亚硝酸细菌研究进展

从硝化细菌的生长特性 ,分类 ,检测 ,亚硝酸细菌氨单加氧酶等方面概要的叙述了国外在硝化细菌方面研究的进展 。

盐度对硝酸细菌活性的影响及动力学特性

为分析盐度对硝酸细菌(NOB)活性的影响及其动力学特性,本文采用高浓度亚硝态氮污水富集培养NOB.对NOB富集污泥进行荧光原位杂交技术(FISH)分析表明Nitrobacter占细菌总数的(81%±6%).污泥的最大比亚硝态氮氧化速率为(42.5±0.9)mgN/(gVSS·h).用此污泥考察了盐度对NOB活性的影响,并测定了盐度为10g/L时NOB的动力学参数(Ko、KS).结果表明,与盐度为0g/L时的NOB活性相比,盐度为15g/L时NOB活性降低了3.3%;盐度为10和20g/L时的NOB活性分别降低了11%.盐度为10g/L时,NOB的最大比亚硝态氮氧化速率为(37.9±0.7)mgN/(gVSS·h),氧的半饱和常数Ko值为(1.51±0.06)mg/L,底物(亚硝态氮)半饱和常数KS值为(6.06±0.15)mg/L,Ko、KS测定值均高于ASm^2模型中氨氧化细菌(AOB)推荐值.盐度对NOB的抑制降低了最大比亚硝态氮氧化速率,对氧传递和底物(亚硝态氮)传递均存在影响.

亚硝酸细菌amoA基因的克隆、测序与表达

采用PCR技术对亚硝酸细菌的特异性amoA基因进行克隆、测序 ,以确定其准确性 ;然后采用基因重组技术构建亚硝酸细菌的基因工程菌 ,并进行鉴定与功能初步评价 .结果表明 ,克隆得到的 4种亚硝酸细菌的amoA基因 ,与标准菌株Nitrosomonassp.GH2 2的amoA基因同源性达到 98%～ 99% ;构建了一种含有特异性amoA基因的大肠杆菌基因工程菌株 ,并采用直接比色法对重组细菌的氨氧化活性进行测定 ,发现基因工程菌的氧化氨氮速率明显高于分离的野生菌株 .研究表明 ,利用基因重组技术对亚硝酸细菌等自养菌进行改造 ,构建高效基因工程菌在水污染治理领域具有可行性 .图 6表 1参

异养型亚硝酸细菌固定化颗粒质量评价的研究

采用聚乙烯醇和海藻酸钠凝胶共包埋异养型亚硝酸细菌制备固定化颗粒,从物理性状和化学性能2个方面综合评价异养型亚硝酸细菌固定化颗粒的质量。物理性状主要指颗粒是否成球、胶体粘连状况、颗粒弹性、稳定性和传质性能等;化学性能指异养型亚硝酸细菌固定化颗粒对氨氮的去除能力。试验结果表明,通过优化制备颗粒的配方可改善固定化颗粒的物理性状;污水中添加碳源有利于提高固定化颗粒的除氮能力;在稳定处理期包埋2种活菌量的固定化颗粒去除氨氮效果差异不显著。此外,也发现固定化颗粒去除人工污水中氨氮的过程较为复杂,物理吸附、分子扩散和微生物硝化作用同时存在,其中微生物起主要作用。

人工快速渗滤系统中亚硝酸细菌的筛选及转化能力研究

从人工快速渗滤系统中分离出12株亚硝酸细菌,筛选出氨氮转化效率较高的6株菌Y11、Y14、Y22、Y32、Y41、Y52。结合细菌形态特征、生理特性和16SrDNA测序结果,可确定6株菌分别属于中华根瘤菌属(Sinorhizobiumsp.)、代尔夫特菌属(Diaphorobacter sp.)、剑菌属(Ensifer sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)。对上述细菌的氨氮转化效率进行了研究,结果发现Y11菌株氨氮转化速率为20.0mg/(L·d),Y32、Y41、Y52菌株氨氮转化速率为16.6mg/(L·d),Y14菌株氨氮转化速率为14.2mg/(L·d),Y22菌株氨氮转化速率为12.5mg/(L·d)。

环境样品中亚硝酸细菌amoA基因的克隆与测序

对从环境样品中分离的亚硝酸细菌(Ammonia oxidizingbacteria)amoA基因进行克隆与测序,为构建基因工程菌打下基础。采用亚硝酸细菌选择性培养基,从4个不同的畜牧养殖污水处理厂采集的样品(分别编号为1,2,3,4)在室温下富集培养2个月后,采取酚氯仿抽提的方法提取DNA。根据已报道的亚硝化单胞菌(Nitrosomonassp.)amoA基因序列,设计引物AMOB AMOE,并在AMOB,AMOE的5′-端分别加上了BamHⅠ和HindⅢ的限制性酶切位点,以利于进一步酶切和克隆。用AMOB AMOE对4种样品的DNA进行PCR扩增,PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果表明,4种样品中1号和3号样品扩增得到预期长度的DNA片段,2号和4号样品扩增没有得到预期片段。回收纯化PCR产物与pGEM-T载体连接,构建amoA基因测序载体,并转化E.coliM15。测序结果提交GenBank进行Blast分析。结果显示,扩增得到的DNA片段均与Nitrosomonassp.GH22的amoA基因有99 7%的同源性,可从环境中分离的亚硝酸细菌中克隆出amoA基因。

工业循环冷却水中硝酸细菌的测定方法

一种利用硝酸细菌生化反应对工业循环冷却水中硝酸细菌进行测定的方法，用适量的亚硝酸钠、碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、硫酸镁与蒸馏水配置成液体培养基；取冰醋酸50mL与900mL水混合，加入对氨基苯磺酸5．0g摇匀，加入盐酸萘乙二胺0．05g溶解，用水稀释到1000mL制成比色试剂液；

饮用水生物滤池中亚硝酸盐氧化细菌的生长规律

饮用水生物滤池工艺中亚硝酸盐氧化细菌的生长状况可以作为反应器挂膜是否成功的标志 ,其生长具有明显的阶段性 ,在经历了延迟期和对数期之后进入稳定期 ,由于氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌在生态学上存在以后者为受利方的偏利互生关系 ,延迟期后期与氨氧化细菌的对数期生长相对应 ,表现为表观去除率的“对数下降”期 .亚硝酸盐氧化细菌对数期生长的时间在 1mo左右 ;低温可以使其长期处于延迟期 .图 7表 3参

一株异养型亚硝酸盐氧化细菌的分离及其降解特性的研究

以亚硝酸盐和琥珀酸钠作为惟一氮、碳源从活性污泥中筛选分离一株能够高效氧化亚硝酸盐的硝化菌株,并对其形态学、生理生化及16S rDNA同源性进行分析,在此基础上研究pH、温度、转速、初始亚硝基氮的浓度以及盐浓度对其氧化亚硝酸盐的影响。结果显示,在好氧条件下,该菌株能在12 h内将356.004 mg/L亚硝酸盐降解99.53%。根据形态学特征、生理生化特性以及16S rRNA同源性分析,初步将该菌株鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri),并将其命名为LYS-86。该菌株氧化亚硝酸盐的最适pH8.0-10.0,温度30℃,转速180 r/min,盐浓度1 g/L。当培养基中初始亚硝酸盐浓度为0.5 g/L时,菌株LYS-86的硝化活性最高,随着培养基中初始亚硝基氮浓度的不断提高,菌株LYS-86的硝化活性会不断下降。本研究利用硝化细菌选择性培养基从活性污泥中筛选到了一株异养型亚硝酸氧化菌菌株,该菌株具有高效的硝化活性,为今后该菌株的实际应用及理论研究奠定了基础。

高硝化活性亚硝酸盐氧化细菌的培养和应用研究

针对本实验室筛选得到的一株亚硝酸盐氧化细菌（nitrite—oxidizing bacteria），研究了在28℃～30℃、摇床转速为110r／min时．pH、氮源、碳源、NaCl、有机物对菌体生长的影响。结果表明，培养基pH8．0～8．5、NaNO2含量4，500mg／L、Na2CO3含量1．5g／L、NaCl含量0～0．5％、葡萄糖含量0～0．1％时，亚硝酸盐氧化细菌生长良好，培养9d时，细菌浓度可达4．6×10^9MPN／mL，且培养基中的NO2^--N能全部被硝化为NO3^--N。培养基中NaCl含量大于0．5％、葡萄糖含量大于0．1％时，亚硝酸盐氧化细菌对氮源的利用受到抑制。亚硝酸盐氧化细菌降解淡水养殖池塘中的NO2^--N试验表明，在水温25℃、pH8．6的池塘中，NO2^--N从菌体投放后的第3d开始下降，18d后NO2^--N由1．47mol／L下降至0．49mol／L。

亚硝酸盐氧化细菌固定化方法的优化研究

对亚硝酸盐氧化细菌的包埋固定化及其应用进行了研究。选用聚乙烯醇(PVA)和海藻酸钠(SA)混合物作为包埋载体,试验发现混合载体中聚乙烯醇(PVA)和海藻酸钠(SA)的含量、包埋菌液浓度和交联时间对固定化效果有重要影响。利用正交试验对这4个因素进行优化,得到最佳包埋条件为:聚乙烯醇8%、海藻酸钠1%、包埋菌液浓度26g/L、固定化小球交联时间16h。对影响固定化菌降解亚硝酸盐氮的因素进行了研究,发现固定化菌的适宜降解条件为:温度30℃、pH7.0及DO≥2.0mg/L。将固定化菌用于养殖水亚硝酸盐氮降解,10d内将亚硝酸盐氮从1.210mg/L降至0.041mg/L,具有稳定、持续降解的特点。

亚硝酸细菌含量的检测

通过稀释、接种和培养实验．测定工业循环冷却水及其它水体中亚硝酸细菌的含量的一种方法。

海水亚硝酸氧化细菌初始富集过程中硝酸盐的定性检测

本文对海水亚硝酸氧化细菌初始富集过程中硝酸盐的定性检测方法及其适用范围进行了研究。结果表明, 在NaNO2起始浓度为100mg/L的亚硝酸氧化细菌初始富集培养系统中,1mL培养液中残余的NaNO2,可先用 1．0mol/L盐酸溶液20μL和50g/L氨基磺酸铵溶液10-20μL将其去除,然后再用二苯胺试剂对培养液中经亚硝酸 氯化细菌转化来的NaNO3进行定性检测,可检测出的NaNO3浓度下限在20mg/L左右。在NaNO2起始浓度不同的 富集培养系统中,去除NaNO2所需盐酸溶液、氨基磺酸铵溶液的量可根据其起始浓度按比例相应增减,但NaNO2的 起始浓度不宜超过200mg/L。该方法亦适用于淡水亚硝酸氧化细菌初始富集培养过程中硝酸盐的定性检测。

设施连作枯萎病黄瓜根际亚硝酸盐氧化细菌群落特征

集约化设施黄瓜连作导致枯萎病高发,但根际功能微生物在其中扮演的角色尚不十分清楚。本研究以设施连作黄瓜为供试对象,通过采集枯萎病植株和健康植株根际土壤样品,采用实时荧光定量PCR和高通量扩增子测序技术,分析病株和健株根际间两种亚硝酸盐氧化微生物——硝化杆菌(Nitrobacter)和硝化螺菌(Nitrospira)丰度和群落多样性及结构差异。结果表明:病株根际亚硝态氮含量和Nitrospira丰度与健株无差异,但亚硝酸盐氧化潜势和Nitrobacter丰度更高(P<0.05)。Nitrobacter和Nitrospira群落多样性在病株和健株根际间均无显著差异,但群落结构显著不同。具体来看,病株根际Nitrobacter Cluster 6、Nitrobacter Cluster 5和Namibia soil Cluster 1平均相对丰度显著高于健株(P<0.05),但Nitrobacter Cluster 2b和Nitrospira lineageⅡ平均相对丰度低于健株。亚硝酸盐氧化潜势与Nitrobacter丰度和Nitrobacter Cluster 6平均相对丰度均显著正相关(P<0.05)。冗余分析表明,亚硝态氮含量是影响Nitrobacter和Nitrospira群落结构最重要的土壤理化因子。本研究表明,设施连作黄瓜枯萎病的发生导致了植株根际亚硝酸盐氧化细菌群落结构变化,功能微生物群落及其活性的恢复应是设施连作病害土壤改良的重要方面。

硝化细菌应用于人工湿地生态系统的研究

将亚硝酸细菌和硝酸细菌混合固定于人工湿地系统中,进行了氨氮去除的试验研究。在湿地系统进入稳定运行阶段时,可以观察到系统对于氨氮的去除率稳定在70%左右。同时系统对COD也有着较高的去除率,基本实现了同一系统中的有机物和氨氮的共同去除。

n-damo细菌在不同生态环境中的遗传多样性和潜在功能研究

反硝化厌氧甲烷氧化(DAMO)是自然环境中减少甲烷排放的关键过程。近年来研究发现,亚硝酸盐依赖型厌氧甲烷氧化(n-damo)细菌在湖泊、河流、稻田和生物反应器等环境中表现出不同的分布特征和群落格局。然而,以往的环境调研主要集中在单一生态环境或样本类型,使得n-damo细菌在全球生态格局中的总体作用和分布特征仍然存在一定的未知。此外,在描述不同生态环境中n-damo细菌多样性时,16S rRNA和pmoA基因之间的具体区别或偏好性尚不清楚。因此,为了填补这一研究空白,基于n-damo细菌的两个关键基因,即16S rRNA和pmo A,通过生物信息学分析来评估不同生态系统中n-damo细菌的多样性特征。研究发现,16Sr RNA和pmoA基因所揭示的n-damo细菌遗传多样性和潜在功能存在差异。保守性更高的16S r RNA基因在湿地环境中多样性最高,而在人工富集环境中多样性最低。pmo A基因则在淡水环境中表现出最高的多样性,但也同样在人工富集环境中表现出最低的多样性。热图和韦恩图显示,淡水环境和湿地环境中n-damo细菌的相似性最高,但人工富集和咸水环境下的n-damo细菌与其他环境差异显著。此外,系统发育分析显示,16S rRNA与pmoA基因具有不同的同源模式,16S r RNA因其保守性而具有较高的同源性,而pmo A基因则表现出更多的簇族分化。这些结果为了解DAMO微生物对不同生态系统中甲烷减排和碳氮生物地球化学循环的贡献提供了重要见解。此外,未来n-damo细菌的环境调研工作应同时分析16S rRNA和pmo A基因,从而对n-damo细菌的分布和功能进行更加科学地综合评价。

对BAF预处理低温水源水系统中硝化细菌的识别

生物处理工艺是解决水源水氨氮污染问题的主要途径,但其功能菌属硝化细菌在工艺系统中受诸多因素影响,尤其在低温期生物活性下降,因此识别适应低温水环境的硝化细菌,有利于为其构筑最适生长环境,进而提升工艺降解氨氮的效果。以前期构建的悬浮填料-沸石曝气生物滤池为基础,研究了经长期低温驯化后,适应低温水环境的菌种及其演替。研究表明,对曝气生物滤池系统中的硝化细菌按属、种进行分类,主要的氨氧化细菌菌属是Nitrosomonas,优势菌种为Nitrosomonas uncultured ammonia-oxidizing bacterium。就亚硝酸盐氧化细菌而言,主要的菌属为Nitrospiraceae Nitrospira和Candidatus Nitrotoga,其中Nitrospiraceae Nitrospira为硝化系统中常见菌属,Candidatus Nitrotoga是新型的、可以功能性替代Nitrospira的菌属,更适在低温环境下生长;进一步将硝化细菌按种进行分类发现,系统中亚硝酸盐氧化细菌的优势菌种为Nitrospiraunculturedbacterium、Nitrospira uncultured soil bacterium、Nitrospira sp.、Candidatus Nitrospira defluvii和Candidatus Nitrotoga uncultured bacterium。

一株亚硝酸盐降解菌的分离鉴定

为寻找对亚硝酸盐具有高效降解能力、稳定和安全的优良菌株,采用亚硝酸盐氧化细菌(Nitrite-oxidizing bacteria,NOB)富集、分离技术从湖州某水域淤泥中分离得到一株纯培养菌株N3。提取细菌的总DNA,利用细菌16S rDNA特异性引物进行多聚酶链反应(PCR)扩增;扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和Sanger末端终止法测序分析,用NCBI-Blast软件将测序结果在Genbank等数据库中进行同源性检索。结果表明,N3的DNA扩增产物片断大小为1441bp,测序结果经检索证实N3与标准菌株Cellulosimicrobium cellulans(AY665978.1)16S rDNA保守性片段有100%的同源性,可以判定所分离得到的N3菌株为纤维单胞菌属的纤维化纤维单胞菌(Cellulosimicrobium cellulans)。

牙鲆海水循环养殖系统生物膜上3种细菌的数量与代谢活性

从牙鲆(Paralichthysolivaceus)海水循环养殖系统中移动床生物滤器载体生物膜上获取异养细菌、氨化细菌和硝化细菌样本。异养细菌用平板涂布法计数,其代谢活性以培养8h的氧吸收速率表示。氨化细菌、氨氧化细菌(AOB)和亚硝酸氧化细菌(NOB)用MPN法计数,其代谢活性分别以培养24hNH4+-N浓度的增加、NH4+-N浓度的减少和NO2--N浓度的减少表示。结果表明,生物膜成熟之后,4种生理类群细菌的数量和代谢活性基本保持稳定。异养细菌数量为107～108CFU-·-m-2(载体),氨化细菌、AOB和NOB数量分别为107～108MPN-·-m-2(载体)、105～106MPN-·-m-2(载体)和105～106MPN-·-m-2(载体)。分批培养测得异养细菌的氧吸收速率、氨化细菌的氨化速率、AOB的氨氧化速率和NOB的亚硝酸氧化速率分别是0.591～0.738g(O2)-·-m-2-·-d-1、0.081～0.135g(NH4+-N)-·-m-2-·-d-1、0.017～0.031g(NH4+-N)-·-m-2-·-d-1和0.020～0.038g(NO2--N)-·-m-2-·-d-1。异养细菌的氧吸收速率、氨化细菌的氨化速率和AOB的氨氧化速率与异养细菌、氨化细菌和AOB的数量呈正相关。移动床生物滤器生物膜的平均氨和亚硝酸盐去除速率为(0.121±0.076)g(NH4+-N)-·-m-2-·-d-1和(0.139±0.181)g(NO2--N)·-m-2-·-d-1。同时测定了底物浓度和pH对氨化细菌、AOB和NOB代谢活性的影响。结果显示,氨化细菌的氨化速率、AOB的氨氧化速率和NOB的亚硝酸氧化速率与底物浓度(蛋白胨、NH4+-N和NO2--N)呈线性相关,pH为8.0时3种生理类群细菌的代谢活性较pH6.5或pH9.5时高。