分别为82.95%、98.08%、89.70%、98.17%、82.25%,均高于抗酸染色的63.57%、95.19%、77.68%、94.25%、67.80%和病理学检查的77.52%、96.15%、85.84%、96.15%、77.52%。结论 FQ-PCR技术检测石蜡包埋组织的TB-DNA用于各种结核病的诊断具有灵敏度高、特异性强的优点,与病理学检查相结合可以大大提高结核病的诊断率,适合于临床推广应用。

石蜡包埋组织中3种DNA提取方法的比较及优化

近年来，分子病理学技术迅速从科研发展到常规的病理诊断。目前常规检测包括：细菌病毒的检测、肿瘤相关基因的突变、靶向药物的分子检测等，

福尔马林固定石蜡包埋组织中DNA提取

由于甲醛介导的DNA损伤和石蜡对DNA提取的阻碍作用,使得常规DNA提取方法很难从福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPET)中获取高质量的DNA。近年来,众多学者的研究表明,通过改良预处理方法,优化蛋白酶K消化作用,简化DNA提取步骤,纯化DNA提取物等,可以有效提高FFPET中提取的DNA质量,为FFPET的DNA分析奠定了基础。

用套式RT-PCR技术检测石蜡包埋组织中的猪瘟病毒RNA

利用套式反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,对实验性感染猪瘟病毒猪的福尔马林固定石蜡包埋组织标本中的病毒RNA进行检测,将所扩增产物点样于尼龙膜上进行Dot-blotting鉴定,扩增结果与各器官的病理组织学变化进行了比较。从攻毒对照组猪的肝脏、脾脏、肾脏、淋巴结和扁桃体中检出了猪瘟病毒RNA,未从免疫攻毒猪只的脏器中检出猪瘟病毒RNA;所有扩增产物经Dot-blotting鉴定均得到了阳性信号;病毒基因的检出率与猪瘟病毒导致的病理组织学变化程度相一致。本试验成功建立了套式RT-PCR技术检测石蜡包埋组织中的猪瘟病毒RNA方法,为猪瘟病毒的诊断和回顾性分析提供了技术手段。

四种石蜡包埋组织DNA提取方法的比较

背景:由于在甲醛固定石蜡包埋组织的制作及保存过程中对DNA造成的损害,影响了后续的聚合酶链反应等研究。选择一种简便有效且经济实用的石蜡包埋组织DNA提取方法成为研究者们关注和亟待解决的问题。目的:比较甲醛固定石蜡包埋组织中4种提取DNA的方法对DNA质量的影响,探讨一种操作简便、污染少、经济实用的石蜡包埋组织中提取DNA的方法。方法:取手术切除的普通甲醛固定石蜡包埋的非小细胞肺癌组织标本20例,分别以二甲苯脱蜡-酚氯仿法、改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法、试剂盒法和改良TES水浴脱蜡-试剂盒抽提DNA法提取其DNA,然后进行电泳分析、紫外分光光度计测定A260/A280比值及PCR扩增。结果与结论:改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法和改良TES水浴脱蜡-试剂盒抽提DNA法可获得较大的DNA片段,且两种方法与试剂盒法所提取DNA的A260/A280值相比较,均有显著性意义(P<0.05),4种方法的提取效率差异无显著性意义(P>0.1),以改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法所得DNA为模板,扩增的目的条带亮度与阳性对照相当。结果证实改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法简便有效,所用试剂价格低廉,是一种经济实用的石蜡包埋组织DNA提取方法。

PCR-膜芯片检测石蜡包埋组织中结核杆菌耐药基因突变

目的探讨PCR-膜芯片技术检测石蜡包埋组织中结核杆菌耐药基因突变的可行性及其在临床病理中的应用价值。方法采集100例石蜡包埋的肺或淋巴结组织标本(临床诊断为结核患者80例,非结核患者20例),TB膜芯片检测标本中的结核杆菌IS6110基因,阳性者利用12对特异性引物进行多重PCR,扩增产物与含有59个探针的耐药-TB膜芯片反向点杂交检测结核杆菌耐药基因突变并测序验证。结果 TB膜芯片检测石蜡包埋组织标本中的结核杆菌IS6110基因,以临床诊断为标准时,灵敏度为52.5%(42/80),特异度为100%(20/20);以抗酸染色结果为标准时,灵敏度为90.5%(19/21),特异度为61.0%(36/59)。耐药-TB膜芯片检测石蜡包埋组织结核杆菌耐药基因突变,在42例结核杆菌IS6110基因阳性的标本中,检出INH基因突变2例,RFP或SM基因突变各1例,INH、RFP和EMB基因同时突变1例,与测序结果基本符合,提示上述5例可能为耐药结核病。结论应用PCR-膜芯片技术可提高石蜡包埋组织中结核杆菌基因的检出率,耐药-TB膜芯片检测结果可为耐药结核病的病理学诊断提供有价值的参考。

探讨两种石蜡包埋组织DNA提取方法

随着精准医学和个体化医学的快速发展，人们对分子检测的研究越来越广泛、越来越深入；寻找疾病的遗传学发病因素，对不同患者实施适于其病情的治疗及使用不同剂量的药物逐渐成为医学发展的方向。新鲜组织、石蜡包埋组织、外周血、胸腹水等样本中核酸的提取，是分子生物学的基本要求。由于患者病程及身体状况等原因，很多情况下短期内获取人体新鲜组织、胸腹水等标本较困难，

一种从石蜡包埋组织中快速提取DNA的方法

目的建立从甲醛固定石蜡包埋组织中高效、快速提取基因组DNA的方法。方法将一片10μm厚石蜡包埋大肠癌组织切片直接浸入150μl消化液中,56℃孵育0.5h、1h和2h,灭活蛋白酶K后离心取上清即为DNA提取物。琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的片段分布,紫外分光光度法测定DNA的产量及纯度。以提取的DNA为模板,PCR扩增不同长度产物片段并进行产物的直接测序以评价提取方法。结果该提取方法能够获得较长片段的基因组DNA,从一片10μm厚石蜡切片中即可获得大约60μg的DNA,在0.5h消化条件下获取的模板DNA,即可实现对152bp、293bp、392bp和541bp等4种不同片段的100%扩增,1h消化组的PCR产物可直接用于DNA测序。结论建立了一种简单、快速地从甲醛固定石蜡包埋组织中提取DNA的方法,只需一步消化即可获得满足普通PCR及测序需要的基因组DNA。

甲醛固定石蜡包埋组织中DNA的三种提取方法比较

为了寻找最佳的自普通 10 %甲醛固定石蜡包埋组织中提取DNA的方法 ,取我院 2 0 0 0年手术切除的 10 %甲醛固定石蜡包埋的食管癌标本 10例 ,分别以蛋白酶K消化酚氯仿抽提法 ,蛋白酶K消化氯化钠盐析法和不同pH值下加热提取法提取其DNA ,然后进行电泳和PCR扩增分析。结果显示 ,蛋白酶K消化酚氯仿抽提法 ,蛋白酶K消化氯化钠盐析法所得DNA产量和质量均高于不同pH值下加热提取法。从而认为蛋白酶K消化氯化钠盐析法简便快捷 ,不用接触有毒的化学药品 ,是理想的DNA提纯方法。

石蜡包埋组织中提取DNA应用于PCR反应影响因素的研究

目的 探讨石蜡包埋组织中提取DNA应用于PCR反应的影响因素。方法 应用从石蜡包埋组织中提取的DNA ,PCR反应扩增甲状腺髓样癌RET基因第 11外显子 ,分析石蜡包埋组织中提取DNA应用于PCR反应的影响因素。结果 10 .0 μm× 1组织切片组 ,PCR反应循环次数 4 0次组 ,PCR反应模板量 0 .0 5 μg组PCR反应取得高质量目的基因DNA。结论 减少提取组织用量有利于减少抑制PCR物质的量 ,有利于反应的成功 ;PCR反应循环次数一般应大于 4 0次 ;PCR反应时减少模板量有利于PCR反应成功。

不同方法提取石蜡包埋组织DNA的比较分析

目的:比较福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPET)中3种提取DNA的方法对DNA质量和回收率的影响,探讨一种高效、简便、实用的石蜡组织中DNA提取方法。方法:选取新疆医科大学第一附属医院2004～2007年手术切除的10%甲醛固定石蜡包埋甲状腺癌组织标本,分别以试剂盒法、改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法、改良TES水浴脱蜡-试剂盒法提取其DNA,然后进行电泳分析。结果:改良TES水浴脱蜡-酚氯仿提纯DNA法所得样本DNA的OD260/OD280比值为(1.82±0.15),改良TES水浴脱蜡-试剂盒提纯DNA法为(1.86±0.17),两者比较无明显差异(P>0.05);分别与试剂盒法(1.75±0.14)相比,差异有统计学意义(P<0.01)。改良TES水浴脱蜡-试剂盒提纯DNA法、改良TES水浴脱蜡-酚氯仿提纯DNA法所得DNA产量和质量均高于试剂盒法。结论:改良TES水浴脱蜡-试剂盒提纯法简单快捷,是较理想的石蜡包埋组织DNA提纯方法。

Triton X-100快速提取甲醛固定、石蜡包埋组织内DNA的方法

目的建立一种快速提取甲醛固定、石蜡包埋组织内DNA的方法。方法利用TritonX-100一步提取甲醛固定、石蜡包埋组织内DNA,并具体研究了不同浓度TritonX-100对提取后DNA-STR分型效果的影响。结果成功地一步提取出甲醛固定、石蜡包埋组织内DNA,浓度为1%的TritonX-100提取效果较好。结论利用TritonX-100提取甲醛固定、石蜡包埋组织内的DNA,为快速提取DNA提供了有效的途径,是法科学领域中一种值得推荐的方法。

PCR-反向杂交膜片技术检测石蜡包埋组织中的结核杆菌

[目的]探讨PCR-膜片RDB(recersedotblot)技术检测石蜡包埋组织中的结核杆菌的方法。[方法]合成检测结核杆菌的寡核苷酸探针并制作膜芯片,扩增结核分支杆菌插入序列IS6110基因片段,利用PCR-膜片RDB技术,检测12株结核分支杆菌临床分离株、2株大肠杆菌,120例结核病人及38例非结核病人石蜡包埋组织中结核杆菌。石蜡组织的膜片检测结果与抗酸染色法和PCR检测结果比较。[结果]12株扩增阳性的结核分支杆菌,膜片检测11株杂交阳性,2株大肠杆菌和阴性对照结果均为阴性。120例结核病人石蜡组织标本,抗酸染色,PCR和PCR-膜片RDB技术检测灵敏度分别为43.3%(52/120),76.7%(92/120)和87.5%(105/120),三者比较差异有统计学意义(P﹤0.01)。38例非结核病人石蜡组织标本,抗酸染色,PCR和PCR-膜片RDB技术检测特异度分别为100%(38/38),94.7%(36/38)和100%(38/38),三者比较差异无统计学意义(P﹥0.05)。[结论]PCR-膜片RDB技术有助于提高石蜡包埋组织中结核杆菌检出率。

石蜡包埋组织切片原位核酸杂交研究

目的 :探讨石蜡包埋组织切片的原位核酸杂交方法 ,以检测克山病 ( KSD)尸检心肌中的RNA。方法 :应用生物素标记的人工合成寡核苷酸探针 ,对 72例心肌石蜡包埋组织切片进行原位核酸杂交。结果 :各型克山病心肌石蜡组织切片的阳性杂交信号为 80 %～ 87.9% ,而正常对照仅为 14.3%。结论 :应用人工合成寡核苷酸之原位核酸杂交技术 ,对长期保存的石蜡组织进行回顾性研究是可行的。