磷脂酶Cγ1及NF-κB在结直肠癌细胞与基质黏附中的作用及信号转导机制(英文)

目的研究磷脂酶Cγ1(PLCγ1)及NF κB在结直肠癌细胞与细胞外基质黏附中的作用及其信号转导机制。方法PLC抑制剂U73122用于研究PLCγ1在高转移的人结肠癌细胞LoVo和低转移的SW480细胞中对于细胞基质黏附的影响。吡咯二硫氨基甲酸酯(PDTC)用于研究NF κB在结直肠癌细胞与基质黏附中的作用。PLCγ1在结直肠癌细胞中作用的信号转导机制采用蛋白质印迹及凝胶迁移率变动分析(EMSA)。结果抑制PLCγ1对SW480细胞与基质的黏附无明显影响。但在LoVo细胞中,PLCγ1和NF κB的抑制均可显著降低细胞与基质的黏附(P<0.05)并呈剂量依赖性,且抑制作用可被EGF部分恢复。蛋白质印迹分析显示EGF可刺激PLCγ1的磷酸化。EMSA结果显示,抑制PLCγ1可以抑制EGF刺激的NF κB的激活。结论EGF PLCγ1 NF κB信号通路在高转移的结肠癌细胞与基质的黏附中发挥重要作用。

胰岛素作用对胰岛β细胞磷脂酶Cγ1表达的影响

目的:观察胰岛素对大鼠胰岛β细胞内磷脂酶Cγ1(PLCγ1)表达的影响.方法:大鼠胰岛分离纯化.通过HE染色观察纯化胰岛的形态特征,采用免疫组织化学方法并结合激光扫描共聚焦显微镜和图像分析技术对胰岛β细胞表达不同时间(0,30,60,120,240min)内的PLCγ1进行半定量分析.结果:PLCγ1在胰腺的内外分泌部均有表达.与0min比较,胰岛素作用30,60min时胰岛β细胞表达的PLCγ1荧光强度有明显降低(P<0.05);而在240min时PLCγ1荧光强度与0min比较无明显差别.结论:胰岛素作用60min内可使PLCγ1表达下调;胰岛素-PLCγ1途径参与了胰岛素的信息传递.

磷脂酶Cγ1在大肠癌细胞中的信号转导机制

目的研究磷脂酶Cγ1(PLCγ1)在大肠癌细胞中的信号转导机制。方法采用凝胶迁移率变动分析(EMSA),免疫细胞化学,酶谱分析及RT-PCR等技术,分析了大肠癌细胞LoVo中,PLCγ1在表皮生长因子(EGF)刺激下对相关信号分子核因子-KappaB(NF-κB)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和组织金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP-2)的活性与表达的影响。结果与对照组相比,EGF处理组胞核阳性率显著增高,从26.91%±2.84%升高至40.83%±4.36%,而2.5μmol/LU73122处理组中胞核的阳性率则降低至12.20%±1.89%。同时,EGF刺激前若以2.5μmol/LU73122预处理,胞核阳性的细胞与只用EGF处理组相比也显著减少,从40.83%±4.36%降至18.21%±1.34%。EMSA结果显示,EGF处理细胞后可以增强NF-κB的活性,而U73122则可部分抑制其活性。RT-PCR结果表明,EGF处理细胞后,PLCγ1和NF-κB对于MMP-2与TIMP-2在mRNA水平的表达无显著影响。酶谱分析结果同时表明EGF处理细胞后,PLCγ1和NF-κB对于MMP-2酶原的表达及激活也无显著影响。结论在大肠癌细胞LoVo中,EGF可作为PLCγ1的上游刺激物,NF-κB作为其下游分子参与PLCγ1作用的发挥,而MMP-2、TIMP-2则不参与PLCγ1信号通路。

磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶2过表达抑制磷脂酶Cγ1磷酸化及转位

目的探讨转染磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶2(PEMT2)基因抑制大鼠肝癌CBRH-7919细胞增殖的机制。方法采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot方法,观察转染PEMT2基因对大鼠肝癌CBRH 7919细胞磷脂酶C γ 1(PLC γ 1)磷酸化及在细胞内转位的影响;同时观察转染PEMT2基因对肝细胞生长因子受体(c- Met)自身磷酸化活化的影响。结果转染PEMT2后,质膜结合的PLC γ下降,为对照组的45％。膜结合的磷酸化PLC γ 1约为对照组细胞的27％,同时c-Met磷酸化程度显著下降,约为对照组细胞的32％。结论转染PEMT2基因可抑制细胞PLC γ 1磷酸化及由胞浆向质膜转位,抑制c-Met自身磷酸化活化,从而下调CBRH-7919细胞c-Met／PLC γ 1信号转导途经。

PLCγ1对绵羊早期胚胎超微结构的影响

为了探究绵羊磷脂酶Cγ1(PLCγ1)基因对绵羊早期胚胎发育的影响,从微观角度解释胚胎的内部发育规律。卵母细胞分离培养至成熟,显微注射同等浓度的pcDNA3.1-EGFP-PLCγ1重组质粒后随机分成两组,PLCγ1处理组在注射后培养24 h、48 h;U73122处理组在显微注射后12 h向培养液中添加最优抑制PLCγ1的U73122浓度0.5μmol/L,两组分别在24 h、48 h固定胚胎做超薄切片,电镜观察透明带、脂滴、线粒体及胚胎发育情况。结果表明,显微注射重组质粒后能够促进胚胎发育,并且随着胚胎的发育,透明带呈不规则性疏松,PLCγ1处理组与U73122处理组的不同时间段以及相同时间段之间,透明带厚度均存在极显著差异(P<0.01)。线粒体在胞质内呈均匀分布,PLCγ1处理组线粒体横脊少且形状规则,成熟的线粒体含量较多;U73122处理组线粒体嵴深且长,出现空泡化异常形态,线粒体异常率(31.72%±3.316%)极显著高于PLCγ1处理组(22.01%±6.652%)。脂滴随机分布于各卵裂球中,U73122处理组脂滴形态出现异常,数量多于PLCγ1处理组。以上结果初步证明,绵羊早期胚胎发育过程中,PLCγ1基因可通过影响透明带厚度、线粒体及脂滴等改变细胞代谢水平从而调整胚胎发育。

黄连素通过抑制PLCγ1活性阻止肝癌细胞的侵袭

目的:研究黄连素(Berberine,BBR)对人肝癌细胞侵袭的阻止作用,并探讨其机制是否与抑制PLCγ1有关。方法:人肝癌SMMC-7721消化接种于用Matrigel胶包被的Transwell小室,在不同浓度的黄连素及JX401(p38抑制剂)、U0126(Erk抑制剂)、SU5416(VEGF抑制剂)作用24 h后,结晶紫染色并计数Transwell下室的细胞数;用Western-blot法检测不同浓度黄连素作用下p-PLCγ1的表达。结果:BBR对肝癌细胞SMMC-7721的侵袭有明显阻止作用,与SU5416(VEGF抑制剂)作用类似。Westernblot结果显示黄连素抑制了SMMC-7721的p-PLCγ1表达。结论:黄连素具有阻止肝癌细胞侵袭的作用,其机制可能与抑制肿瘤侵袭相关信号VEGF/PLCγ1的活性有关。

稳定表达PLCγ1 siRNA慢病毒的构建及对人大肠癌细胞凋亡的影响

目的制备在人大肠癌系LoVo中稳定抑制磷脂酶C(PLC)γ1的重组慢病毒,建立PLCγ1表达降低的细胞系,以便客观研究该基因的作用。方法制备产生PLCγ1siRNA分子的重组慢病毒,在慢病毒感染LoVo细胞后以杀稻瘟菌素筛选稳定表达细胞系。应用Western-blot和RT-PCR对细胞中PLCγ1的蛋白和mRNA表达水平进行分析。应用流式细胞仪分析PLCγ1siRNA对细胞凋亡的影响。结果和结论PLCγ1siRNA显著下调了LoVo细胞中PLCγ1的表达,所构建的重组慢病毒导入的siRNA有较高的沉默效率,显著增加了5-FU诱导的凋亡。

PLCγ1在小鼠卵母细胞减数分裂恢复中的作用

目的探究磷脂酶(PLC)Cγ1在卵母细胞减数分裂恢复中的作用及机制,进一步阐明卵母细胞成熟的分子机理,为与相关的人体临床应用提供理论基础。方法利用Real-time PCR检测PLC不同亚型在颗粒细胞与卵丘细胞中的表达情况,构建体外卵泡培养模型及COC培养模型研究PLCγ1特异抑制剂U73122对LH及EGF诱导的减数分裂恢复的影响,利用钙离子荧光探针Fluo 3-AM检测胞内钙离子水平变化,酶联免疫法检测胞内cGMP水平变化,利用Real-time PCR、Western blot以及免疫组化检测不同亚型1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP 3R)的表达变化情况。结果研究表明,颗粒细胞与卵丘细胞中Plcγ1 mRNA的表达均显著高于其它亚型(P<0.05),U73122能够有效抑制LH和EGF诱导的卵母细胞减数分裂恢复(P<0.05)以及EGF诱导的卵丘细胞内钙离子水平升高(P<0.05),U73122还显著逆转了EGF介导的胞内cGMP水平下降(P<0.05),此外,研究还发现在颗粒细胞,卵丘细胞与卵母细胞中Itpr1 mRNA的表达量显著高于其它亚型(P<0.05),Western blot与免疫组化的结果也表明IP 3R1在三种细胞中均有表达。结论LH-EGFR信号通过PLCγ1-IP 3R1升高胞内钙离子水平诱导卵母细胞减数分裂恢复。

软骨细胞迁徙能力与自体细胞软骨移植中整合的相关性

背景:在关节外科中常用自体细胞软骨移植技术修复软骨缺损,整合不良是导致修复失败的原因之一。软骨细胞迁徙能力被证明和整合有相关性,某些通路如Src-磷酸化磷脂酶Cγ1-细胞外调节蛋白激酶1/2已经被证实和软骨细胞的迁徙能力相关,但是否和整合相关还是个未知数。目的:阐明软骨细胞迁徙通路在自体细胞软骨移植中和整合之间的相关性。方法:将来源于猪膝关节的软骨细胞分成4组,为Src、磷酸化磷脂酶Cγ1、细胞外调节蛋白激酶1/2抑制组以及正常组,通过博伊登小室来量化4组软骨细胞的迁徙能力。将处理后的软骨细胞与软骨环建立共培养模型培养28 d后,进行组织学、生物化学、生物力学、免疫蛋白印迹以及细胞示踪等分析来观察正常组与抑制组之间的差异。结果与结论:当用抑制剂处理软骨细胞后,软骨细胞的迁徙能力明显下降。在软骨细胞软骨环共培养28 d后,免疫印迹蛋白分析表明通路抑制剂一直存在于整个培养周期中。同时正常组迁徙到整合区域中的软骨细胞数量和距离以及分泌的胶原、基质和力学强度明显高于其他3个抑制组。说明可以通过Src-磷酸化磷脂酶Cγ1-细胞外调节蛋白激酶1/2通路调节软骨细胞的迁徙能力从而影响软骨的整合能力。

表皮生长因子介导成胶质瘤细胞NF-κB核转位的机制初探

目的研究表皮生长因子（EGF）调节成胶质细胞瘤细胞内核因子-κB（NF-κB）核转位的可能机制。方法电泳迁移率改变分析法（EMSA）检测激活和抑制磷脂酶C-γ1（PLCγ1）后，成胶质细胞瘤U-87MG中NF-κB的核转位水平，随后采用免疫印迹法（WesternBlot）检测蛋白激酶C-α（PKCα）的表达水平，继而检测激活和抑制PKCα后NF-κB的核转位水平。结果NF-κB核转位水平在EGF刺激60min时达最大值，而经PLCγ1特异性抑制剂U-73122提前处理后，刺激后同期却无明显改变；在PKC特异性激动剂佛波酯（PMA）刺激后60minNF-κB核转位水平达高峰，而提前使用PKCα特异性抑制剂Ro 31-8220处理细胞可有效逆转此改变。结论EGF可能通过PLCγ1-PKCα信号通路介导NF-κB向核内转位，从而调控相关侵袭和转移基因的转录。