血清学标志物甲胎蛋白、PIVKA-Ⅱ和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3联合诊断肝癌的meta分析

目的:探讨血清生物标志物甲胎蛋白(AFP)、维生素K缺失或拮抗剂Ⅱ诱导的蛋白质(PIVKA-Ⅱ)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3)单独或联合用于肝细胞癌(以下简称肝癌)诊断的价值。方法:检索PubMed、Web of Science、Embase三个数据库,收集2002年以来发表的AFP、PIVKA-Ⅱ和GPC-3单独或联合用于诊断肝癌的文献。根据纳入和排除标准筛选文献并提取相关数据。利用诊断准确性研究的质量评价(QUADAS)检查表对纳入的文献进行质量评价,并采用Meta DiSc软件、Review Manager 5.4软件和Stata 15.1软件对AFP、PIVKA-Ⅱ和GPC-3单用和联合使用诊断肝癌的受试者工作特征曲线下面积(AUC)、敏感度、特异度等指标进行数据分析。结果:共纳入32篇文献。Meta分析结果显示,单个标志物用于诊断肝癌时,PIVKA-Ⅱ的AUC值最高,为0.88(95%CI:0.85~0.91),其次是GPC-3和AFP;多个标志物联合用于诊断肝癌的AUC均高于单个标志物,其中PIVKA-Ⅱ联合GPC-3诊断的AUC值最高,为0.90(95%CI:0.87~0.92)。单个标志物用于诊断肝癌时,PIVKA-Ⅱ和GPC-3的敏感度相对较高(分别为0.75和0.76),但GPC-3的特异度不如PIVKA-Ⅱ和AFP(AFP、PIVKA-Ⅱ和GPC-3分别为0.87、0.88和0.81);多个标志物联合用于诊断肝癌的敏感度较单个标志物诊断时有所提高,但特异度无明显提高。单个标志物用于诊断肝癌时,PIVKA-Ⅱ的诊断比值比(DOR)最高,为22(95%CI:13~36),其次是GPC-3和AFP;两个标志物联合用于诊断肝癌的DOR均高于单个标志物,其中AFP联合GPC-3诊断的DOR最高,为25(95%CI:9~67);三个标志物联合用于诊断肝癌时的DOR明显降低,为10(95%CI:7~45)。结论:单个标志物用于肝癌诊断时,PIVKA-Ⅱ的诊断价值更高。两种标志物联合能显著提高肝癌诊断的敏感度,三种标志物联合未能进一步提高诊断价值。结合临床实际,推荐AFP联合PIVKA-Ⅱ用于肝癌的诊断。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝穿刺活检标本中鉴别诊断的意义

目的:探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)在肝细胞癌(HCC)等不同肝病组织中的表达情况及其对肝癌早期诊断的意义.方法:采用免疫组织化学方法检测126例肝穿刺活检标本(包括13例极早期HCC、44例早期HCC、16例不典型增生、29例肝硬化和24例肝炎)及57例中晚期HCC手术标本中GPC3和甲胎蛋白(AFP)的表达,28例正常肝组织作对照.结果:GPC3在HCC与其他组织中的表达差异具有统计学意义(P<0.01).GPC3和AFP对HCC诊断的敏感性分别为80.7%和37.7%,特异性分别为99.4%和93.6%.在极早期和早期肝癌中,GPC3的阳性表达率,显著高于AFP(92.3%vs38.5%;72.7%vs34.1%,均P<0.05).GPC3在极早期和早期肝癌中的表达均高于高级别不典型增生组(P<0.01).在肝硬化、肝炎、正常肝组织中均未见GPC3和AFP蛋白表达.GPC3在小肝癌中的阳性率为78.6%,联合AFP可将诊断敏感性提高为85.7%.在血清AFP阴性的小肝癌中GPC3的阳性率高达70%.GPC3阳性表达患者肝癌根治术后1年、2年、3年的复发率明显高于GPC3阴性患者(P<0.05).结论:GPC3在极早期和早期HCC中具有良好的敏感性和特异性,有望成为新的肝癌早期诊断标志物,肝穿刺活检行GPC3染色是一个有效的肝癌早期鉴别诊断的辅助工具,同时也有助于预测HCC患者的预后.

AU结合因子1对肝细胞癌患者磷脂酰肌醇蛋白聚糖3水平的影响

目的探讨肝细胞癌(HCC)患者中AU结合因子1(AUF1)对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)表达的影响及其机制。方法TCGA-HCC基因表达数据下载自美国Bead研究所基因数据分析中心,最终纳入371例不同病因的HCC组织及50例癌旁组织;LCI-HCC基因表达数据下载自GSE14520,最终纳入214例有随访信息的乙型肝炎相关HCC患者。35例HCC及配对癌旁样本选取自2009年—2013年在河南省肿瘤医院接受常规根治性手术的HCC患者。采用免疫组化检测GPC3和AUF1蛋白在HCC中的表达及相关性;在HCC细胞系中敲减或者过表达AUF1后,采用Western Blot和实时荧光定量PCR检测GPC3表达;利用RNA结合蛋白免疫沉淀实验和RNA稳定性检测研究AUF1调控GPC3表达的机制。计量资料两组间比较采用t检验,计数资料两组间比较采用χ2检验,Kaplan-Meier方法应用于术后患者的生存分析,并使用log-rank检验进行生存率的比较。结果在TCGA和LCI数据库中,肝癌组织GPC3的表达均显著高于癌旁组织(P值均<0.05);TCGA数据库中,GPC3高表达与肝癌患者的不良预后有关(P<0.05)。免疫组化结果显示,GPC3和AUF1蛋白均在肝癌组织中呈高表达,阳性表达率分别为77.1%(27/35)和74.3%(26/35)。体外实验结果表明,在肝癌细胞系HepG2和Huh-7中敲减AUF1明显降低了GPC3表达(P值均<0.05),而过表达AUF1则上调GPC3表达(P<0.05)。AUF1蛋白可与GPC3 mRNA结合,敲减AUF1导致GPC3 mRNA稳定性降低。结论AUF1是调控GPC3基因转录后修饰的重要调节因子,AUF1和GPC3蛋白的异常高表达可能参与肝癌的发生和发展。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝细胞肝癌中的表达及意义

目的:探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)在肝细胞肝癌中的表达及临床意义。方法:利用免疫组织化学方法检测60例肝细胞肝癌及癌旁组织中GPC3及AFP的表达,评价GPC3在肝细胞肝癌诊断中的意义,并分析其与肿瘤临床病理特征的关系。结果:GPC3在肝细胞肝癌组织中高表达[75%(45/60)],明显高于AFP表达[35%(21/60)](P<0.005);而在距肿瘤不同距离的癌旁组织中未见表达。GPC3主要表达在肝癌细胞的细胞浆和细胞膜。根据阳性细胞比例及染色强弱,其表达模式可分为弥漫强阳性表达(27例)、弥漫弱阳性表达(8例)、局灶强阳性表达(2例)和局灶弱阳性表达(8例)。统计学分析表明GPC3在肝细胞肝癌组织中的表达与患者性别、年龄、血清AFP值、HBsAg定性、是否合并肝硬化及肿瘤大小、生长方式、分级、分期等临床病理特征无关。结论:GPC3更特异地广泛存在于肝细胞肝癌组织中,对比AFP的免疫组化结果,GPC3对肝细胞肝癌有更显著的敏感性及特异性,可能成为新的肝癌病理诊断标志物。

癌胚抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖3单克隆抗体的制备及应用

目的制备抗癌胚抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)单克隆抗体,并初步应用。方法利用PCR方法,将GPC3基因重组到原核表达载体pET16b中,在大肠杆菌中表达,纯化后的GPC3融合蛋白对Balb/c小鼠脾内包埋免疫,取小鼠脾细胞与Sp2/0细胞进行细胞融合,应用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)和Western blot法筛选及鉴定分泌特异性抗GPC3单克隆抗体的杂交瘤细胞株,间接免疫荧光检测肝癌细胞中GPC3表达。结果成功构建了GPC3原核表达载体,在大肠杆菌中的诱导表达重组GPC3蛋白。应用单克隆抗体杂交瘤技术成功制备1株稳定分泌抗GPC3单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过Western blot鉴定具有高度的特异性,间接免疫荧光实验显示单克隆抗体能与HepG2细胞内GPC3特异性结合。结论成功制备出特异性抗人GPC3单克隆抗体。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝细胞癌组织中的表达及临床意义

目的探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican-3，GPC3）在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）组织中的表达及临床意义。方法采用免疫组织化学法检测2011年6月～2015年3月期间的54例HCC组织、46例癌旁组织、22例肝硬化组织、12例正常肝组织中的GPC3表达情况，分析GPC3表达与临床和病理因素的相关性。结果正常肝组织中不表达GPC3蛋白，肝癌组织GPC3评分（7．39±3．64）和阳性率（81．48％）均显著高于癌旁组织（1．15±0．99，13．04％）、肝硬化组织（0．32±0．56，4．54％），差异有统计学意义（P〈0．05）；随着肝癌临床分期的增高，GPC3评分逐步升高，Ⅲ／Ⅳ期（10．05±3．59）与Ⅰ期（4．31±3．41）、Ⅱ期（7．14±3．63）比较，差异有统计学意义（P〈0．05），GPC3阳性率也升高（Ⅰ期69．23％，Ⅱ期81．81％，Ⅲ／Ⅳ期89．47％），但差异无统计学意义（P〉0．05）；肝癌组织GPC3阳性率与性别、年龄、血清HBsAg、甲胎蛋白（alpha—fetoprotein，AFP）、肿瘤直径、转移情况、临床分期无关（P〉0．05），与是否并发肝硬化相关（P〈0．05），GPC3高表达率与血清AFP、肿瘤直径、是否并发肝硬化、转移情况、临床分期均相关（P〈0．05）。结论GPC3在HCC的诊断方面具有重要的临床意义，其表达水平与HCC的病情进展相关。

联合检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3与总胆汁酸及γ-谷氨酰转肽酶在原发性肝癌诊断中的应用

目的探讨联合检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)与总胆汁酸(TBA)及γ-谷氨酰转肽酶(GGT)在原发性肝癌(PHC)诊断中的临床意义。方法收集2010年5月至2011年1月确诊的肝癌患者45例(PHC组),肝硬化患者43例(肝硬化组),正常对照者30例(正常对照组),采用酶联免疫法分别测出GPC3的浓度,采用循环酶法检测TBA,采用速率法检测GGT。结果 (1)PHC组与其他2组比较,GPC3、TBA、GGT的检测值差异有统计学意义(t=29.197、32.481,12.537、14.957,12.383、14.024,P<0.01)。肝硬化组对照组比较,GPC3、TBA、GGT的检测值差异有统计学意义(P<0.01,t=9.7684;10.991;15.799)。(2)PHC组GPC3和TBA阳性率明显高于肝硬化组和正常对照组,差异有统计学意义(P<0.01);GGT阳性率与肝硬化组和正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)。(3)PHC组三者联合检测阳性44例,占97.7%(44/45)。与任何单项比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 GPC3与TBA及GGT联合检测明显提高PHC的阳性检出率,对PHC的早期诊断具有重要的临床意义。

肝细胞癌中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、热休克蛋白和谷氨酰胺合成酶的表达及其临床意义

目的探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、热休克蛋白70(HSP70)和谷氨酰胺合成酶(GS)在肝细胞癌中的表达及临床意义。方法运用组织芯片技术,通过免疫组织化学Envision法检测182例肝细胞癌和92例癌旁肝组织中GPC3、HSP70和GS的表达情况,并结合临床病理因素进行分析。结果 GPC3、HSP70和GS在肝细胞癌中表达均明显高于癌旁肝组织(P<0.05),GPC3表达与肝细胞癌分化程度、脉管内瘤栓、TNM分期与转移显著相关(P<0.05);HSP70和GS表达与肝细胞癌TNM分期、转移和术后复发显著相关(P<0.05)。结论 GPC3、HSP70和GS在肝细胞癌的发生、发展中起着不同程度的作用。联合检测GPC3、HSP70和GS可能有助于判断肝细胞癌的恶性程度、转移潜能及预后分析。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3真核表达载体的构建及在细胞中的表达

构建载体表达人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3,GPC3)蛋白,用以获得抗GPC3单克隆抗体。用PCR技术扩增GPC3基因,利用酶切位点将该序列插入p3XFLAG-CMV-14载体,构建p CMV-gpc3表达载体。通过脂质体将该载体转染至HEK293细胞中,利用Western blot技术检测最终结果。收集稳定表达的细胞,破碎,通过亲和层析柱,获得纯度较高的GPC3蛋白。成功构建p CMV-gpc3真核表达载体,转染至HEK293细胞后,经G418筛选获得稳定表达的单克隆细胞系;Western blot分析结果表明目的蛋白高效表达。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的检测在肝细胞肝癌诊断中的研究进展

肝癌是最常见的癌症之一，在全世界癌症死亡原因中列第三，是中国位居第二的癌症“杀手”，其恶性程度高、病情进展快。根据组织学分类可将肝癌分为胆管细胞型肝癌（ICC）、混合型肝癌、肝细胞肝癌（HCC）三大类。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3与甲胎蛋白异质体在原发性肝癌中的表达及诊断意义

目的探讨甲胎蛋白异质体(AFP-L3)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)联合检测对诊断原发性肝癌(PHC)的意义。方法收集确诊的PHC患者100例(PHC组),肝硬化患者50例(肝硬化组),正常对照50例(对照组)。用酶联免疫法分别测出AFP-L3、GPC3的浓度,用放射免疫法测出AFP的浓度,分别按照检测项目统计分析。结果 PHC组与肝硬化组和对照组比较,GPC3和AFP的检测值差异有统计学意义(P<0.01)。肝硬化组与对照组比较,GPC3、AFP的检测值差异有统计学意义(P<0.01)。PHC组的AFP-L3阳性率明显高于肝硬化组和正常对照组(χ2=65.147、88.043,P<0.01);肝硬化组阳性率与正常对照组差异有统计学意义(χ2=4.432,P<0.05)。PHC组GPC3阳性率明显高于肝硬化组和对照组(χ2=88.500、100.780,P<0.01);肝硬化组阳性率与对照组差异无统计学意义(χ2=2.3437,P>0.05)。AFP-L3、GPC3两者联合检测时,诊断PCH的敏感度为97.0%(97/100),特异度为90.0%(90/100),准确度为93.5%(187/200),优于任何单项检测的敏感度和准确度。结论 AFP-L3和GPC3联合检测优势互补,从而提高PHC诊断的敏感度、特异度和准确度。

融合蛋白人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在原核细胞中的表达

目的构建人类磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican3,GPC3)重组原核表达载体。方法以人类肝脏cDNA文库为模板扩增出GPC3基因产物,与pMD-18 simple T载体进行连接构建出T克隆载体;从T载体上获取基因片段,并对pET-32a(+)空载体进行双酶切,用T4连接酶连接,构建出pET-32a(+)-GPC3原核表达载体;对构建好的载体再次测序,并进行诱导表达。结果 PCR产物长度为837 bp,即扩增的GPC3 C末端长度,与NCBI网站的相比较,序列完全一致,说明pET-32a(+)载体中正确插入了目的片段,并且诱导表达出蛋白。结论成功构建了融合表达Pet-GPC3载体,蛋白诱导表达成功。

射频消融治疗肝细胞癌后血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖3检测及意义

目的检测肝细胞癌(HCC)患者射频消融治疗前后血清中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)的浓度,初步研究其在疗效评价中的临床应用价值。方法采用酶联免疫吸附法检测59例HCC患者、35例肝硬化患者、30例健康对照组血清中GPC3的表达,其中30例HCC患者经射频消融治疗,对治疗前与治疗后1d、5d、30d血清中GPC3的浓度进行比较。结果 HCC患者血清GPC3浓度明显高于肝硬化患者和健康对照组人群,3组间比较差异有统计学意义(P<0.01),HCC患者射频消融治疗后不同时间点GPC3含量较治疗前均有显著下降(P<0.01)。结论血清GPC3含量升高有助于HCC的诊断,特异性较好,与甲胎蛋白表达无显著相关性,射频消融治疗后不同阶段GPC3均有不同程度降低,在疗效评估中有一定临床价值。

高尔基体糖蛋白73、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、甲胎蛋白异质体百分比联合检测在原发性肝癌诊断中的应用

目的探讨高尔基体糖蛋白73(GP-73)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、甲胎蛋白异质体百分比(AFP-L3%)联合检测在原发性肝癌诊断中的应用。方法选择肝癌患者154例(肝癌组),肝硬化患者78例(肝硬化组),健康对照者56例(对照组),用酶联免疫法分别测出GP-73、GPC3、AFP-L3的浓度。然后分别按照检测项目统计分析。结果肝癌组中GP-73、GPC3、AFP-L3%的水平明显高于肝硬化组和对照组(P<0.05);肝癌组中GP-73、GPC3、AFP-L3%的阳性率分别为66.2%、72.1%、53.2%。三项联合检测的阳性率可达到97.9%。高于任何单项和联合检测的敏感度和准确度。肝癌组中GP-73、AFP-L3%在AFP不同水平内比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 GP-73、GPC3、AFP-L3%三者联合检测提高原发性肝癌诊断的敏感度和准确度,对鉴别诊断早期肝癌有参考意义。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3与ki67在不同分化程度肝细胞癌中的表达分析

目的探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)及ki67在不同分化程度的肝细胞癌(HCC)中的表达强度,分析不同分化程度的肝细胞癌组织中GPC3的表达强度与ki67之间的关系。方法搜集2010年7月~2014年7月首都医科大学附属北京佑安医院病理科90例HCC部分肝切除标本。采用免疫组化SP法检测HCC中GPC3及ki67的表达情况,比较不同分化程度的HCC中GPC3及ki67表达的强度,分析不同分化程度HCC中GPC3表达情况与ki67之间的关系。结果低分化HCC中GPC3的阳性率(90.00%)明显高于中分化(83.33%)和高分化(50.00%),且中分化明显高于高分化,差异均有高度统计学意义(P<0.01);GPC3中-强着色度(+++^++++)在低分化HCC中阳性率(66.67%)高于中分化(23.33%)及高分化中(6.67%),且中分化明显高于高分化,差异均有高度统计学意义(P<0.01);低分化HCC中ki67的表达高于中分化和高分化,且中分化高于高分化,差异均有高度统计学意义(P<0.01);不同分化HCC中GPC3的表达与ki67呈正相关(r=0.551,P=0.000)。结论 GPC3、ki67的表达强度与HCC的分化有关;GPC3的表达与肝细胞癌的ki67表达呈正相关。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的原核表达及单克隆抗体制备

人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)是一个肝癌潜在的诊断标志物和治疗靶点。为获得抗GPC3单克隆抗体,用PCR方法克隆GPC3基因,利用酶切位点将该序列插入pGEX-2T载体,构建了pGEX-2T-gpc3表达载体。转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,获得高效表达。经纯化后获得分子量为58 kD的蛋白。以该重组蛋白为免疫原,通过免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和筛选获得1株抗该重组蛋白的单克隆抗体1F3。Western blot分析显示,该抗体具有较好的特性,可用于GPC3蛋白的功能和应用研究。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3和泛素D基因在肝细胞癌中的异常表达及其相互作用

目的利用基因组学和表观遗传组学分析工具,分析磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)和泛素D(UBD)在肝细胞癌(HCC)中的异常表达情况,以及两者对HCC患者预后的影响。方法利用ULCAN(http://ualan.path.uab.edu)和Gene Expression Profiling Interative Analysis(GEPIA)数据库,分析UBD和GPC3在正常肝组织和HCC组织的异常表达情况和甲基化水平,以及对HCC患者生存的影响。利用Gene Cards数据库分析UBD和GPC3的定位。利用STRING数据库对UBD和GPC3分别构建蛋白质互相作用(PPI)网络,并对UBD和GPC3进行基因注释。基于皮尔森相关系数,计算UBD和GPC3在HCC发生发展中的关联。结果UBD和GPC3在HCC组织中表达上调,启动子甲基化水平下降。UBD位于6p22.1,主要表达于细胞核;GPC3位于Xq26.2,主要表达于细胞膜、细胞外基质、内质网、溶酶体和高尔基体。富集分析显示,UBD主要与蛋白酶体活动相关:翻译后蛋白修饰、泛素化和去泛素化;GPC3主要参与黏多糖的生物合成和分解过程,介导的生物通路主要涉及癌症多聚糖、细胞外基质受体相互作用和细胞黏附分子。关联分析显示,UBD和GPC3成线性正相关,共同调控HCC的发生发展。预后分析显示,GPC3对HCC的预后有明显的影响。结论UBD和GPC3在HCC的表达均上调,甲基化水平均降低,GPC3对HCC的预后影响较大,或许可以作为预后评估的生物标志。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3血清学检测及其在原发性肝癌诊断中的应用

原发性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）占肝癌患者总数的90％以上，常常伴随着肝炎、肝硬化等肝脏疾病而误诊，发现HCC时多为晚期。所以需要特异的肿瘤标志物（TM）作为辅助诊断标准，但是由于AFP假阳性比较高，所以研究人员不断寻找更特异，更灵敏的HCC标志物。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican-3，GPC3）是很有前景HCC的TM。但GPC3检测还停留在组织学检测，或者血清学检测应用价值的研究，还没有成熟的可应用于临床诊断的检测试剂盒。

靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的嵌合体抗原受体慢病毒载体构建及病毒包装滴定的实验研究

目的构建靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC3)的慢病毒载体,并进行慢病毒载体的鉴定、包装及病毒滴度测定。方法设计靶向GPC3抗原的嵌合性抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)分子重组基因及特异性引物,用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)对CAR分子重组基因进行体外扩增及PCR反应片段搭桥,双酶切后定向插入到pCDH质粒,构建pCDH-anti-GPC3-CAR慢病毒表达载体,经菌落PCR、DNA凝胶电泳及测序鉴定。将目的质粒与包装质粒共转染293T细胞,收集上清液按不同比例稀释后感染293T细胞,流式细胞术检测anti-GPC3-CAR表达并计算病毒滴度。结果经菌落PCR及测序证实,正确构建重组慢病毒载体pCDH-anti-GPC3-CAR,包装后的病毒滴度为(1.50~3.24)×10^(6)TU/ml。结论本研究成功构建携带不同共刺激分子的pCDH-anti-GPC3-CAR慢病毒表达载体,可在293T细胞中表达并产毒,为后续构建CAR免疫细胞提供技术储备。